CN116926181A - 评价病原微生物检测探针捕获效率的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法及应用，属于基因检测技术领域。该方法包括以下步骤：探针设计：针对目标病原微生物基因序列设计病原探针；针对宿主探针区域设计特异性探针，作为内参探针；建库测序：取待测样本，构建测序文库，将文库与所述病原探针和所述内参探针混合，进行杂交捕获反应，并对文库进行高通量测序；数据分析：取测序数据，比对至宿主基因序列，获得比对至宿主探针区域和宿主非探针区域的reads数，计算二者的比值，以该比值评价探针捕获效率。该方法在无需增加额外实验环节的情况下，通过对宿主探针区域的富集效率间接监控临床病原的富集效率，既节约了检测成本，又不影响检测结果交付的时效性。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法及应用。
背景技术
在常规基因检测实验过程中，建立对照组和进行重复实验是最基本和常用的评价探针捕获富集效率的方法。其中，对照组可以采用包括不富集或者富集非目标DNA的样本组进行对比评估，而重复实验可以通过比较多次实验的结果来评估探针捕获富集效率的稳定性和可靠性。此外，如控制DNA浓度、检测DNA碎片长度和使用qPCR等方法也都可以监控富集效率。
总体而言，评价探针捕获富集效率的技术比较成熟，多种方法可以结合使用，以获得更准确和可靠的结果。但在实际应用中，仍然需要根据具体实验设计和实验目的选择适当的方法，并注意技术细节和质量控制，以确保结果的准确性和可靠性。
但上述现有技术都需额外新增实验环节，使实验流程更加复杂，不仅仅增加了检测成本，而且可能会引入新增实验带来的系统偏差。而临床病原微生物检测，对于检测时效性要求又极为严格，常规技术均存在新增实验环节而延长检测结果交付时间的问题。
发明内容
基于此，有必要针对上述常规实验中评价探针捕获效率方法需要新增实验的问题，提供一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，
一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，包括以下步骤：
探针设计：针对目标病原微生物基因序列设计病原探针；以宿主基因中特异且保守的区域为宿主探针区域设计特异性探针，作为内参探针；所述内参探针与所述病原探针遵循相同的设计原则；
建库测序：取待测样本，构建测序文库，将文库与所述病原探针和所述内参探针混合，进行杂交捕获反应，并对文库进行高通量测序；
数据分析：取测序数据，比对至宿主基因序列，获得比对至宿主探针区域的reads数和比对至宿主非探针区域的reads数，计算比对至宿主探针区域的reads数与比对至宿主非探针区域的reads数的比值，以该比值评价探针捕获效率。
上述评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，在针对目标病原微生物设计捕获探针的同时，也针对宿主基因中特异且保守的区域设计特异性探针，作为内参探针，由于内参探针与病原探针遵循相同的设计原则，因此内参探针的捕获效率可反应病原捕获效率，此外内参探针在不同样本和条件下的表达水平相对稳定，更加有利于对病原捕获效率的评价。因此，后续可以此内参探针为指征，通过对比该内参探针对宿主序列的捕获效率，评价病原微生物检测探针捕获效率，从而可避免额外新增实验，缩短了结果交付时间。
在其中一个实施例中，所述宿主探针区域和所述宿主非探针区域选自不同的管家基因。可以理解的，宿主探针区域选择特异且保守的区域即可，但选择管家基因具有普遍表达、稳定表达和物种保守性的优势，即管家基因的表达对于基本的细胞功能是必需的，不仅限于特定的发育阶段或特殊的细胞类型；且在正常生理条件下表达水平相对稳定；以及在不同物种中高度保守；有利于后续捕获效率的计算。
在其中一个实施例中，所述数据分析步骤中，所述比对至宿主探针区域的reads数为比对至一个管家基因的reads数，所述比对至宿主非探针区域的reads数为比对至另一个管家基因的reads数。
在其中一个实施例中，所述管家基因选自GAPDH，ACTB，B2M，FTH1，FTL中的至少一个。
在其中一个实施例中，对所述比值进行log10标准化，定义为富集效率指数，以此富集效率指数评价探针捕获效率。通过对该比值进行log10标准化，可提高指数的稳定性，不容易受到临床样本病原浓度变化的影响。
在其中一个实施例中，该方法还包括阈值设定步骤，所述阈值设定步骤为：取若干临床样本，按照上述方法计算得到富集效率指数，评估富集效率指数对所述临床样本包含的病原阳性率的影响情况，设定富集效率指数阈值。可以理解的，可通过分析大量历史临床样本，考察富集效率指数对病原阳性率的影响情况，并基于分析结果，设定富集效率指数阈值，从而可在个别样本检测时直接参考阈值，减少了方法建立后的运行成本。
可以理解的，上述考察富集效率指数对病原阳性率的影响情况，可优先考虑临床上较为核心的致病病原微生物。
本发明还公开了上述的内参探针在制备用于病原微生物基因检测的试剂中的用途。
常规病原微生物基因检测过程中，宿主序列为“杂质”干扰成分，本案突破常规思维的限制，针对宿主序列设计内参探针，可在无需额外进行实验操作的前提下，方便快捷的计算得到病原探针捕获效率，从而实现病原微生物检测质控。
本发明还公开了一种用于病原微生物基因检测的试剂，包括上述的内参探针和病原探针。可以理解的，上述内参探针和病原探针按照常规捕获探针设计规则设计即可。
本发明还公开了上述的评价探针捕获效率的方法在病原微生物基因检测中的用途。
本发明还公开了一种非诊断治疗目的的病原微生物基因检测方法，包括上述的评价探针捕获效率的方法，还包括捕获效率质控步骤，所述捕获效率质控步骤为：将待测样本的富集效率指数与富集效率指数阈值相比较，当待测样本的富集效率指数高于富集效率指数阈值，则判定为捕获效率合格。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，在针对目标病原微生物设计捕获探针的同时，也针对宿主基因中特异且保守的区域设计特异性探针，作为内参探针，后续以此内参探针为指征，通过对比该内参探针对宿主序列的捕获效率，可评价病原微生物检测探针捕获效率，从而可避免额外新增实验，缩短了结果交付时间。
附图说明
图1为实施例1中数据分析流程示意图；
图2为实施例2中富集效率指数评估示意图；
图3为实施例3中富集倍数对比评估示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。
实施例1
一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，包括以下步骤：
1、探针设计。
针对目标病原微生物基因序列设计病原探针；以宿主基因中特异且保守的区域为宿主探针区域设计特异性探针，作为内参探针。
上述目标病原微生物种类可根据临床需要选择，随后按照相同的捕获探针设计规则，设计病原探针和内参探针。如在遵循以下设计规则中采用相同的参数条件：
1)特异性：探针应具有高度特异性，能够准确地与目标序列匹配，而不与非目标序列发生杂交。特异性可以通过在设计中避免与其他相关序列的相互作用来实现。
2)敏感性：探针应具有高灵敏度，能够检测到目标序列的低拷贝数。这可以通过选择探针的长度、核酸组成和杂交条件等方面来实现。
3)均匀覆盖：探针的设计应该确保目标序列的均匀覆盖，以获得全面而准确的数据。避免在目标区域中存在过多的空白或重叠。
4)避免重复序列：重复序列可能导致探针的非特异性杂交，降低实验结果的准确性。因此，在设计探针时，应避免选择含有高度重复序列的区域。
5)杂交温度和盐浓度优化：根据探针的长度、组成和目标序列的特性，优化杂交温度和盐浓度，以确保探针与目标序列的特异性结合。
2、建库测序。
取待测样本，构建测序文库，将文库与上述病原探针和所述内参探针混合，进行杂交捕获反应，使目标序列与探针结合，并对文库进行高通量测序。
3、数据分析。
其流程如图1所示，具体包括：
取测序数据Fastq通过Salmon(V1.9.0)比对到宿主参考序列(即宿主探针区域的序列)，并对结果进行统计，区分目标病原探针reads，宿主探针区域reads，宿主非探针区域reads，以及其它未分类的reads，对上述宿主探针区域和宿主非探针区域的reads进行计数。
本实施例中，宿主探针区域和宿主非探针区域选自不同的管家基因，且宿主探针区域为一个管家基因(GAPDH)，非探针区域为另一个不同的管家基因(B2M)。
计算比对至宿主探针区域(一个管家基因)的reads数与比对至宿主非探针区域(另一个不同的管家基因)的reads数的比值，并进行log10标准化，定义为富集效率指数，以该富集效率指数评价探针捕获效率。
可以理解的，内参探针设计的时候需要包含一到两个管家基因(多余可作为备份)，捕获效率计算时，选择一个捕获宿主基因和一个非捕获宿主基因进行计算即可。
4、阈值设定。
取若干临床样本，按照上述方法计算得到富集效率指数，评估富集效率指数对所述临床样本包含的病原阳性率的影响情况，设定富集效率指数阈值。
具体而言，可根据通过开展大规模的临床宏基因组检测，或者已经积累的大量历史数据，对这些数据进行分析，比较富集效率指数与病原检出率的关联性，以富集效率降低至影响临床关键病原检出的节点设定为阈值。
事实上，发明人利用本司已经积累的大量历史数据分析发现，当富集效率指数较高时，临床关注病原的历史检出率较为稳定(历史检出率与样本来源相关，且与预期相符)；逐步降低富集效率指数时，刚开始临床关注病原的历史检出率并不会变化，当降低到一定值时，临床关注病原的历史检出率显著下降；此值即可设定为富集效率指数阈值。
从而通过富集效率指数阈值的设定，解决富集效率较低影响临床关键病原检出这一问题。
5、捕获效率质控。
将待测样本的富集效率指数与富集效率指数阈值相比较，当待测样本的富集效率指数高于富集效率指数阈值，则判定为捕获效率合格。
上述评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，在无需增加额外实验环节的情况下，从临床大数据分析成面出发，可以通过对宿主探针区域(内参)的富集效率间接监控临床病原的富集效率，既节约了检测成本，又不影响检测结果交付的时效性。
实施例2
为了评估富集效率指数在真实临床环境下的效果，本实施例选取了19个临床样本，按照实施例1的方法，设计了三组实验进行检测。
1、方法。
入组临床样本为历史检出病原微生物的样本，其病原检测结果包括细菌、真菌和病毒等常见流行致病病原。三个实验组分别为未捕获组，捕获A组，捕获B组。
其中，未捕获组无探针捕获步骤，捕获A组和捕获B组采用相同的内参探针(针对GAPDH基因和ACTB基因分别设计了53条及52条探针，其中针对ACTB基因的数据作为备份)，分批次，以不同的实验人员在不同时间进行实验操作，三组实验组样本前处理流程保持一致。
2、结果。
按照实施例1的方法进行建库测序和数据分析，计算得到富集效率指数评估结果如下表和图2所示。
表.1富集效率指数计算
结果显示，未捕获组与捕获A组相比，富集效率指数有明显差异，且如将富集效率指数阈值设定为1，该阈值水平线可以较好的区分两组样本，表明富集效率指数可以较好的评价临床样本的富集效率。
同时，捕获A组与捕获B组相比，富集效率指数变化不大，说明该富集效率指数在相同实验条件下能够保持较好的稳定性。
综上可知，富集效率指数是一个可以稳定且有效评估临床样本富集效率的指数。
实施例3
为了评估富集效率指数与常规评估方法的一致性，基于上述实施例2的三组实验进行补充分析。
1、方法。
富集倍数是富集效率的数据表现形式，具体而言，富集倍数是针对目标病原微生物检测目标区域以病原探针捕获后与捕获前序列的比值。取实施例2的样本数据，计算各组中的富集倍数，具体为：分别以A、B组病原检测reads数除以对应未捕获分组病原检测reads数。
2、结果。
表.2富集倍数计算
结果如上表和图3所示，富集倍数是捕获后A、B分组与未捕获分组针对探针病原计算的结果，捕获组富集倍数中位值为200倍左右，与富集效率指数处于同一数量集，表明富集效率指数可以在一定程度上反应富集倍数。
另外，富集倍数的值跟探针病原的探针数，实验条件有关，可以看到单一样本不同捕获批次富集倍数有差异，但是捕获A组与捕获B组两者的富集倍数无显著性差异(Mann-Whitney U检验)，富集效率指数与之相似，进一步证明该指数在相同实验条件下有着较好的稳定性。
另外可以从表中看出部分样本并无富集倍数统计结果，这包含两方面的原因，一方面是部分样品是阴性对照样本(病原检测结果为阴性，如样本M51274)；另一方面是由于病原载量低，而本实施例测序数据量较少(约5M/样本)，不经过捕获步骤，无法检测到病原reads，也从侧面也反应了基于探针捕获的方法病原检测更加灵敏。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种评价病原微生物检测探针捕获效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
探针设计：针对目标病原微生物基因序列设计病原探针；以宿主基因中特异且保守的区域为宿主探针区域设计特异性探针，作为内参探针；所述内参探针与所述病原探针遵循相同的设计原则；
建库测序：取待测样本，构建测序文库，将文库与所述病原探针和所述内参探针混合，进行杂交捕获反应，并对文库进行高通量测序；
数据分析：取测序数据，比对至宿主基因序列，获得比对至宿主探针区域的reads数和比对至宿主非探针区域的reads数，计算比对至宿主探针区域的reads数与比对至宿主非探针区域的reads数的比值，以该比值评价探针捕获效率。
2.根据权利要求1所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，所述宿主探针区域和所述宿主非探针区域选自不同的管家基因。
3.根据权利要求2所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，所述数据分析步骤中，所述比对至宿主探针区域的reads数为比对至一个管家基因的reads数，所述比对至宿主非探针区域的reads数为比对至另一个管家基因的reads数。
4.根据权利要求1所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，所述管家基因选自GAPDH，ACTB，B2M，FTH1，FTL中的至少一个。
5.根据权利要求1所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，对所述比值进行log10标准化，定义为富集效率指数，以此富集效率指数评价探针捕获效率。
6.根据权利要求5所述的评价探针捕获效率的方法，其特征在于，还包括阈值设定步骤，所述阈值设定步骤为：取若干临床样本，按照上述方法计算得到富集效率指数，评估富集效率指数对所述临床样本包含的病原阳性率的影响情况，设定富集效率指数阈值。
7.权利要求1-6任一项所述的内参探针在制备用于病原微生物基因检测的试剂中的用途。
8.一种用于病原微生物基因检测的试剂，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的内参探针和病原探针。
9.权利要求1-6任一项所述的评价探针捕获效率的方法在病原微生物基因检测中的用途。
10.一种非诊断治疗目的的病原微生物基因检测方法，其特征在于，包括权利要求6所述的评价探针捕获效率的方法，还包括捕获效率质控步骤，所述捕获效率质控步骤为：将待测样本的富集效率指数与富集效率指数阈值相比较，当待测样本的富集效率指数高于富集效率指数阈值，则判定为捕获效率合格。
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| CN (1) | CN116926181A (zh) |
-
2023
- 2023-06-30 CN CN202310797852.7A patent/CN116926181A/zh active Pending
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