CN113851189B - 一种自适应检测pcr荧光基线的方法、装置及其设备 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自适应检测PCR荧光基线的方法，包括：统计采集样本中的每个循环数所对应的荧光数据，得到一系列坐标点，并基于一系列所述坐标点绘制曲线L0；计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差；根据所述标准差和偏差判断当前循环数是否是基线期终点；若是，则对所述基线期起点到基线期终点之间的坐标点进行线性拟合，得到校准基线；本发明实施例通过采用计算基线期起点到某一循环数之间的荧光数据的均值和标准差，增加了数据的连续性和多样性，不会局限于先后几个循环数的荧光数据，基线期终点的判断结果更加可靠，计算的Ct值也会更加准确。

Description

一种自适应检测PCR荧光基线的方法、装置及其设备
技术领域
本发明涉及PCR技术领域，尤其涉及一种自适应检测PCR荧光基线的方法、装置及其设备。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，缩写：PCR，又称多聚酶链式反应)，是一项利用DNA双链复制原理，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。这项技术常被用于病理学和临床检测。
典型的PCR荧光曲线，大致可以分为三个阶段，基线期，增长期和平台期。实际实验过程中，由于PCR扩增过程中，荧光信号受到各方面因素的影响，导致整个PCR反应曲线的漂移，从而对后续循环阈值(Ct)计算的准确性产生影响。
目前有几种方法来处理PCR荧光曲线波动这一问题：
1、整体函数拟合法。该方法一般选择一个函数模型来对整个反应曲线进行拟合，通过将原始数据减去拟合得到的函数的线性项达到消除荧光基线的目的；这种方案存在函数模型选择复杂的缺点。
2、局部线性函数拟合法。该方法一般以线性函数y＝kx+b来对基线期的数据进行拟合，通过将原始数据减去拟合后的线性函数来去除荧光基线。该方法无需选择复杂的函数模型，但需要对基线期进行判断。基线期的起点一般设为一固定值(1～3)，基线期终点的判断则相对灵活，采用fm+1-fm＞0.1(fm代表第m次循环的荧光数据)的固定阈值规则来判断基线期的终点。该方法仅靠前后两次的差值来判断，忽略了整个基线期波动的信息，适应性弱。
发明内容
本发明的目的是提供一种自适应检测PCR荧光基线的方法、装置及其设备，旨在解决现有技术中，方案过于复杂或基线期判断的准确性差而导致Ct计算准确性差的问题。
第一方面，本发明实施例提供了一种自适应检测PCR荧光基线的方法，包括：
获取采集样本中的每个循环数m所对应的荧光数据fm，得到一系列坐标点(m，fm)，并基于一系列所述坐标点(m，fm)绘制曲线L0；
计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差；
根据所述标准差和偏差判断当前循环数是否是基线期终点；
若是，则对所述基线期起点到基线期终点之间的坐标点进行线性拟合，得到校准基线；若否，则返回执行基线期终点判断步骤；
通过所述校准基线对曲线L0进行基线校准，得到曲线L1。
第二方面，本发明实施例提供了一种自适应检测PCR荧光基线的装置，包括：
绘制单元，用于获取采集样本中的每个循环数m所对应的荧光数据fm，得到一系列坐标点(m，fm)，并基于一系列所述坐标点(m，fm)绘制曲线L0；
判断单元，用于计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差；
判断单元，用于根据所述标准差和偏差判断当前循环数是否是基线期终点；
拟合单元，用于判断当前循环数是基线期终点时，则对所述基线期起点到基线期终点之间的坐标点进行线性拟合，得到校准基线；
返回执行单元，用于判断当前循环数不是基线期终点时，则返回执行基线期终点判断步骤；
校准单元，用于通过所述校准基线对曲线L0进行基线校准，得到曲线L1。
第三方面，本发明实施例又提供了一种计算机设备，其包括存储器、处理器及存储在所述存储器上并可在所述处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现上述第一方面所述的自适应检测PCR荧光基线的方法。
第四方面，本发明实施例还提供了一种计算机可读存储介质，其中所述计算机可读存储介质存储有计算机程序，所述计算机程序当被处理器执行时使所述处理器执行上述第一方面所述的自适应检测PCR荧光基线的方法。
本发明实施例通过采用计算基线期起点到某一循环数之间的荧光数据的均值和标准差，增加了数据的连续性和多样性，不会局限于先后几个循环数的荧光数据，基线期终点的判断结果更加可靠，计算的Ct值也会更加准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的PCR反应曲线图；
图2为本发明实施例提供的自适应检测PCR荧光基线的方法的流程示意图；
图3为本发明实施例提供的自适应检测PCR荧光基线的方法的步骤S102的流程示意图；
图4为本发明实施例提供的自适应检测PCR荧光基线的方法的步骤S205的流程示意图；
图5为本发明实施例提供的自适应检测PCR荧光基线的方法的步骤S104之后的流程示意图；
图6为本发明实施例提供的自适应检测PCR荧光基线的装置的结构框图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
请参阅图2，一种自适应检测PCR荧光基线的方法，包括步骤S101-S104。
S101：获取采集样本中的每个循环数m所对应的荧光数据fm，得到一系列坐标点(m，fm)，并基于一系列所述坐标点(m，fm)绘制曲线L0；
在本实施例中，对采集样本中的荧光数据进行统计，可以得到每个循环数m所对应的荧光数据fm，将两个相对应的数写成坐标点的格式，即(m，fm)，并通过在坐标系中绘制出所有循环数对应的坐标点，可以得到一系列坐标点组成的点状图案，将这些坐标点按先后顺序(也可以视为循环数的大小)用样条曲线连接起来，形成曲线L0，该曲线L0反映了DNA片段在复制时随着时间的推移，于反应皿中的浓度和复制速度。
其中，采集样本为PCR反应时的DNA复制过程数据，相关数据有DNA的复制循环数和反应皿中的荧光数据。
如图1所示，图1中x轴为循环数，y轴为荧光数据。图1中，L0包括一开始增长速度较慢的基线期、增加速度较快的增长期和增速变慢并渐渐达到饱和的平台期，其中基线期的起点并不在荧光数据为0上，这是因为在检测荧光数据时受到了反应皿中多方面环境因素的影响，故想要得到真正反应DNA复制的荧光数据曲线，就需要从数据上消除这种影响，具体可查看接下来的步骤操作。
S102：计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差；
在本实施例中，“计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差”中均值和标准差的计算数据不包括当前循环数的荧光数据，但包括基线期起点的荧光数据。
例如：基线期起点定为2，当前循环数定为5，那么就是计算循环数2、3、4对应的荧光数据的均值和标准差。
S103：根据所述标准差和偏差判断当前循环数是否是基线期终点；
在本实施例中，采用计算基线期起点到某一循环数之间的荧光数据的均值和标准差，增加了数据的连续性和多样性，不会局限于先后几个循环数的荧光数据，判断结果更加可靠。
本实施例的原理主要是利用基线期的曲线趋于平缓，想要判断基线期和增长期之间的分界点，主要是找到基线期向上快速增长的那个点，即判断当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差和若干倍标准差之间的大小，在当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差首次超过了若干倍所述标准差，则可认定当前循环数为基线期和增长期的分界点，即基线期终点。
S104：若是，则对所述基线期起点到基线期终点之间的坐标点进行线性拟合，得到校准基线；
在本实施例中，根据基线期起点和相对准确(相比起现有技术，采用计算基线期起点到某一循环数之间的荧光数据的均值和标准差，增加了数据的连续性和多样性，不会局限于先后几个循环数的荧光数据，判断结果更加可靠)的基线期终点，以及对应的曲线L0上的坐标点，进行线性拟合，可以得到线性函数，校准基线。
此校准基线是反应皿中多方面环境因素所产生的荧光数据随反应时间和反应进度而变化的平缓直线。
S105：通过所述校准基线对曲线L0进行基线校准，得到曲线L1。
在本实施例中，根据校准基线对曲线L0进行校准，校准方式一般为影响因素的消除，即相减。
请参阅图3，在一实施例中，步骤S102和S103包括：
S201：将所述基线期起点往后第二个循环数作为当前循环数；
在本实施例中，考虑到需要计算当前循环数和基线期起点之间的循环数对应的荧光数据的均值和标准差，故为了有足够的数据能够统计出均值和标准差，即至少具有两个循环数对应的荧光数据进行计算，将所述基线期起点往后第二个循环数作为当前循环数。
当然，也可以选择第三个、第四个...循环数，但也要考虑到可能错过基线期终点，故可根据实际情况进行选择。
S202：计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算所述当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值的偏差，得到偏差值；
本实施例可参考上述步骤S102和S103的解释。
S203：判断所述偏差值是否超过k倍所述标准差；
具体的，k取3，当然，可以根据重复性和线性做调整。取3在统计学的意义是，当样本值超过均值达3倍标准差，有99.7％的几率认为是异常(即出现基线期和增长期的分界点)的。
S204：若是，则判定所述当前循环数为基线期终点；
S205：若否，则将所述当前循环数的下一所述循环数作为当前循环数，并返回执行基线期终点判断步骤。
其中，基线期终点判断步骤为步骤S202和S203。
在本实施例中，在当前循环数对应的荧光数据不超过均值的k倍标准差时，会继续往后循环，直至达到判定为是的条件。
具体的，采用以下公式判断所述偏差值是否超过k倍所述标准差：
Figure BDA0003276796570000061
其中，fm为当前循环数对应的荧光数据，i为基线期起点，sd_f(i～m-1)为基线期起点至当前循环数的前一个循环数对应的所有荧光数据的标准差。
在一实施例中，基线期起点可取第三个循环数，步骤S202中的当前循环数即为第五个循环数。
在本实施例中，考虑到基线期第一个循环数、第二个循环数对应的荧光数据偏差较大，故选用第三个循环数作为基线期起点，当然，实际操作中可视情况而定。
其中，所述基线期起点为从初始的若干所述循环数中选取一个坐标点。
在本实施例中，主要的目的是选择一个循环数作为基线期起点，而又考虑到不能太靠后，否则可能会错过基线期终点而找不到真正的基线期终点，故在开始时，可以选择前几个循环数中的一个作为基线期起点。
请参阅图4，在一实施例中，步骤S205包括：
S301：若所述偏差值未超过k倍所述标准差，则计算曲线L0中二阶导数最大的坐标点所对应的所述循环数，得到最大增速点；
在本实施例中，一般的，基线期和增长期之间的分界点必会在最大增速点的前方，故需要后续判断当前循环数是否到达了最大增速点，如是，则之前的基线期终点并没有被步骤S203判断出来，此时再往后循环查找基线期终点已无意义。
S302：判断所述当前循环数是否大于或等于所述最大增速点；
在本实施例中，在步骤S203中判断为否时，还需要验证下当前循环数是否到达了最大增速点。
S303：若是，则将所述最大增速点作为基线期终点；
在本实施例中，若是，则之前的基线期终点并没有被步骤203判断出来，此时再往后循环查找基线期终点已无意义，故直接将最大增速点设为基线期终点。
S304：若否，则将所述当前循环数的下一所述循环数作为当前循环数，并返回执行基线期终点判断步骤。
在本实施例中，若否，则继续循环并执行基线期终点判断步骤。
在一实施例中，步骤S104包括：
将曲线L0上的每个坐标点的荧光数据减去所述校准基线上对应所述循环数的y值得到荧光数据的校准值，基于每一循环数以及对应的荧光数据的校准值绘制得到曲线L1，其中，y值为所述校准基线的纵坐标值。
在本实施例中，通过将曲线L0和校准基线上相同循环数的荧光数据相减，得到校准后的荧光数据，并基于校准后的荧光数据和对应的循环数(循环数为x轴，荧光数据为y轴)绘制曲线L1，得到校准后的，去除诸多影响因素后的PCR荧光曲线。
在一实施例中，在得到曲线L1后，可以得到更加准确的Ct值，故在步骤S105之后，还可以包括：
通过曲线L1计算采集样本的Ct值。
请参阅图5，在一实施例中，所述通过曲线L1计算采集样本的Ct值，包括：
S401：根据曲线L1计算荧光阈值；
S402：从曲线L1中的第一个循环数开始，依次比较所述循环数对应的所述荧光数据与所述荧光阈值的大小；
在本实施例中，从左到右逐一比较曲线L1上坐标点对应的荧光数据和荧光阈值的大小。
S403：判断所述循环数对应的所述荧光数据是否小于或等于所述荧光阈值；
S404：若是，则判定所述荧光阈值所在的点落在所述循环数和所述循环数的下一循环数之间；若否，则返回执行循环判断步骤；
在本实施例中，循环判断步骤为步骤S402和步骤S403。
S405：计算出穿过所述循环数和所述循环数的下一循环数分别对应的坐标点的直线方程；
S406：将所述荧光阈值作为因变量代入所述直线方程中，计算得到Ct值；
在本实施例中，Ct值的含义是反应皿内的荧光数据到达设定的荧光域值时所经历的循环数。
在一实施例中，步骤S401包括：
采用以下公式计算荧光阈值：
Figure BDA0003276796570000081
其中，Δym为曲线L0中的荧光数据的校准值，即曲线L1的荧光数据；n为基线期终点；i为基准线起点；
Figure BDA0003276796570000082
在本实施例中，计算荧光阈值，荧光阈值可根据具体情况进行设置。
现以一组实验的Ct计算结果展示效果示例：
其中，测试样本为相同浓度的样本。
样本序号 1 2 3 4 5 CV
优化前Ct 30.2 29.5 29.4 29.5 29.9 1.14％
优化后Ct 29.9 29.5 29.4 29.5 29.7 0.68％
表1
如表1所述，相比于直接使用3到15(一般的基线期终点不会变动太大，但这种方法适用性不强)作为基线期的方法(即优化前)，使用本方法后(优化后)相同浓度的样本Ct值的重复性(CV＝标准差/均值)从1.14％降低为0.68％，Ct值稳定性提升显著。
请参阅图6，一种自适应检测PCR荧光基线的装置10，包括：
绘制单元11，用于获取采集样本中的每个循环数m所对应的荧光数据fm，得到一系列坐标点(m，fm)，并基于一系列所述坐标点(m，fm)绘制曲线L0；
计算单元12，用于计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差；
判断单元13，用于判断当前循环数是否是基线期终点；
拟合单元14，用于判断当前循环数是基线期终点时，则对所述基线期起点到基线期终点之间的坐标点进行线性拟合，得到校准基线；
返回执行单元15，用于判断当前循环数不是基线期终点时，则返回执行基线期终点判断步骤；
校准单元16，用于通过所述校准基线对曲线L0进行基线校准，得到曲线L1。
本发明实施例还提供了一种计算机可读存储介质，其上存有计算机程序，该计算机程序被执行时可以实现上述实施例所提供的步骤。该存储介质可以包括：U盘、移动硬盘、只读存储器(Read-Only Memory，ROM)、随机存取存储器(Random Access Memory，RAM)、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
本发明实施例还提供了一种计算机设备，可以包括存储器和处理器，存储器中存有计算机程序，处理器调用存储器中的计算机程序时，可以实现上述实施例所提供的步骤。当然计算机设备还可以包括各种网络接口，电源等组件。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种自适应检测PCR荧光基线的方法，其特征在于，包括：
获取采集样本中的每个循环数m所对应的荧光数据fm，得到一系列坐标点(m，fm)，并基于一系列所述坐标点(m，fm)绘制曲线L0；
计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差，得到偏差值；
根据所述标准差和偏差判断当前循环数是否是基线期终点；
若是，则对所述基线期起点到基线期终点之间的坐标点进行线性拟合，得到校准基线；若否，则返回执行基线期终点判断步骤；
通过所述校准基线对曲线L0进行基线校准，得到曲线L1；
其中，所述根据所述标准差和偏差判断当前循环数是否是基线期终点，包括：
判断所述偏差值是否超过k倍所述标准差；
若是，则判定所述当前循环数为基线期终点；
若否，则将所述当前循环数的下一所述循环数作为当前循环数，并返回执行基线期终点判断步骤；
所述若否，则将所述当前循环数的下一所述循环数作为当前循环数，并返回执行基线期终点判断步骤，包括：
若所述偏差值未超过k倍所述标准差，则计算曲线L0中二阶导数最大的坐标点所对应的所述循环数，得到最大增速点；
判断所述当前循环数是否大于或等于所述最大增速点；
若是，则将所述最大增速点作为基线期终点；
若否，则将所述当前循环数的下一所述循环数作为当前循环数，并返回执行基线期终点判断步骤。
2.根据权利要求1所述的自适应检测PCR荧光基线的方法，其特征在于，所述计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差，包括：
将基线期起点往后第二个循环数作为当前循环数；
计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算所述当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值的偏差，得到偏差值；
其中，所述基线期起点为从初始的若干所述循环数中选取一个坐标点。
3.根据权利要求1所述的自适应检测PCR荧光基线的方法，其特征在于，所述通过所述校准基线对曲线L0进行基线校准，得到曲线L1，包括：
将曲线L0上的每个坐标点的荧光数据fm减去所述校准基线上对应所述循环数的y值得到荧光数据fm的校准值，基于每一循环数以及对应的荧光数据fm的校准值绘制得到曲线L1，其中，y值为所述校准基线的纵坐标值。
4.根据权利要求1所述的自适应检测PCR荧光基线的方法，其特征在于，所述通过所述校准基线对曲线L0进行基线校准，得到曲线L1之后，还包括：
通过曲线L1计算采集样本的Ct值。
5.根据权利要求4所述的自适应检测PCR荧光基线的方法，其特征在于，所述通过曲线L1计算采集样本的Ct值，包括：
根据曲线L1计算荧光阈值；
从曲线L1中的第一个循环数开始，依次比较所述循环数对应的所述荧光数据与所述荧光阈值的大小；
判断所述循环数对应的所述荧光数据是否小于或等于荧光阈值；
若是，则判定所述荧光阈值所在的点落在所述循环数和所述循环数的下一循环数之间；若否，则返回执行循环判断步骤；
计算出穿过所述循环数和所述循环数的下一循环数分别对应的坐标点的直线方程；
将所述荧光阈值作为因变量代入所述直线方程中，计算得到Ct值。
6.一种自适应检测PCR荧光基线的装置，其特征在于，包括：
绘制单元，用于获取采集样本中的每个循环数m所对应的荧光数据fm，得到一系列坐标点(m，fm)，并基于一系列所述坐标点(m，fm)绘制曲线L0；
计算单元，用于计算从基线期起点至当前循环数前的所有的所述荧光数据的均值和标准差，计算当前循环数对应的所述荧光数据与所述均值之间的偏差，得到偏差值；
判断单元，用于根据所述标准差和偏差判断当前循环数是否是基线期终点；
拟合单元，用于判断当前循环数是基线期终点时，则对所述基线期起点到基线期终点之间的坐标点进行线性拟合，得到校准基线；
返回执行单元，用于判断当前循环数不是基线期终点时，则返回执行基线期终点判断步骤；
校准单元，用于通过所述校准基线对曲线L0进行基线校准，得到曲线L1；
所述判断单元，包括：
第一判断子单元，用于判断所述偏差值是否超过k倍所述标准差；
第一执行单元，用于在所述偏差值超过k倍所述标准差时，判定所述当前循环数为基线期终点；
第二执行单元，用于在所述偏差值不超过k倍所述标准差时，将所述当前循环数的下一所述循环数作为当前循环数，并返回执行基线期终点判断步骤；
所述第二执行单元，包括：
第一计算单元，用于在若所述偏差值不超过k倍所述标准差时，计算曲线L0中二阶导数最大的坐标点所对应的所述循环数，得到最大增速点；
第二判断子单元，用于判断所述当前循环数是否大于或等于所述最大增速点；
第三执行单元，用于在当前循环数大于或等于所述最大增速点时，将所述最大增速点作为基线期终点；
第四执行单元，用于在当前循环数小于所述最大增速点时，将所述当前循环数的下一所述循环数作为当前循环数，并返回执行基线期终点判断步骤。
7.一种计算机设备，包括存储器、处理器及存储在所述存储器上并可在所述处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述计算机程序时实现如权利要求1至5中任一项所述的自适应检测PCR荧光基线的方法。
8.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质存储有计算机程序，所述计算机程序当被处理器执行时使所述处理器执行如权利要求1至5任一项所述的自适应检测PCR荧光基线的方法。
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