CN111593098A - 一种qpcr实时荧光数据定量分析的方法 - Google Patents

一种qpcr实时荧光数据定量分析的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111593098A
CN111593098A CN202010477642.6A CN202010477642A CN111593098A CN 111593098 A CN111593098 A CN 111593098A CN 202010477642 A CN202010477642 A CN 202010477642A CN 111593098 A CN111593098 A CN 111593098A
Authority
CN
China
Prior art keywords
curve
sample
point
value
baseline
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010477642.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111593098B (zh
Inventor
王寄竹
石瑞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Hanchen Guangyi Bioengineering Co ltd
Chengdu Hanchen Guangyi Technology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Hanchen Guangyi Bioengineering Co ltd
Chengdu Hanchen Guangyi Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Hanchen Guangyi Bioengineering Co ltd, Chengdu Hanchen Guangyi Technology Co ltd filed Critical Chengdu Hanchen Guangyi Bioengineering Co ltd
Priority to CN202010477642.6A priority Critical patent/CN111593098B/zh
Publication of CN111593098A publication Critical patent/CN111593098A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111593098B publication Critical patent/CN111593098B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开了一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，涉及PCR反应领域，包括S1、采集每个样品在PCR反应过程中多个循环的荧光数据，得到每个样品的循环数—荧光亮度值的曲线A；S2、处理S1中的所有荧光数据，使每个样品的曲线A变得平滑得到曲线B；S3、获取每个样品的曲线B的基线并进行基线校准；S4、根据校准后的基线得到每个样品的Ct值；该方法从数据层面入手，通过一系列算法步骤，明显消除反应、加温、信号采集等对原始数据的影响，从而完成最终的分析，计算出待测样品的Ct值和浓度，定量分析的结果准确度。

Description

一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法
技术领域
本发明涉及PCR反应领域，尤其涉及一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法。
背景技术
QPCR实时荧光数据，通过各种类型传感器捕获后，需要对数据进行一系列分析以确定待测样本的浓度。实际中，由于PCR反应本身、温度控制、采集过程等各方面的误差，会导致最终采集结果出现不同程度偏移，使S曲线的形状变得不规则，定量分析的结果Ct值准确度受到影响。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题设计了一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，包括以下步骤：
S1、采集每个样品在PCR反应过程中多个循环的荧光数据，得到每个样品的循环数—荧光亮度值的曲线A；
S2、处理S1中的所有荧光数据，使每个样品的曲线A变得平滑得到曲线B；
S3、获取每个样品的曲线B的基线并进行基线校准；
S4、根据校准后的基线得到每个样品的Ct值。
进一步地，在S2中包括：
S21、确定平滑窗口，平滑窗口为3或5；
S22、第一个循环开始取滑动窗口数量的点数，使用平均值代替对应的采集值，使得每个样品的曲线A变成平滑的曲线B。
进一步地，在S3中包括：
S31、对每个样品的曲线B中的数据连续两点做差分,标记差分值最大的点m；
S32、从m点往前计算该点和前一的差值；
S33、若差值大于0.1则m点往前移动，直到第一个点；
S34、停止后的点为m为基线终点，标识第一个循环到第m个循环为曲线B的基线期；
S35、取第1个点到第m个点为基线数据集做线性拟合,计算出基线解析式y＝ax+b
S36、曲线B上每一个点纵坐标减去对应校准后基线的纵坐标求得deltaRn。
进一步地，在S4中包括：
S41、取每条线校准荧光值deltaRn和对应循环数作为曲线新的坐标对,计算基线期所有点的10倍标准差作为阈值；
S42、取所有样品的阈值的最小值作为自动阈值；
S43、根据自动阈值与每个样品校准后的基线计算Ct值。
本发明的有益效果在于：本发明实现了一种QPCR数据处理方法，该方法从数据层面入手，通过一系列算法步骤，明显消除反应、加温、信号采集等对原始数据的影响，从而完成最终的分析，计算出待测样品的Ct值和浓度，定量分析的结果准确度。
附图说明
图1是本发明一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法中曲线A的曲线图；
图2是本发明一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法中基线校准后的曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，或者是本领域技术人员惯常理解的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，“设置”、“连接”等术语应做广义理解，例如，“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接连接，也可以通过中间媒介间接连接，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。
一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，包括以下步骤：
S1、采集每个样品在PCR反应过程中多个循环的荧光数据，得到每个样品的循环数—荧光亮度值的曲线A，人，如图1所示。
S2、处理S1中的所有荧光数据，使每个样品的曲线A变得平滑得到曲线B；
S21、确定平滑窗口，平滑窗口为3或5；
S22、第一个循环开始取滑动窗口数量的点数，使用平均值代替对应的采集值，使得每个样品的曲线A变成平滑的曲线B。
S3、获取每个样品的曲线B的基线并进行基线校准，极限校准后的曲线如图2所示；
S31、对每个样品的曲线B中的数据连续两点做差分,标记差分值最大的点m；
S32、从m点往前计算该点和前一的差值；
S33、若差值大于0.1则m点往前移动，直到第一个点；
S34、停止后的点为m为基线终点，标识第一个循环到第m个循环为曲线B的基线期；
S35、取第1个点到第m个点为基线数据集做线性拟合,计算出基线解析式y＝ax+b
S36、曲线B上每一个点纵坐标减去对应校准后基线的纵坐标求得deltaRn。
S4、根据校准后的基线得到每个样品的Ct值。
S41、取每条线校准荧光值deltaRn和对应循环数作为曲线新的坐标对,计算基线期所有点的10倍标准差作为阈值；
S42、取所有样品的阈值的最小值作为自动阈值；
S43、根据自动阈值与每个样品校准后的基线计算Ct值。
样品一 样品二 样品三 样品四 样品五 样品六
Ct值 17.54 21.20 25.36 28.73 32.26 36.94
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采集每个样品在PCR反应过程中多个循环的荧光数据，得到每个样品的循环数—荧光亮度值的曲线A；
S2、处理S1中的所有荧光数据，使每个样品的曲线A变得平滑得到曲线B；
S3、获取每个样品的曲线B的基线并进行基线校准；
S4、根据校准后的基线得到每个样品的Ct值。
2.根据权利要求1所述的一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，其特征在于，在S2中包括：
S21、确定平滑窗口，平滑窗口为3或5；
S22、第一个循环开始取滑动窗口数量的点数，使用平均值代替对应的采集值，使得每个样品的曲线A变成平滑的曲线B。
3.根据权利要求2所述的一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，其特征在于，在S3中包括：
S31、对每个样品的曲线B中的数据连续两点做差分,标记差分值最大的点m；
S32、从m点往前计算该点和前一的差值；
S33、若差值大于0.1则m点往前移动，直到第一个点；
S34、停止后的点为m为基线终点，标识第一个循环到第m个循环为曲线B的基线期；
S35、取第1个点到第m个点为基线数据集做线性拟合,计算出基线解析式y＝ax+b
S36、曲线B上每一个点纵坐标减去对应校准后基线的纵坐标求得deltaRn。
4.根据权利要求2所述的一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，其特征在于，在S4中包括：
S41、取每条线校准荧光值deltaRn和对应循环数作为曲线新的坐标对,计算基线期所有点的10倍标准差作为阈值；
S42、取所有样品的阈值的最小值作为自动阈值；
S43、根据自动阈值与每个样品校准后的基线计算Ct值。
CN202010477642.6A 2020-05-29 2020-05-29 一种qpcr实时荧光数据定量分析的方法 Active CN111593098B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010477642.6A CN111593098B (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种qpcr实时荧光数据定量分析的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010477642.6A CN111593098B (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种qpcr实时荧光数据定量分析的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111593098A true CN111593098A (zh) 2020-08-28
CN111593098B CN111593098B (zh) 2021-09-21

Family

ID=72181902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010477642.6A Active CN111593098B (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种qpcr实时荧光数据定量分析的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111593098B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112331266A (zh) * 2020-11-20 2021-02-05 安图实验仪器(郑州)有限公司 消除pcr荧光基线期波动的方法
CN113851189A (zh) * 2021-09-24 2021-12-28 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种自适应检测pcr荧光基线的方法、装置及其设备
TWI787784B (zh) * 2021-04-14 2022-12-21 台達電子工業股份有限公司 即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)系統的光學校正工具及其製備方法、以及qPCR系統的校正方法
CN115985396A (zh) * 2022-12-16 2023-04-18 苏州思迈德生物科技有限公司 一种实时荧光定量pcr扩增数据的分析处理方法及装置

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080154512A1 (en) * 2006-07-01 2008-06-26 Harrison Leong Systems and methods for baselining and real-time pcr data analysis
US20090222503A1 (en) * 2005-09-20 2009-09-03 Robert Andrew Palais Melting Curve Analysis with Exponential Background Subtraction
US20120072120A1 (en) * 2002-02-07 2012-03-22 Life Technologies Corporation Automatic threshold setting and baseline determination for real-time pcr
CN103006204A (zh) * 2012-12-29 2013-04-03 重庆康如来科技有限公司 一种心电信号基线校准方法及装置
US20130189702A1 (en) * 2010-04-21 2013-07-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Curve Processor Algorithm for the Quality Control of (RT-) qPCR Curves
US20130273547A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-17 Samsung Techwin Co., Ltd. Method to determine and correct baseline and to characterize pcr amplification kinetics
CN104662174A (zh) * 2012-10-02 2015-05-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 测定实时pcr循环阈值的通用方法
CN105755159A (zh) * 2016-05-13 2016-07-13 苏州国科闻普生物科技有限公司 自动快速判别荧光定量pcr结果的方法
CN106645708A (zh) * 2016-09-20 2017-05-10 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种基于荧光免疫层析技术的定量检测计算方法
CN110619927A (zh) * 2019-03-27 2019-12-27 北京中科生仪科技有限公司 一种实时荧光定量pcr的数据分析方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120072120A1 (en) * 2002-02-07 2012-03-22 Life Technologies Corporation Automatic threshold setting and baseline determination for real-time pcr
US20090222503A1 (en) * 2005-09-20 2009-09-03 Robert Andrew Palais Melting Curve Analysis with Exponential Background Subtraction
US20080154512A1 (en) * 2006-07-01 2008-06-26 Harrison Leong Systems and methods for baselining and real-time pcr data analysis
US20130189702A1 (en) * 2010-04-21 2013-07-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Curve Processor Algorithm for the Quality Control of (RT-) qPCR Curves
US20130273547A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-17 Samsung Techwin Co., Ltd. Method to determine and correct baseline and to characterize pcr amplification kinetics
CN104662174A (zh) * 2012-10-02 2015-05-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 测定实时pcr循环阈值的通用方法
US20190095576A1 (en) * 2012-10-02 2019-03-28 Roche Molecular Systems, Inc. Universal method to determine real-time pcr cycle threshold values
CN103006204A (zh) * 2012-12-29 2013-04-03 重庆康如来科技有限公司 一种心电信号基线校准方法及装置
CN105755159A (zh) * 2016-05-13 2016-07-13 苏州国科闻普生物科技有限公司 自动快速判别荧光定量pcr结果的方法
CN106645708A (zh) * 2016-09-20 2017-05-10 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种基于荧光免疫层析技术的定量检测计算方法
CN110619927A (zh) * 2019-03-27 2019-12-27 北京中科生仪科技有限公司 一种实时荧光定量pcr的数据分析方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOCHEN WILHELM: "SoFAR: Software for Fully Automatic Evaluation of Real-Time PCR Data", 《BIOTECHNIQUES》 *
JOSHUA S YUAN ET AL.: "Statistical analysis of real-time PCR data", 《BMC BIOINFORMATICS》 *
冯文权等: "《经济预测与决策技术 第6版》", 31 January 2018 *
李伟等: "《分子诊断学》", 30 September 2015 *
陈尚飞: "利于计算曲线点串的差分算法", 《广西民族大学学报(自然科学版)》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112331266A (zh) * 2020-11-20 2021-02-05 安图实验仪器(郑州)有限公司 消除pcr荧光基线期波动的方法
TWI787784B (zh) * 2021-04-14 2022-12-21 台達電子工業股份有限公司 即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)系統的光學校正工具及其製備方法、以及qPCR系統的校正方法
CN113851189A (zh) * 2021-09-24 2021-12-28 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种自适应检测pcr荧光基线的方法、装置及其设备
CN113851189B (zh) * 2021-09-24 2022-09-23 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种自适应检测pcr荧光基线的方法、装置及其设备
CN115985396A (zh) * 2022-12-16 2023-04-18 苏州思迈德生物科技有限公司 一种实时荧光定量pcr扩增数据的分析处理方法及装置
CN115985396B (zh) * 2022-12-16 2023-12-12 苏州思迈德生物科技有限公司 一种实时荧光定量pcr扩增数据的分析处理方法及装置

Also Published As

Publication number Publication date
CN111593098B (zh) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111593098B (zh) 一种qpcr实时荧光数据定量分析的方法
US7228237B2 (en) Automatic threshold setting and baseline determination for real-time PCR
JP6129485B2 (ja) 情報システムを用いて反応を解析する方法およびシステム
CN110619927B (zh) 一种实时荧光定量pcr的数据分析方法
US20190162665A1 (en) Analysis method and system for analyzing a nucleic acid amplification reaction
CN106096330A (zh) 一种无创产前生物信息检测分析方法
US7647187B2 (en) Identifying statistically linear data
EP2002013A2 (en) Assessment of reaction kinetics compatibility between polymerase chain reactions
CN112331266A (zh) 消除pcr荧光基线期波动的方法
CN103760159B (zh) 一种细菌鉴定和药敏分析的方法与系统
CN110129419B (zh) 拷贝数变异的检测方法
CN107723343B (zh) 一种基因定量分析的方法
CN108109675B (zh) 一种实验室质量控制数据管理系统
CN110632247A (zh) 一种多维滴定分析的数据处理方法及其应用
EP3266880A1 (en) Method for real-time quantification of nucleic acid
EP1997050B1 (en) Methods for resolving convoluted peaks in a chromatogram
Noskievičová et al. Design of methodology for application of statistical control on short run processes in metallurgy
US20210395809A1 (en) Method for detecting an amplification phase in an amplification
CN110358675A (zh) 一种dna检测pcr荧光分析系统
CN115964618A (zh) 一种荧光定量检测的方法、装置、设备和可读存储介质
CN105975760A (zh) 一种新的医疗实验室检测系统分析测量范围评价方法
CN117571949A (zh) 一种水污染监测与预警系统
Yao A Novel Foliar Color Model for Nitrogen Deficiency Diagnosis of Rubber Trees

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant