CN110129419B - 拷贝数变异的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种拷贝数变异的检测方法，所述方法包含：(A)提供3个以上的检测样本；(B)纯化检测样本中的核酸；(C)将所有检测样本的核酸进行分组；(D)将分组后的所有检测样本核酸各自进行全基因组放大；(E)将分组后的检测样本核酸放大产物标定双色荧光；(F)于含有一群能专一性侦测人类基因体的探针的芯片上进行杂交；(G)进行局部加权回归散点平滑法(lowess)分析；(H)与校正用探针数值群的相对应探针数值进行比对计算；(I)将所述比对计算结果进行拷贝数变异分析，得到目标检测样本的拷贝数变异结果。本检测方法可节省参考样本的使用，有利于高通量的检测。

Description

拷贝数变异的检测方法
技术领域
本发明是关于基因体的检测方法，尤指一种检测细胞染色体拷贝数变异(CopyNumber Variation)的方法。
背景技术
传统利用染色体微阵列芯片检测拷贝数变异时，需在同一片芯片上同时加入标定不同荧光的检测样本及参考样本的DNA，常用的荧光染剂为Cy3荧光染剂及Cy5荧光染剂，经激发后分别可放出红光及绿光，接着将DNA变性成为单股DNA后，再与染色体微阵列芯片上的探针进行竞争性杂交后进行荧光信号比对，以得知检测样本的染色体特定区域相较于参考样本是否有丢失、获得或没有差异。由于传统拷贝数变异检测方式使用了参考样本，因此每进行一次检测样本的拷贝数变异检测时，均需花费两倍的试剂及人力来测试一个检测样本的DNA，造成检测上的负担。
由于传统的拷贝数变异检测方法需要参考样本及使用的相关试剂、操作人力，成本较高，故现有技术需要一种降低成本的拷贝数变异检测方法。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明的目的在于省去参考样本DNA及相关试剂的使用。此外，由于较佳的标准差与较收敛的数据，以本发明的方法获得的结果更能明显地判定拷贝数变异。
为达上述的发明目的，本发明提供一种用于检测拷贝数变异(copy numbervariation)的方法，其包含：(A)提供3个以上检测样本；(B)纯化每一检测样本中的核酸，得到每一检测样本的核酸；(C)将所有检测样本的核酸进行分组，每组有两个检测样本核酸，得到分组后的检测样本核酸；(D)将分组后的每一检测样本核酸各自进行全基因组放大(whole genome amplification)，得到分组后的检测样本核酸放大产物；(E)将每一分组后的检测样本核酸放大产物的其中一份检测样本核酸放大产物标定第一荧光染剂，针对每一组得到第一荧光染剂标定核酸放大产物，并将每一分组后的检测样本核酸放大产物的另一份检测样本核酸放大产物标定第二荧光染剂，针对每一组得到第二荧光染剂标定核酸放大产物；(F)将每一分组后的第一荧光染剂标定核酸放大产物与第二荧光染剂标定核酸放大产物依组别混和后，于含有一群能专一性侦测人类基因体的探针的芯片上进行杂交后，针对每一芯片产生分组检测样本讯号数据群，所述分组检测样本讯号数据群由两检测样本讯号数据群组成，且所述检测样本讯号数据群是由检测样本的每一探针讯号数据所组成的集合；(G)将每一芯片上的分组检测样本讯号数据群进行局部加权回归散点平滑法(lowess，locally weighted scatterplot smoothing)分析，从两检测样本讯号数据群得到两完成lowess分析的检测样本讯号数据群；(H)将完成lowess分析的目标检测样本讯号数据群的每一个依染色体坐标位置排列的探针讯号数据与校正用探针数值群的相对应探针数值进行比对计算，得到比对计算结果；其中校正用探针数值群的产生过程如下：(i)使用与目标检测样本同一检测批次或不同检测批次的分组检测样本讯号数据群；(ii)将至少三个完成lowess分析的检测样本讯号数据群进行计算，产生一群校正用探针数值群，而所述校正用探针数值群为每一校正用探针数值的集合；(I)将所述比对计算结果进行拷贝数变异分析，得到目标检测样本的拷贝数变异结果。
本发明藉由3个以上完成lowess分析的检测样本计算出每一探针的校正用探针数值作为参考比对数值，再与目标检测样本的讯号数据进行比对计算，而完成拷贝数变异的检测，本发明相较传统拷贝数变异检测方法，可以在获得每一目标检测样本结果时节省参考样本及试剂的使用、人力，不仅能降低成本，且有较佳的经济效应，而有利于高通量的拷贝数变异的检测。
较佳的，其中步骤(H)(ii)中所述计算包含：将至少三个完成lowess分析的检测样本的所有探针讯号数据群(包含性染色体XY)依染色体第1～22号所有探针的平均值进行平均值置中校正且针对所述至少三个完成lowess分析及平均值置中校正的检测样本讯号数据群中计算出所述芯片上每一探针的中位数讯号数值，所述芯片上每一探针的中位数讯号数值即为每一探针的校正用探针数值。经过lowess分析后可降低双色荧光的互相影响，平均值置中校正可降低因核酸杂交量或标定荧光效率不同而产生的讯号强度落差，而利用检测样本讯号数据群间取中位数可排除因实验误差或少数检测样本变异导致的样本「间」讯号群离群值(outlier)，而得到相当于传统参考样本的校正用探针数值群。
较佳的，其中步骤(H)中所述的比对计算包含使用步骤(i)及(ii)所产生的校正用探针数值群进行以下计算：计算log2(所述完成lowess分析的目标检测样本的每一探针讯号数据/校正用探针数值群的相对应探针数值)，得到目标检测样本的每一探针的log2比值，即得到所述比对计算结果。
较佳的，其中所述的比对计算在计算所述目标检测样本的每一探针的log2比值后更进一步将所述目标检测样本的每一探针的log2比值进行中位数归零校正(意指将芯片上的所有探针都取了log2比值之后，再将所有获得的log2比值取中位数，假设中位数为-0.1，再将每个探针的log2比值都减去-0.1，这样所有获得的log2比值的中位数就会变成0)且依探针的位置排列，以至少连续3根探针的经中位数归零校正的log2比值计算每一探针的中位数与标准差数值，而于连续探针数据群间取中位数可排除因实验误差或单一探针失效导致的样本内讯号离群值(outlier)。再将每一探针的经中位数归零校正的log2比值中位数数值±标准差数值×系数，得到所述比对计算结果，当探针的经中位数归零校正的log2比值中位数数值为正值时，则取中位数数值－标准差数值×系数；当探针的经中位数归零校正的log2比值中位数数值为负值时，则取中位数数值+标准差数值×系数，以利用标准差以使偏差讯号收敛。
更佳的，其中所述的系数介于0到1中间，该系数可根据整体讯号数据群的标准差及标准染色体异常样本(例如使用Coriell institute的样本或以传统检测方法测出染色体异常的样本)来调整所得比对计算结果的收敛程度及背景杂讯，以凸显有缺失或扩增的片段；更佳的，系数介于0.1～0.3之间。当系数在0.3～0.5之间时，大多数探针讯号数据的收敛程度最高(讯号数据群标准差最低)，而系数在0.0～0.2之间时，背景杂讯(不是标准染色体异常样本该有的讯号)数量最少。
较佳的，其中步骤(I)的拷贝数变异计算是使用包括环状二元分割法(CBS，Circular binary segmentation)、BioHMM、Forward-Backward Fragment-AnnealingSegmentation或Wavelet smoothing等工具进行。
较佳的，其中步骤(E)所述的第一荧光染剂是Cy3(Cyanine Dye 3)荧光染剂、第二荧光染剂是Cy5(Cyanine Dye 5)荧光染剂。
本发明所述的中位数归零校正是计算出样本的中位数后，将各样本数值减去中位数，使样本的中位数等于0。
本检测方法可节省参考样本的使用，有利于高通量的检测。
附图说明
图1为本发明的拷贝数变异检测方法流程示意图。
图2-1为本发明的拷贝数变异检测结果。图上的每一点都是各自代表不同的探针，X轴最左边为第1号染色体，接在第1号染色体的右边为第2号染色体，以此类推到第22号染色体，接在第22号染色体的右边为X染色体，接在X染色体的右边为Y染色体(X轴最右边)。
图2-2为传统方式，在同一染色体微阵列芯片将检测样本标定Cy5荧光染剂，参考样本标定Cy3荧光染剂，经过局部加权回归校正后，取每一探针的log2(红荧光讯号/绿荧光讯号)数值作图。
图2-3为传统方式，在两染色体微阵列芯片将检测样本标定Cy5荧光染剂，参考样本标定Cy3荧光染剂，经过局部加权回归校正后，取每一探针的log2(红荧光讯号/绿荧光讯号)数值作图。
具体实施方式
以下，将藉由一实施例说明本发明的拷贝数变异检测方法的具体实施方式，本领域技术人员可经由本说明书的内容轻易地了解本发明所能达成的优点与功效，并且于不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更，以施行或应用本发明的内容。
实施例1
首先，请参酌图1，在步骤(S1)中提供20个发展迟缓患者血液的检测样本。
接着在图1步骤(S2)中，纯化每一检测样本中的核酸，得到每一检测样本的核酸，具体而言是使用MagPurix 12S System自动核酸萃取仪(Zinexts)及MagPurix Blood DNAextraction kit(Zinexts,cat#ZP02001-48)萃取DNA，并以O.D.值作为DNA的纯度指标，当O.D.260/230>1.0且O.D.260/280>1.7时为合格。
于图1步骤(S3)中，将所有检测样本的核酸进行分组，每组有两个检测样本核酸，得到分组后的检测样本核酸。也就是将所述20个检测样本的DNA随机分为两两一组，每组中有两个检测样本DNA，为分组后的检测样本DNA。在其他的实施方式中，若检测样本数量为奇数，则使用传统参考样本作为检测样本与落单样本为一组或将落单样本与已被分组的任一检测样本为一组。
再来，于图1步骤(S4)中，将分组后的每一检测样本核酸各自进行全基因组放大(whole genome amplification)，得到分组后的检测样本核酸放大产物。具体来说，是使用CytoOneArray quick WGA v2.0试剂(Phalanx Biotech Group)，并依照使用手册建议的流程针对分组后的每一检测样本DNA进行全基因组的放大，得到分组后的检测样本DNA放大产物。
再来，如图1步骤(S5)中，将每一分组后的检测样本核酸放大产物的其中一份检测样本核酸放大产物标定第一荧光染剂，针对每一组得到第一荧光染剂标定核酸放大产物，并将每一分组后的检测样本核酸放大产物的另一份检测样本核酸放大产物标定第二荧光染剂，针对每一组得到第二荧光染剂标定核酸放大产物。具体来说，是依照CytoOneArrayquick WGA v2.0试剂(Phalanx Biotech Group)使用手册建议的流程进行标定，将每一组内的第一检测样本DNA放大产物以绿色荧光Cy3(Cyanine Dye 3)荧光染剂标记，并确认产物的产率及标定效率通过试剂厂商建议的QC得到分组后绿色荧光染剂标定DNA放大产物；将每一组内的第二检测样本DNA放大产物以红色荧光Cy5(Cyanine Dye 5)荧光染剂标记，并确认产物的产率及标定效率通过试剂厂商建议的QC，得到分组后红色荧光染剂标定DNA放大产物。
接着，如图1的步骤(S6)中，将每一分组后的第一荧光染剂标定核酸放大产物与第二荧光染剂标定核酸放大产物依组别混和后，于含有一群能专一性侦测人类基因体的探针的芯片上进行杂交后，针对每一芯片产生分组检测样本讯号数据群，所述分组检测样本讯号数据群由两检测样本讯号数据群组成，且所述检测样本讯号数据群是由检测样本的每一探针讯号数据所组成的集合。具体来说，是将分组后绿色荧光染剂标定DNA放大产物与分组后红色荧光染剂标定DNA放大产物混合后，放在CytoOneArray v2.23芯片(PhalanxBiotech Group)(基因探针数32,816点,依国际Hg19资料库设计)上，依厂商建议进行杂交与清洗。使用Agilent扫描仪(G2565CA)依试剂厂商建议的扫描参数进行扫描，再使用Genepix 6.0软体进行芯片影像分析得到原始数据gpr档案，因此每片芯片得到第一检测样本讯号数据群及第二检测样本讯号数据群共两检测样本讯号数据群所组成的分组检测样本讯号数据群，而检测样本讯号数据群是由每一探针讯号数据所组成的集合。
接着，如图1的步骤(S7)中，将每一芯片上的分组检测样本讯号数据群进行局部加权回归散点平滑法(lowess，locally weighted scatterplot smoothing)分析，从两检测样本讯号数据群得到两完成lowess分析的检测样本讯号数据群。具体而言，将每一芯片方第一检测样本讯号数据群与第二检测样本讯号数据群进行局部加权回归散点平滑法(locally weighted scatterplot smoothing，lowess)分析以降低芯片上双色荧光的互相影响，得到完成lowess分析的第一检测样本讯号数据群及完成lowess分析的第二检测样本讯号数据群。
接下来，如图1(S8)步骤中，将完成lowess分析的目标检测样本讯号数据群的每一个依染色体上位置排列的探针讯号数据与校正用探针数值群的相对应探针数值进行比对计算，得到一比对计算结果；其中校正用探针数值群的产生过程如下：(i)使用与目标检测样本同一检测批次或不同检测批次的分组检测样本讯号数据群；(ii)将至少三个完成lowess分析的检测样本讯号数据群进行计算，产生一群校正用探针数值群，而所述校正用探针数值群为每一探针的校正用探针数值的集合。具体来说，是先将20群完成lowess分析的检测样本讯号数据群的所有探针(包含染色体XY)讯号数据群依染色体第1～22号所有探针的平均值进行平均值置中校正，以降低芯片间的读取误差，再以所述20群完成lowess分析及平均值置中校正的检测样本讯号数据群针对每一探针计算出20个完成lowess分析及平均值置中校正的检测样本讯号数据，并以所述20个完成lowess分析及平均值置中校正的检测样本讯号数据针对CytoOneArray v2.23芯片上每一探针计算出一中位数讯号数值，所述芯片上每一探针的中位数讯号数值即为每一探针的校正用探针数值，而每一探针的校正用探针数值的集合即为校正用探针数值群。接着将完成lowess分析的目标检测样本讯号数据群的每一个探针讯号数据与校正用探针数值群的相对应探针数值进行比对计算。在本实施例中，与校正用探针数值群进行比对计算的完成lowess分析的目标检测样本是20群完成lowess分析的其中一个检测样本，然而在其他实施例中，若有新的样本(所述20群完成lowess分析以外的检测样本)，可将所述新的样本依本实施例所述完成(S1)-(S7)后与所述20群完成lowess分析的检测样本经计算所得的校正用探针数值群进行比对计算。所述比对计算具体而言，是计算log2(所述完成lowess分析的目标检测样本的每一探针讯号数据/校正用探针数值群的相对应探针数值)得到目标检测样本的每一探针的log2比值，并进一步将所述目标检测样本的每一探针的log2比值进行中位数归零校正，意即目标检测样本的每一根探针都取log2比值后，再将32,816个log2比值取中位数后将每探针的log2比值扣除此中位数，使32,816根探针的中位数变为0。接着，将所有探针依探针的染色体坐标位置(genomic coordinates)排列，以连续5根探针的经中位数归零校正的log2比值计算每一探针的中位数与标准差数值，也就是说将1～5号探针取一中位数与标准差，作为3号探针的中位数与标准差；2～6号探针取一中位数与标准差，作为4号探针的中位数与标准差数值。接着将每一探针的经中位数归零校正的log2比值中位数数值±标准差数值×系数，得到所述比对计算结果。而此计算在探针的经中位数归零校正的log2比值中位数数值为正值时，则取中位数数值－标准差数值×系数；当探针的经中位数置中校正的log2比值中位数数值为负值时，则取中位数数值+标准差数值×系数，以利用标准差以使偏差讯号收敛，且系数是介于0到1中间，该系数可根据整体讯号数据群的标准差及标准染色体异常样本来调整所得比对结果的收敛程度，以凸显有缺失或扩增的片段，本实施例是将系数调整为0.2后，计算得出每根探针的比对计算结果。
接着，以所述比对计算结果为Y轴，以genomic coordinates染色体坐标位置为X轴，即可画出图2-1分析。最后，根据图1的(S9)步骤，将所述比对计算结果进行拷贝数变异分析得到目标检测样本的拷贝数变异结果，为在一号染色体上有2.23Mb长度的缺失。在其他实施例中，可使用环状二原分割法(CBS，Circular binary segmentation)以自动求出拷贝数变异的位置。
对照例1：
实验方法类似于实施例，但在步骤(S1)中仅使用自一检测样本纯化的核酸(DNA)及一参考样本(human genomic DNA,human male,promega cat#G1521)，将标定Cy5荧光染剂的经全基因组放大的检测样本DNA，及标定Cy3荧光染剂的经全基因组放大的参考样本DNA于同一芯片上杂交，直到检测样本探针讯号数据与参考样本探针讯号完成lowess分析，接着计算log2(检测样本探针1讯号数据/参考样本探针1讯号数据)，以此类推，计算出全部32,816根探针的log2比值后，进行log2比值平均值归零校正，以平均值归零校正后的log2比值为Y轴，以染色体坐标位置genomic coordinates为X轴，即可画出图2-2以分析拷贝数变异的结果，图2-2的结果与图2-1的结果是来自相同样本，但检测方法不同。
对照例2：
实验方法类似于实施例，但在步骤(S1)中使用自两检测样本(分别为检测样本A、检测样本B)纯化的核酸(DNA)及一参考样本DNA(human genomic DNA,human male,promegacat#G1521)，将标定Cy5荧光染剂的经全基因组放大的检测样本A的DNA，及标定Cy3荧光染剂的经全基因组放大的参考样本DNA于A芯片上杂交，另将标定Cy5荧光染剂的经全基因组放大的检测样本B的DNA，及同样标定Cy3荧光染剂的经全基因组放大的相同参考样本DNA于B芯片上杂交，直到A、B两芯片分别各自完成lowess分析，接着计算log2(A检测样本探针1讯号数据/B芯片参考样本探针1讯号数据)，以此类推，计算出全部32,816的探针的log2比值后，进行log2比值平均值归零校正，以平均值归零校正后log2比值为Y轴，以染色体坐标位置genomic coordinates为X轴，即可画出图2-3以分析拷贝数变异的结果，图2-3的结果与图2-1的结果是来自相同样本，但检测方法不同。
将本案方法与使用传统方式的拷贝数变异检测结果图2-2及图2-3的结果比较后，不仅如同传统方式能针测出一号染色体上2.23Mb的拷贝数缺失，且本发明方法侦测结果的所有探针数值也就是所有探针比对计算结果的标准差为0.08(一般来说，是以标准差0.3作为分析是否失败的临界值，如果大于0.3就表示讯号过于发散可能导致拷贝数变异鉴别度差，必须重作实验或芯片影像分析)，相较于传统方式将标定不同荧光的检测样本DNA与参考样本DNA于同一染色体微阵列芯片的探针杂交比对的图2-2的标准差0.17、将标定不同荧光染剂的检测样本DNA与参考样本DNA于两染色体微阵列芯片的探针杂交比对的图2-3的标准差0.21，来的小，数据较为收敛，因此拷贝数变异亦较为明显。
综上所述，本发明的拷贝数变异的检测方法，在每得到一个检测样本的结果时均可节省一个参考样本的使用、相关试剂及操作人力，且在实施大量检测样本的拷贝数变异时，本案造成成本降低的效果尤为显著。

Claims (4)

1.一种用于检测拷贝数变异(copy number variation)的非诊断目的的方法，其包含：
(A)提供3个以上检测样本，其不包含传统参考样本；
(B)纯化每一检测样本中核酸，得到每一检测样本的核酸；
(C)将所有检测样本的核酸进行分组，每组有两个检测样本核酸，得到分组后的检测样本核酸，若所述检测样本的数量为奇数，则将落单样本与已被分组的任一检测样本为一组；
(D)将分组后的每一检测样本核酸各自进行全基因组放大(whole genomeamplification)，得到分组后的检测样本核酸放大产物；
(E)将每一分组后的检测样本核酸放大产物的其中一份检测样本核酸放大产物标定第一荧光染剂，针对每一组得到第一荧光染剂标定核酸放大产物，并将每一分组后的检测样本核酸放大产物的另一份检测样本核酸放大产物标定第二荧光染剂，针对每一组得到第二荧光染剂标定核酸放大产物；
(F)将每一分组后的第一荧光染剂标定核酸放大产物与第二荧光染剂标定核酸放大产物依组别混和后，于含有一群能专一性侦测人类基因体的探针的芯片上进行杂交后，针对每一芯片产生分组检测样本讯号数据群，所述分组检测样本讯号数据群由两检测样本讯号数据群组成，且所述检测样本讯号数据群是由检测样本的每一探针讯号数据所组成的集合；
(G)将每一芯片上的分组检测样本讯号数据群进行局部加权回归散点平滑法(lowess，locally weighted scatterplot smoothing)分析，从两检测样本讯号数据群得到两完成lowess分析的检测样本讯号数据群；
(H)将完成lowess分析的目标检测样本讯号数据群的每一个依染色体坐标位置排列的探针讯号数据与校正用探针数值群的相对应探针数值进行比对计算，得到比对计算结果；其中校正用探针数值群的产生过程如下：
(i)使用与目标检测样本同一检测批次或不同检测批次的分组检测样本讯号数据群；
(ii)将至少三个完成lowess分析的检测样本讯号数据群进行计算，产生一群校正用探针数值群，而所述校正用探针数值群为每一探针的校正用探针数值的集合，其中所述计算包含：将至少三个完成lowess分析的检测样本的所有讯号数据群依染色体第1～22号所有探针的平均值进行平均值置中校正，且针对所述至少三个完成lowess分析及平均值置中校正的检测样本讯号数据群中计算出所述芯片上每一探针的中位数讯号数值，所述芯片上每一探针的中位数讯号数值即为每一探针的校正用探针数值，
且所述比对计算包含使用步骤(i)及(ii)所产生的校正用探针数值群进行以下计算：计算log2(所述完成lowess分析的目标检测样本的每一探针讯号数据/校正用探针数值群的相对应探针数值)，得到目标检测样本的每一探针的log2比值，即得到所述比对计算结果，
其中步骤(H)中所述的比对计算在计算所述目标检测样本的每一探针的log2比值后，更进一步将所述目标检测样本的每一探针的log2比值进行中位数归零校正且依探针的染色体坐标位置排列，以至少连续3根探针的经中位数归零校正的log2比值计算每一探针的中位数与标准差数值，将每一探针的经中位数归零校正的log2比值中位数数值±标准差数值×系数，得到所述比对计算结果，其中所述的系数介于0到1中间；
(I)将所述比对计算结果进行拷贝数变异分析，得到目标检测样本的拷贝数变异结果。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的系数为0.1～0.3。
3.如权利要求2所述的方法，其中步骤(I)的拷贝数变异分析是使用包括环状二元分割法(CBS，Circular binary segmentation)、BioHMM、Forward-Backward Fragment-Annealing Segmentation或Wavelet smoothing工具进行。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(E)所述的第一荧光染剂是Cy3(Cyanine Dye 3)荧光染剂、第二荧光染剂是Cy5(Cyanine Dye 5)荧光染剂。
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