CN106096330A - 一种无创产前生物信息检测分析方法 - Google Patents

一种无创产前生物信息检测分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学检测领域，具体公开了一种无创产前生物信息检测分析方法。为了提高对不同数量待测样本分析的准确性，本发明根据不同的待测样本数量选择不同的检测分析方法，利用待测样本所获得的参数和正常参考集所获得的参数采取不同的分析策略，更大程度上提升分析的准确度。本发明采用稳健回归和CV回归很好的解决了现有技术使用整条染色体方法矫正的过程中，使用最小二乘法回归，异常数据讲对斜率产生较大的影响，造成回归的结果不太准确的问题，保证了样本分析的稳健性和准确性。本发明原创了一套利用ZZ值判定性染色体的异常的分析方法；使用ZZ值法进行染色体异常的判定，更符合相关的统计学判定标准，并且结果会更加准确，增加了判定性染色体异常的方法的可靠性。

Description

一种无创产前生物信息检测分析方法
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体涉及一种无创产前生物信息检测分析方法。
背景技术
1997年，Lo等首次在母体血循环中发现游离胎儿DNA(cfDNA)，理论上说明可以通过检测胎儿cfDNA来检测胎儿是否患有疾病。通过cfDNA来检测胎儿是否患有疾病的第一个成熟应用就是无创胎儿非整倍体检测。目前来看，染色体非整倍体检测主要包括21-三体综合征(Down综合征，)，18-三体综合征(Edward综合征)，13-三体综合征(Patau综合征)，特纳综合征(Turner综合征)，克氏综合征(Klinefelter综合征)，超雌综合征(XXX综合征)，超雄综合征(XYY综合征)，其中21-三体综合征发生率约为1/(600～800)，18-三体综合征发生率约为1/4000，13-三体综合征发生率约为1/2000。以上的这些染色体病，由于终生无法治愈，给家庭带来沉重的精神和经济负担。
传统的胎儿染色体非整倍体病变检测方法主要由以下几种：1.唐氏筛查，2.通过侵入性的方式获得胎儿组织，比如羊膜穿刺、绒毛活检、脐静脉穿刺后，进行FISH分析或者染色体核型分析。唐氏筛查假阳性率和假阴性率很高，侵入式方式虽然精确度高，但容易引起胎儿的流产，孕妇的出血或者感染等。而使用高通量测序的方法，仅仅需要抽取孕妇5ml血液，用于胎儿无创非整倍体检测，精确度可达到99.8％，假阴性率极低，是以后主要的发展方向。
2013年，Dengsheng Liang等发表在prenatal dangosis上，使用了全局染色体矫正的方法，而不是使用的Rossa W.K.Chiu等发表的Bin矫正的方法，全局染色体矫正的方法的优点在于数据分析速度要大大快于Bin矫正的方法，而且具有和Bin矫正方法相当的分析精度。
CN103525939A公开了无创检测胎儿染色体非整倍体的方法和系统，通过消除染色体内和染色体间测序GC偏好性的影响，构建正常男胎中X、Y染色体的Z值之间的关系模型，建立X染色体的Z值理论值与实际值差异的判定阈值，实现了胎儿染色体非整倍体，特别是性染色体非整倍体的检测。
然而，上述检测方法也有着自身的局限性，bin方法在分析的过程中速度过慢，使用整条染色体方法矫正的过程中，如果使用最小二乘法回归，异常数据讲对斜率产生较大的影响，造成回归的结果不太准确。判断性染色体的R区间法，不太符合统计学的判定方法，可能会产生不太精确的结果。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种无创产前生物信息检测分析方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种无创产前生物信息检测分析方法。为了提高对不同数量待测样本分析的准确性，根据不同的待测样本数量选择下述(1)～(3)之一的分析方法：
(1)当待测样本数≤10时：
S1、构建正常参考集并计算Slope、GC均值、矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD；
S2、计算每个待测样本每条染色体的NCR值和GC含量值，利用正常参考集计算得到的对应染色体的Slope和GC均值，根据公式1计算出待测样本每条染色体的矫正后的NCR；
S3、利用正常参考集计算得到的矫正后的NCR均值、矫正后的NCR的SD和S2计算得到的每条染色体矫正后的NCR，通过公式2计算每个样本的常染色体的Z值和性染色体Z值，随后根据X、Y染色体的Z值来计算ZZ值；
公式1：
其中NCRcorrected代表某条染色体矫正后的NCR，NCR代表矫正前某条染色体的NCR值，G Ccontent代表某条染色体的GC含量，μGCcontent代表GC均值(GC含量在参考集中的均值或者在当批次中的均值)。
公式2：
其中NCRcorrected代表矫正后的NCR，为矫正后的NCR均值，为矫正后的NCR的SD；
ZZ值计算方法：
其中chrXZscorecorrected为X染色体矫正后的chrX的Z值，为矫正后chrX的Z值的均值，为矫正后的chrX的Z值的SD。
(2)当10＜待测样本数≤30时：
S1、构建正常参考集并计算矫正后的NCR的SD；
S2、计算每个待测样本每条染色体的NCR值和GC含量值；
采用待测样本构建待测参考集，计算其Slope、GC均值和矫正后的NCR均值，并根据公式1计算出待测样本每条染色体的矫正后的NCR；
S3、利用正常参考集计算得到的矫正后的NCR的SD、待测参考集计算得到的矫正后的NCR均值和S2计算得到的每条染色体矫正后的NCR，通过公式2计算每个样本的常染色体的Z值和性染色体Z值，随后根据X、Y染色体的Z值来计算ZZ值；
(3)当待测样本数＞30时：
S1、采用待测样本构建待测参考集，并计算Slope、GC均值和矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD；
S2、计算每个待测样本每条染色体的NCR值和GC含量值；利用待测参考集计算得到的Slope和GC均值，根据公式1计算出待测样本每条染色体的矫正后的NCR；
S3、利用待测参考集计算得到的矫正后的NCR均值、矫正后的NCR的SD和S2计算得到的每条染色体矫正后的NCR，通过公式2计算每个样本的常染色体的Z值和性染色体Z值，随后根据X、Y染色体的Z值来计算ZZ值。
进一步地，正常参考集或待测参考集计算Slope、GC均值、矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD的方法如下：
1)将样本上机测序，过滤掉低质量和空接头的reads，保留符合质控标准的reads；
2)将符合质控标准的reads与人类基因组标准序列hg19进行比对，统计比对上hg19的reads坐标位置，计算每条染色体的Mapped reads(比对上的reads数)、Uniq Mappedreads(完美比对无重复的reads数)参数，同时计算每条染色体Uniq Mapped reads相对应的GC含量；
3)将reads数据均一化得到NCR值；
4)针对每条常染色体，根据其GC含量和NCR值使用稳健回归的方法和CV回归的方法进行矫正，得到回归的Slope与GC均值，然后分别针对每一条常染色体分别得到矫正后的NCR值；针对每一条染色体矫正后NCR的样本集，得到矫正后的NCR均值和NCR的SD；
针对性染色体只保留女性样本，针对女性样本的筛选标准是Y染色体NCR值小于0.02；然后分别根据X染色体和Y染色体的GC含量和NCR值使用稳健回归的方法和CV回归的方法进行矫正，得到回归的Slope与GC均值，继而计算得到X染色体和Y染色体Slope，GC均值，根据公式计算X、Y染色体矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD。
本发明使用稳健回归的方法和CV回归的方法进行矫正，第一步回归使用的是稳健回归方式，可以排除大量异常样本对回归直线的影响，使得第一次回归就能达到很好的效果，并且稳定性比最小二乘法回归方法提高了很多。然后去除|Z值|>3的样本，第二步回归使用的CV回归方式，可以将批次内的CV值降低到最低。能够在线性回归不好的情况下，显著降低SD的值，使检测出的Z值更灵敏。
这里的稳健回归包括最小中位值法(Least Median of Squares)，迭代重加权最小二乘法(iterated re-weighted least squares)，分位数回归(Quantile regression)等稳健回归方法。
这里的最小CV法回归公式(Least coefficient of variation)为：
其中N代表样本个数，x，y为坐标点，a，b为斜率和截距。
在这里x代表NCR，y代表GC含量，a为求出的Slope。
进一步地，构建正常参考集的样本和待测样本来自孕周10周以上的孕妇外周血血浆。
作为优选，构建正常参考集的样本数量不少于100个。
第二方面，本发明提供可所述方法在无创检测分析胎儿染色体方面的应用。
具体而言，提供了一种无创检测胎儿染色体非整倍体的方法，包括以下步骤：
(1)按照前述分析方法得到相应数据；
(2)常染色体判定：
|Z值|<＝3为正常，Z值>3为三倍体；Z值<-3为单倍体；
(3)性染色体判定：
Y染色体的NCR值<0.021判定为疑似女性，Y染色体的NCR值>＝0.021判定为疑似男性；
chrX Z值>3且chY Z值<7，为超雌综合征(47，XXX)；
chrX Z值<‐3且chrY Z值<7，为特纳综合征(45，X)；
ZZ值>3且chrY Z值>7且chrX Z值<‐3，为超雄综合征(47，XYY)；
ZZ值>3且|chrY Z值|>7且|chrX Z值|<3，克氏综合征(47，XXY)；
|chrY Z值|<＝7且|chrX值|<＝3为正常女性；
|chrY Z值|>7且|chrZZ值|<＝3为正常男性。
本发明至少具有下列优点及有益效果：
(1)本发明根据实际生产过程中的数据挖掘，不同的样本数采取不同的分析策略；能更大程度上提升分析的准确度；
(2)本发明采用稳健回归和CV回归很好的解决了现有技术使用整条染色体方法矫正的过程中，使用最小二乘法回归，异常数据讲对斜率产生较大的影响，造成回归的结果不太准确的问题，保证了样本分析的稳健性和准确性；
(3)本发明原创了一套利用ZZ值判定性染色体的异常的分析方法；使用ZZ值法进行染色体异常的判定，更符合相关的统计学判定标准，并且结果会更加准确，增加了判定性染色体异常的方法的可靠性；
综上，本发明对全局染色体方法进行了模型的优化，并且提出了新的检测方法，对于非整倍体能够更好的进行检出。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
需要说明的是，实施例中只列出了相对重要的染色体，其他未列出的染色体同理。
实施例1正常参考集的构建
1、样本的选择
选取150名孕周大于10周且核型分析无染色体的孕妇，抽取其外周血按照高通量的方法进行基因组重测序。
2、数据的过滤
下机数据进行质控处理，将下机的36SE的reads进行reads过滤，去除掉空接头的reads，含N的reads以及低质量的reads，保留剩余的reads。
3、reads数比对定位序列位置
将过滤后的reads用短序列比对工具进行比对，保留无重复比对和唯一比对上的reads。
4、统计比对位置和GC含量
计算每个样本每条染色体的Uniq Mapped reads和GC含量，计算此样本总的UniqMapped reads以及总的GC含量，计算冗余度。
5、均一化每个样本每条染色体的reads为一个比值(NCR)。
6、使用回归模型对150个样本进行回归，计算参考集整体的每一个常染色体的Slope，GC均值，矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD。
7、针对性染色体，挑出chr Y的NCR≤0.02的样本，计算性染色体的Slope，GC均值，矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD。
8、根据以上参数使用公式计算每一个样本每条染色体的Z值。
9、根据chr X的Z值和chr Y的Z值使用回归模型，计算出chrX Z值的均值，chrX Z值的SD，chrY Z值的均值，以及Slope。
10、使用样本的chrX Z值和chrY Z值并且使用9中计算结果代入公式的计算样本的ZZ值。
实施例2待测样本数(同一批次)≤10时的检测
本实施例以待测样本数＝5为例，用于说明本发明所述检测分析方法。
样本来自与社会募集和四川某医院，结果经过经过国家批准某proton平台平行验证。部分样本还进过了出生后随访胎儿进行确认。
1、抽取5名待测孕妇的外周血进行血浆分离、血浆游离DNA提取、建库测序。
2、通过比对、过滤、统计及均一化，下表列出了5个血样均一化后的结果：
3、使用正常参考集的计算出的参数对以上NCR进行矫正优化：
样本编号 chr13(％) chr18(％) chr21(％) chrX(％) chrY(％)
A1500036 3.428 2.872 1.393 5.103 0.042
A1500066 3.429 2.881 1.301 5.255 0.028
A1500067 3.449 2.867 1.319 5.109 0.038
A1500069 3.424 2.868 1.318 5.324 0.018
A1500071 3.427 2.885 1.306 5.093 0.042
4、计算待测样本的Z值：
样本编号 Chr13Z值 Chr18Z值 Chr21Z值 Chr23Z值 Chr24Z值
A1500036 -0.809 0.447 11.346 -6.754 26.679
A1500066 -0.695 1.246 -1.706 -2.322 11.543
A1500067 0.485 -0.009 0.821 -6.590 22.870
A1500069 -1.051 0.110 0.778 -0.320 1.202
A1500071 -0.863 1.592 -1.022 -7.072 26.755
5、计算样本的ZZ值：
样本编号 ZZ值
A1500036 0.175
A1500066 -1.923
A1500067 -2.014
A1500069 -2.459
A1500071 -1.728
6、根据Z值和ZZ值判断结果
样本A1500036染色体|chr13 Z值|＜＝3、|chr18 Z值|＜＝3，|chr21 Z值|＞3，可判断21号染色体加倍。|chrY Z值|＜＝7且|ZZ值|＜＝3，为正常男性。
样本A1500066三大常染色体绝对值均小于3，提示三大常染色体正常。|chrY Z值|＜＝7且|ZZ值|＜＝3，为正常男性。
样本A1500067三大常染色体绝对值均小于3，提示三大常染色体正常。|chrY Z值|＜＝7且|ZZ值|＜＝3，为正常男性。
样本A1500069三大常染色体绝对值均小于3，提示三大常染色体正常。|chrY Z值|＜＝7且|chrX值|＜＝3为正常女性。
样本A1500071三大常染色体绝对值均小于3，提示三大常染色体正常。|chrY Z值|＜＝7且|ZZ值|＜＝3，为正常男性。
样本编号 Chr13 Z值 Chr18 Z值 Chr21 Z值 Chr23 Z值 Chr24 Z值 ZZ值 性别 结果
A1500036 -0.809 0.447 11.346 -6.754 26.679 0.175 男性 T21
A1500066 -0.695 1.246 -1.706 -2.322 11.543 -1.923 男性 正常
A1500067 0.485 -0.009 0.821 -6.59 22.87 -2.014 男性 正常
A1500069 -1.051 0.11 0.778 -0.32 1.202 -2.459 女性 正常
A1500071 -0.863 1.592 -1.022 -7.072 26.755 -1.728 男性 正常
实施例30＜待测样本数(同一批次)≤30时的检测
本实施例以待测样本数＝26为例，用于说明本发明所述检测分析方法。
1、同时抽取26名待测孕妇的外周血进行血浆分离、血浆游离DNA提取、建库测序。
2、通过比对、过滤、统计及均一化，下表列出了26个血样均一化后的结果：
3、计算待测样本的矫正后的NCR均值，矫正后的NCR的SD，Slope和GC均值：
4、使用待测参考集的计算出的参数对以上NCR进行矫正优化。
样本编号 chr13(％) chr18(％) chr21(％) chr23(％) chr24(％)
A1600136 3.443 2.857 1.314 5.336 0.017
A1500026 3.434 2.865 1.307 5.105 0.038
A1600151 3.410 2.850 1.310 5.146 0.029
A1500041 3.456 2.870 1.305 5.014 0.053
A1600035 3.426 2.854 1.311 5.290 0.016
A1600073 3.431 2.865 1.307 5.290 0.016
A1600117 3.426 2.851 1.306 5.082 0.037
A160120PI 3.593 3.059 1.432 4.111 0.120
A1600029 3.437 2.871 1.322 5.194 0.033
A1500017 3.449 2.870 1.316 5.356 0.014
A1600090 3.411 2.840 1.321 5.057 0.038
A1600244 3.438 2.886 1.315 5.189 0.034
A1600083 3.435 2.867 1.299 5.306 0.015
A1500084 3.419 2.869 1.320 5.333 0.016
A1600232 3.428 2.876 1.306 5.237 0.027
A1500030 3.451 2.885 1.306 5.369 0.016
A1500069 3.424 2.868 1.318 5.324 0.018
A1500011 3.452 2.884 1.299 5.091 0.040
A1600240 3.445 2.860 1.323 5.347 0.017
A1500015 3.441 2.861 1.318 5.153 0.033
A1500047 3.421 2.881 1.323 5.138 0.039
5、使用正常参考集的矫正后的NCR的SD计算Z值。
6、使用chrX Z值和chrY Z值计算ZZ值。
样本编号 ZZ值
A1600136 -0.919689964
A1500026 -0.374767001
A1600151 -1.566992121
A1500041 1.948944603
A1600035 -2.239834771
A1600073 -2.380666628
A1600117 -0.508517562
A160120PI -0.036196596
A1600029 0.919276154
A1500017 -1.843302578
A1600090 -0.974057453
A1600244 0.569276673
A1600083 -2.516409966
A1500084 -1.599107508
A1600232 0.152471213
A1500030 -0.971800184
A1500069 -1.024252233
A1500011 -0.096991028
A1600240 -0.899896281
A1500015 -0.866122839
A1500047 0.838349763
7、根据Z值和ZZ值判断结果
实施例4待测样本数(同一批次)＞30的检测
本实施例以待测样本数＝26为例，用于说明本发明所述检测分析方法。
1、同时抽取100名待测孕妇的外周血进行血浆分离、血浆游离DNA提取、建库测序。
2、通过比对、过滤、统计及均一化，下表列出了100个血样均一化后的结果。
3、随后计算待测样本(稳健回归方法可以允许多种染色体异常的存在)的矫正后的NCR均值，矫正后的NCR的SD，Slope和GC均值。
4、使用待测参考集的计算出的参数对以上NCR进行矫正优化。
5、使用待测样本参数计算Z值。
6、使用chrX Z值和chrY Z值计算ZZ值，并根据Z值和ZZ值判断结果。
以上结果都经过出生验证或者核型分析确认结果，检出结果与实际结果完全一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种无创产前生物信息检测分析方法，其特征在于，根据不同的待测样本数量选择下述(1)～(3)之一的分析方法：
(1)当待测样本数≤10时：
S1、构建正常参考集并计算Slope、GC均值、矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD；
S2、计算每个待测样本每条染色体的NCR值和GC含量值，利用正常参考集计算得到的对应染色体的Slope和GC均值，根据公式1计算出待测样本每条染色体的矫正后的NCR；
S3、利用正常参考集计算得到的矫正后的NCR均值、矫正后的NCR的SD和S2计算得到的每条染色体矫正后的NCR，通过公式2计算每个样本的常染色体的Z值和性染色体Z值，随后根据X、Y染色体的Z值来计算ZZ值；
公式1：
公式2：
(2)当10＜待测样本数≤30时：
S1、构建正常参考集并计算矫正后的NCR的SD；
S2、计算每个待测样本每条染色体的NCR值和GC含量值；
采用待测样本构建待测参考集，计算其Slope、GC均值和矫正后的NCR均值，并根据公式1计算出待测样本每条染色体的矫正后的NCR；
S3、利用正常参考集计算得到的矫正后的NCR的SD、待测参考集计算得到的矫正后的NCR均值和S2计算得到的每条染色体矫正后的NCR，通过公式2计算每个样本的常染色体的Z值和性染色体Z值，随后根据X、Y染色体的Z值来计算ZZ值；
(3)当待测样本数＞30时：
S1、采用待测样本构建待测参考集，并计算Slope、GC均值和矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD；
S2、计算每个待测样本每条染色体的NCR值和GC含量值；利用待测参考集计算得到的Slope和GC均值，根据公式1计算出待测样本每条染色体的矫正后的NCR；
S3、利用待测参考集计算得到的矫正后的NCR均值、矫正后的NCR的SD和S2计算得到的每条染色体矫正后的NCR，通过公式2计算每个样本的常染色体的Z值和性染色体Z值，随后根据X、Y染色体的Z值来计算ZZ值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，正常参考集或待测参考集计算Slope、GC均值、矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD的方法如下：
1)将样本上机测序，过滤掉低质量和空接头的reads，保留符合质控标准的reads；
2)将符合质控标准的reads与人类基因组标准序列hg19进行比对，统计比对上hg19的reads坐标位置，计算每条染色体的Mapped reads(比对上的reads数)、Uniq Mapped reads(完美比对无重复的reads数)参数，同时计算每条染色体Uniq Mapped reads相对应的GC含量；
3)将reads数据均一化得到NCR值；
4)针对每条常染色体，根据其GC含量和NCR值使用稳健回归的方法和CV回归的方法进行矫正，得到回归的Slope与GC均值，然后分别针对每一条常染色体分别得到矫正后的NCR值；针对每一条染色体矫正后NCR的样本集，得到矫正后的NCR均值和NCR的SD；
针对性染色体只保留女性样本，针对女性样本的筛选标准是Y染色体NCR值小于0.02；然后分别根据X染色体和Y染色体的GC含量和NCR值使用稳健回归的方法和CV回归的方法进行矫正，得到回归的Slope与GC均值，继而计算得到X染色体和Y染色体Slope，GC均值，根据公式计算X、Y染色体矫正后的NCR均值和矫正后的NCR的SD。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，构建正常参考集的样本和待测样本来自孕周10周以上的孕妇外周血血浆。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，构建正常参考集的样本数量不少于100个。
5.权利要求1～4任一项所述方法在无创检测分析胎儿染色体方面的应用。
6.一种无创检测胎儿染色体非整倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照权利要求1～4任一项所述方法得到数据；
(2)常染色体判定：
|Z值|<＝3为正常，Z值>3为三倍体；Z值<-3为单倍体；
(3)性染色体判定：
Y染色体的NCR值<0.021判定为疑似女性，Y染色体的NCR值>＝0.021判定为疑似男性；
chrX Z值>3且chY Z值<7，为超雌综合征(47，XXX)；
chrX Z值<‐3且chrY Z值<7，为特纳综合征(45，X)；
ZZ值>3且chrY Z值>7且chrX Z值<‐3，为超雄综合征(47，XYY)；
ZZ值>3且|chrY Z值|>7且|chrX Z值|<3，克氏综合征(47，XXY)；
|chrY Z值|<＝7且|chrX值|<＝3为正常女性；
|chrY Z值|>7且|chrZZ值|<＝3为正常男性。
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