CN115270045A - 确定PCR扩增曲线Ct值的方法 - Google Patents

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CN115270045A CN202210963281.5A CN202210963281A CN115270045A CN 115270045 A CN115270045 A CN 115270045A CN 202210963281 A CN202210963281 A CN 202210963281A CN 115270045 A CN115270045 A CN 115270045A
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王超
刘玉凤
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Abstract

本发明公开了一种计算PCR扩增曲线Ct值的方法，识别原始PCR扩增曲线中波动点；在原始PCR扩增曲线中波动点的数量小于第一阈值时，则修正波动点及其之后各点的原始荧光数据，采用六参数模型对修正荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线，识别修正荧光数据的对数期和基线期；以基线期修正荧光数据标准差的10倍为阈值线，确定Ct值。在原始PCR扩增曲线中波动点的数量大于等于第一阈值时，则识别原始PCR扩增曲线的对数期和基线期；以基线期原始荧光数据标准差的10倍为阈值线，确定Ct值。本发明优点在于能够识别和处理PCR反应过程中荧光数据曲线的异常波动，准确识别PCR反应中对数期和基线期的方法，更精确的通过基线期获得背景荧光数据，准确确定Ct阈值，提高了Ct值的抗干扰能力。

Description

确定PCR扩增曲线Ct值的方法
技术领域
本发明涉及聚合酶链式反应领域，尤其是涉及确定PCR扩增曲线Ct值的方法。
背景技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定DNA/RNA片段的分子生物学技术。它可看作是生物体外的核酸复制。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号可以监测整个PCR进程。根据PCR反应特点，待测核酸物质会呈指数生长，考虑到荧光背景影响，荧光数据曲线应为S型曲线。通常通过循环数-荧光数据曲线拟合，再根据拟合曲线与阈值线计算Ct值。
在实际的PCR反应过程中，荧光数据曲线存在断崖、突变点、波动点特别多等情况，此时若直接进行循环数-荧光数据曲线拟合，则严重影响Ct值准确度，甚至导致假阴假阳。而当前确定Ct值的方法往往缺少对荧光数据曲线中断崖、突变点、波动点特别多等情况的识别和处理，严重影响Ct值准确度。
发明内容
本发明目的在于提供一种确定PCR扩增曲线Ct值的方法。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
本发明所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，包括以下步骤：
S1，识别原始PCR扩增曲线中波动点；
S2，在所述原始PCR扩增曲线中所述波动点的数量小于第一阈值时，则修正波动点及其之后各点的原始荧光数据，并与未修正的所述原始荧光数据合并形成修正荧光数据；采用六参数模型对所述修正荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线，并识别所述修正荧光数据的对数期和基线期；
在原始PCR扩增曲线中波动点的数量大于等于第一阈值时，则识别原始PCR扩增曲线的对数期和基线期，采用六参数模型对对数期和基线期内的原始荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线；
S3，将修正的PCR扩增曲线中各循环数对应的修正荧光数据减去背景荧光数据，得到归整化曲线；以阈值线与所述归整化曲线的交点所对应的所述循环数为Ct值。
本发明增加了对PCR扩增曲线中异常波动的原始荧光数据的识别与处理，基于波动点的数量多少，选择修正原始荧光数据后拟合确定对数期和基线期，或选择局部对数期和基线期的原始荧光数据拟合，通过基线期获取背景荧光数据，进而确定Ct阈值线。
进一步地，S1步中所述识别波动点包括：
S1.1，计算所述原始荧光数据或上次所述修正荧光数据的
Figure DEST_PATH_IMAGE001
值；
S1.2，当所述
Figure 116308DEST_PATH_IMAGE002
值大于预设的波动上限或小于预设的波动下限时，则所述原始PCR扩增曲线中第i所述循环数对应的点为所述波动点。
进一步地，S2步中所述修正波动点的原始荧光数据包括：
S2.1，取第一个所述波动点前N个循环数所述原始荧光数据或所述修正荧光数据的一阶差分均值为第一个波动点的合理差；
S2.2，计算第一个波动点的原始荧光数据与其上一相邻所述循环数对应的原始荧光数据或所述修正荧光数据的差值；
S2.3，将第一个波动点及其之后各点的原始荧光数据或修正荧光数据减去所述差值后，再加上所述合理差，作为第一个波动点及其之后各点的修正荧光数据；
S2.4，重复执行S1步识别波动点；
S2.5，重复执行S2.1至S2.4步，至到波动点消失或重复次数达到预设要求。
进一步地，所述六参数模型为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
，
其中，y为所述修正荧光数据，x为所述循环数，a、b、c、d、e、k为参数。
进一步地，所述对数期识别步骤为：
第一步，计算所述原始荧光数据或修正荧光数据的
Figure 370571DEST_PATH_IMAGE004
值；
第二步，依次判断所述
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE005
第二阈值且
Figure 670097DEST_PATH_IMAGE006
第二阈值成立时，记录第i所述循环数对应的点为对数期起点及终点；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE007
第二阈值且
Figure 575781DEST_PATH_IMAGE008
第二阈值成立时，则更新第i循环数对应的点为对数期终点；直到
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE009
第二阈值且
Figure 905131DEST_PATH_IMAGE010
第二阈值时，确定第i循环数对应的点为对数期终点；
第三步，对数期循环数的个数为：对数期终点-对数期起点+1，若所述对数期循环数的个数大于预设值，则记录对数期起点至对数期终点为一个对数期区段；
第四步，重新执行第二步，直到完成所有
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE011
值的判断为止，得到若干个所述对数期区段；
第五步，选择包含对数期循环数的个数最多的对数期区段为初始对数期；
第六步，依次计算初始对数期起点和终点原始荧光数据或修正荧光数据的
Figure 963086DEST_PATH_IMAGE012
和
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE013
值；
第七步，依次判断
Figure 195746DEST_PATH_IMAGE014
第三阈值或
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE015
第三阈值成立时，将第i-1循环数对应的点或第j+1循环数对应的点加入初始对数期，直到
Figure 313744DEST_PATH_IMAGE016
第三阈值或
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE017
第三阈值成立为止，确定对数期。
进一步地，所述基线期识别步骤为：
第一步，计算所述原始荧光数据或所述修正荧光数据的所述
Figure 553226DEST_PATH_IMAGE018
值；
第二步，依次判断，当首次满足第四阈值
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE019
第五阈值时，则记录第i循环数对应的点为基数期起点，直到首次出现
Figure 821397DEST_PATH_IMAGE020
第四阈值或
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE021
第五阈值时，记录第i循环数对应的点为基数期终点；
第三步，循环执行第二步，直到判断至所述对数期起点为止，得到若干个备选基线期；
第四步，将与对数期相邻的所述备选基线期作为基线期。
进一步地，所述背景荧光数据包括所述基线期的所述修正荧光数据的均值或最小值。
进一步地，所述阈值线包括所述基线期的所述修正荧光数据标准差的10倍。
进一步地，所述
Figure 141519DEST_PATH_IMAGE022
值的计算方法为：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE023
，
其中，
Figure 135146DEST_PATH_IMAGE024
为原始荧光数据标准差或修正荧光数据标准差，
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE025
为原始荧光数据或修正荧光数据，i为循环数，
Figure 360459DEST_PATH_IMAGE026
即为第i循环数所对应的原始荧光数据或修正荧光数据。
本发明优点在于能够识别和处理PCR反应过程中荧光数据曲线的异常波动，并对波动点荧光数据进行修正，并提出了准确识别PCR反应中对数期和基线期的方法，能够更精确的通过基线期获得背景荧光数据，进而准确确定Ct阈值线，提高了Ct值的抗干扰能力。
附图说明
图1是本发明所述方法流程图。
图2是本发明所述实施例1原始PCR扩增曲线示意图。
图3是本发明所述方法波动点识别修正流程图。
图4是本发明所述实施例1原始PCR扩增曲线中波动点修正后示意图。
图5是本发明所述实施例1六参数拟合示意图。
图6是本发明所述方法中确定初始对数期流程图。
图7是本发明所述方法中最终确定对数期流程图。
图8是本发明所述方法中确定基数期流程图。
图9是本发明所述实施例1中归整化曲线与阈值线示意图。
图10是本发明所述实施例2原始PCR扩增曲线示意图。
图11是本发明所述实施例2中归整化曲线与阈值线示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，包括PCR扩增曲线中断崖、突变点、波动点较少时确定Ct值的方法，以及PCR扩增曲线中断崖、突变点、波动点较多时确定Ct值的方法。
如图1所示，为本发明所述确定PCR扩增曲线Ct值的方法流程示意图。下面分别说明本发明在针对PCR扩增曲线中断崖、突变点、波动点较少时如何确定Ct值，以及本发明在针对PCR扩增曲线中断崖、突变点、波动点较多时如何确定Ct值。
实施例1，详细介绍了在PCR扩增曲线中断崖、突变点、波动点较少时确定Ct值的方法步骤。
如图2所示，原始PCR扩增曲线中断崖、突变点、波动点较少，对此次采集数据计算Ct值的方法步骤如下：
S1，识别原始PCR扩增曲线中波动点；依次计算每个原始荧光数据的
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE027
值；其中，
Figure 996102DEST_PATH_IMAGE028
值的计算方法为：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE029
，
Figure 764207DEST_PATH_IMAGE030
为原始荧光数据标准差，
Figure DEST_PATH_IMAGE031
为原始荧光数据，i为循环数，
Figure 663155DEST_PATH_IMAGE032
即为第i循环数所对应的原始荧光数据，
Figure DEST_PATH_IMAGE033
为第i循环数的
Figure 251131DEST_PATH_IMAGE034
值。
当
Figure DEST_PATH_IMAGE035
值大于预设的波动上限或小于预设的波动下限时，则原始PCR扩增曲线中第i循环数对应的点为所述波动点，记录原始PCR扩增曲线中波动点的数量和位置。针对图2所示数据，经过S1步计算，可以识别出第8个循环和21个循环处为波动点，数量仅为2，小于第一阈值。其中，第一阈值代表预设的波动点最大数量。然后执行S2步中波动点的数量小于第一阈值时的相关步骤。
S2，在原始PCR扩增曲线中波动点的数量小于第一阈值时，则修正波动点及该波动点之后各点的原始荧光数据，采用六参数模型对所有修正荧光数据和未修正的所述原始荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线，并识别修正荧光数据的对数期和基线期。
S2.1，首先，按循环数顺序取第一个波动点（即第8个循环数处）前N个点原始荧光数据的一阶差分均值为第一个波动点的合理差；N为自定义值，本实施例中选择N为3，即选择第5、6、7循环数处原始荧光数据的一阶差分均值为第8个循环数处荧光数据与第7个循环数出荧光数据的合理差。
S2.2，然后计算第一个波动点的原始荧光数据与其上一相邻循环数对应的原始荧光数据的差值；即差值等于第8个循环数处原始荧光数据减去第7个循环数处原始荧光数据。
S2.3，将第一个波动点及之后各点的原始荧光数据减去差值后，再加上合理差，作为第一个波动点及之后各点的所述修正荧光数据。即第8个及之后9-45各点循环数处原始荧光数据减去差值，再加上S2.1步中确定的合理差，即为第8个及之后9-45各点循环数处修正荧光数据。
S2.4，由于修正一个波动点及其之后各点处的原始荧光数据后，修正的荧光数据可能会产生新的断崖、突变点、波动点，因此需要重复执行S1步，重新识别波动点；
S2.5，然后再重复执行S2.1至S2.4步，直到波动点消失或重复次数达到预设要求。同时在重复执行S2.1步计算
Figure 690465DEST_PATH_IMAGE036
值时，需要采用上一轮修正荧光数据的标准差和修正荧光数据。
如图3所示，使用流程图展示了识别波动点和修正波动点的过程。
针对图2所示数据，修正第8个循环数及其之后各循环数处的原始荧光数据后，再次执行S1步时，可重新识别出第21个循环处为波动点，然后执行S2步中S2.1至S2.4步，直到执行S1步后，没有识别到新的波动点为止即波动点数量为0，或者重复执行次数已经到达预设的值时停止。如图4所示，展示了波动点修正后结果。
之后，采用六参数模型对所有荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线，其中所有荧光数据即包括修正荧光数据，也包括未经修正的原始荧光数据。六参数模型为：
Figure DEST_PATH_IMAGE037
，
其中，y为所述修正荧光数据，x为循环数，a、b、c、d、e、k为参数。如图5所示，为六参数模型拟合效果图。
然后识别修正荧光数据的对数期和基线期；
对数期识别步骤为：
第一步，计算修正荧光数据的
Figure 250760DEST_PATH_IMAGE038
值；
第二步，依次判断
Figure DEST_PATH_IMAGE039
第二阈值且
Figure 241980DEST_PATH_IMAGE040
第二阈值时，记录第i循环数对应的点为对数期起点及终点；
Figure DEST_PATH_IMAGE041
第二阈值且
Figure 582832DEST_PATH_IMAGE042
第二阈值时，则更新第i循环数对应的点为对数期终点；直到
Figure DEST_PATH_IMAGE043
第二阈值且
Figure 934179DEST_PATH_IMAGE044
第二阈值时，确定第i循环数对应的点为对数期终点；
第三步，对数期循环数的个数为：对数期终点-对数期起点+1；若对数期循环数的个数大于预设值，则记录对数期起点至对数期终点之间为一个对数期区段；
第四步，重新执行第二步，直到完成所有
Figure DEST_PATH_IMAGE045
值的判断为止，得到若干个对数期区段；
第五步，选择包含循环数的个数最多的区段为初始对数期；如图6所示为确定初始对数期流程图
第六步，依次计算初始对数期起点和终点修正荧光数据的
Figure 924480DEST_PATH_IMAGE046
和
Figure DEST_PATH_IMAGE047
值；
第七步，依次判断
Figure 663766DEST_PATH_IMAGE048
第三阈值或
Figure DEST_PATH_IMAGE049
第三阈值时，将第i-1循环数对应的点或第j+1循环数对应的点加入初始对数期，直到
Figure 226334DEST_PATH_IMAGE050
第三阈值或
Figure DEST_PATH_IMAGE051
第三阈值为止，确定对数期。如图7所示为最终确定对数期流程图。
即先计算初始对数期起点修正荧光数据的
Figure 210733DEST_PATH_IMAGE052
值；依次判断
Figure DEST_PATH_IMAGE053
第三阈值成立时，将第i-1循环数对应的点加入初始对数期，直到首次出现
Figure 666991DEST_PATH_IMAGE054
第三阈值成立时终止判断。同样的，计算初始对数期终点修正荧光数据的
Figure DEST_PATH_IMAGE055
值，依次判断
Figure 344222DEST_PATH_IMAGE056
第三阈值成立时，将第j+1循环数对应的点加入初始对数期，直到首次出现
Figure DEST_PATH_IMAGE057
第三阈值成立时终止判断，确定最终对数期。其中第二阈值大于第三阈值，通过第二阈值可以精确的识别PCR扩增过程中的对数期，通过第三阈值能够将PCR扩增过程中应属于对数期开始和结束段的数据纳入对数期，使最终确定的对数期与实际情况更加切合，避免遗漏相关数据。
如图8所示，基线期识别步骤为：
第一步，计算修正荧光数据的
Figure 331770DEST_PATH_IMAGE058
值；
第二步，依次判断，当首次满足第四阈值
Figure DEST_PATH_IMAGE059
第五阈值时，则记录第i循环数对应的点为基数期起点，直到出现
Figure 415133DEST_PATH_IMAGE060
第四阈值或
Figure DEST_PATH_IMAGE061
第五阈值时，记录第i循环数对应的点为基数期终点；
第三步，循环执行第二步，直到判断点为最终对数期起点为止，得到若干个备选基线期；
第四步，将与对数期相邻的基线期作为基线期。
第四阈值代表预设的基线期限制下限，第五阈值代表预设的基线期限制上限，第四阈值小于第五阈值。根据基线期识别步骤可知，依次判断修正荧光数据的
Figure 40411DEST_PATH_IMAGE062
值，当首次出现
Figure DEST_PATH_IMAGE063
值在第四阈值和第五阈值范围内时，该第i循环数对应的点为基数期起点；当首次出现
Figure 121500DEST_PATH_IMAGE027
值在第四阈值和第五阈值范围外时，该第i循环数对应的点为基数期终点；两个循环数之间为1个基线期。继续循环执行，直到判断至最终对数期起点为止，该过程可以得到若干个基线期。将对数期相邻的基线期作为基线期。
然后执行S3步。
S3，将修正的PCR扩增曲线中各循环数对应的修正荧光数据减去背景荧光数据，得到归整化曲线；以阈值线与所述归整化曲线的交点所对应的所述循环数为Ct值。其中背景荧光数据包括基线期的修正荧光数据的均值或最小值。阈值线包括基线期的修正荧光数据标准差的10倍。
针对图2所示的数据，确定最终基线期为第1循环数至第39循环数，对数期为第40循环数至第45循环数。进一步确定归整化曲线如图9所示的曲线；阈值线的值为10倍的基线期修正荧光数据标准差，如图9所示的直线，为161.24，确定Ct值为41.79。
实施例2 详细介绍了在PCR扩增曲线中断崖、突变点、波动点较多时确定Ct值的方法步骤。
如图10所示，可以看出原始PCR扩增曲线中有多原始荧光数据突然大幅度下降、上升、突变的情况，对此次采集数据计算Ct值的方法步骤如下：
S1，识别原始PCR扩增曲线中波动点；依次计算每个原始荧光数据的
Figure 534026DEST_PATH_IMAGE064
值；其中，
Figure 624342DEST_PATH_IMAGE028
值的计算方法为：
Figure DEST_PATH_IMAGE065
，
Figure 602663DEST_PATH_IMAGE066
为原始荧光数据标准差，
Figure DEST_PATH_IMAGE067
为原始荧光数据，i为循环数，
Figure 356117DEST_PATH_IMAGE068
即为第i循环数所对应的原始荧光数据，
Figure DEST_PATH_IMAGE069
为第i循环数的
Figure 380574DEST_PATH_IMAGE070
值。
当
Figure DEST_PATH_IMAGE071
值大于预设的波动上限或小于预设的波动下限时，则原始PCR扩增曲线中第i循环数对应的点为所述波动点，记录原始PCR扩增曲线中波动点的数量和位置。根据图9所示，经过S1步计算，可以识别出第9、10、27、28、29、31循环数处共6个波动点，该数量大于第一阈值，需执行S2步中关于波动点的数量大于等于第一阈值时的相关步骤。
S2，在原始PCR扩增曲线中波动点的数量大于等于第一阈值时，则识别原始PCR扩增曲线的对数期和基线期，采用六参数模型对对数期和基线期内的原始荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线；
首先识别原始PCR扩增曲线的对数期和基线期；
对数期识别步骤为：
第一步，计算原始荧光数据的
Figure 369521DEST_PATH_IMAGE072
值；
第二步，依次判断
Figure DEST_PATH_IMAGE073
第二阈值且
Figure 733506DEST_PATH_IMAGE074
第二阈值时，记录第i循环数对应的点为对数期起点及终点；
Figure DEST_PATH_IMAGE075
第二阈值且
Figure 218714DEST_PATH_IMAGE076
第二阈值时，则更新第i循环数对应的点为对数期终点；直到
Figure DEST_PATH_IMAGE077
第二阈值且
Figure 904035DEST_PATH_IMAGE078
第二阈值时，确定第i循环数对应的点为对数期终点；
第三步，对数期循环数的个数为：对数期终点-对数期起点+1；若对数期循环数的个数大于预设值，则记录对数期起点至对数期终点之间为一个对数期区段；
第四步，重新执行第二步，直到完成所有
Figure DEST_PATH_IMAGE079
值的判断为止，得到若干个对数期区段；
第五步，选择包含循环数的个数最多的区段为初始对数期；
第六步，依次计算初始对数期起点和终点修正荧光数据的
Figure 336154DEST_PATH_IMAGE080
和
Figure DEST_PATH_IMAGE081
值；
第七步，依次判断
Figure 289066DEST_PATH_IMAGE082
第三阈值或
Figure DEST_PATH_IMAGE083
第三阈值时，将第i-1循环数对应的点或第j+1循环数对应的点加入初始对数期，直到
Figure 882859DEST_PATH_IMAGE084
第三阈值或
Figure DEST_PATH_IMAGE085
第三阈值为止，确定最终对数期。
即先计算初始对数期起点原始荧光数据的
Figure 117793DEST_PATH_IMAGE086
值；依次判断
Figure DEST_PATH_IMAGE087
第三阈值成立时，将第i-1循环数对应的点加入初始对数期，直到首次出现
Figure 353602DEST_PATH_IMAGE088
第三阈值成立时终止判断。同样的，计算初始对数期终点原始荧光数据的
Figure DEST_PATH_IMAGE089
值，依次判断
Figure 161021DEST_PATH_IMAGE090
第三阈值成立时，将第j+1循环数对应的点加入初始对数期，直到首次出现
Figure DEST_PATH_IMAGE091
第三阈值成立时终止判断，确定最终对数期。其中第二阈值大于第三阈值，通过第二阈值可以精确的识别PCR扩增过程中的对数期，通过第三阈值能够将PCR扩增过程中应属于对数期开始和结束段的数据纳入对数期，使最终确定的对数期与实际情况更加切合，避免遗漏相关数据。
基线期识别步骤为：
第一步，计算原始荧光数据的
Figure 743357DEST_PATH_IMAGE092
值；
第二步，依次判断，当首次满足第四阈值
Figure DEST_PATH_IMAGE093
第五阈值时，则记录第i循环数对应的点为基数期起点，直到出现
Figure 760861DEST_PATH_IMAGE094
第四阈值或
Figure DEST_PATH_IMAGE095
第五阈值时，记录第i循环数对应的点为基数期终点；
第三步，循环执行第二步，直到判断点为最终对数期起点为止，得到若干个基线期；
第四步，将与对数期相邻的基线期作为最终基线期。
第四阈值代表预设的基线期限制下限，第五阈值代表预设的基线期限制上限，第四阈值小于第五阈值。根据基线期识别步骤可知，依次判断原始荧光数据的
Figure 36247DEST_PATH_IMAGE096
值，当首次出现
Figure DEST_PATH_IMAGE097
值在第四阈值和第五阈值范围内时，该第i循环数对应的点为基数期起点；当首次出现
Figure 963751DEST_PATH_IMAGE098
值在第四阈值和第五阈值范围外时，该第i循环数对应的点为基数期终点；两个循环数之间为1个基线期。继续循环执行，直到判断至最终对数期起点为止，该过程可以得到若干个基线期。将对数期相邻的基线期作为最终基线期。
之后，采用六参数模型对基线期和对数期所有荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线。六参数模型为：
Figure DEST_PATH_IMAGE099
，
其中，y为所述原始荧光数据，x为循环数，a、b、c、d、e、k为参数。如图3所示，为六参数模型拟合效果图。
然后执行S3步。
S3，将修正的PCR扩增曲线中各循环数对应的修正荧光数据减去背景荧光数据，得到归整化曲线；以阈值线与所述归整化曲线的交点所对应的所述循环数为Ct值。其中背景荧光数据包括基线期的修正荧光数据的均值或最小值。阈值线包括基线期的原始荧光数据标准差的10倍。
针对图10所示的数据，确定最终基线期为第12循环数至第25循环数，对数期为第35循环数至第45循环数。进一步确定归整化曲线如图11所示的曲线；阈值线的值为10倍的基线期原始荧光数据标准差，为31.73，如图11所示的直线，确定Ct值为33.46。

Claims (9)

1.一种确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，识别原始PCR扩增曲线中波动点；
S2，在所述原始PCR扩增曲线中所述波动点的数量小于第一阈值时，则修正波动点及其之后各点的原始荧光数据，并与未修正的所述原始荧光数据合并形成修正荧光数据；采用六参数模型对所述修正荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线，并识别所述修正荧光数据的对数期和基线期；
在原始PCR扩增曲线中波动点的数量大于等于第一阈值时，则识别原始PCR扩增曲线的对数期和基线期，采用六参数模型对对数期和基线期内的原始荧光数据拟合得到修正的PCR扩增曲线；
S3，将修正的PCR扩增曲线中各循环数对应的修正荧光数据减去背景荧光数据，得到归整化曲线；以阈值线与所述归整化曲线的交点所对应的所述循环数为Ct值。
2.根据权利要求1所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：S1步中所述识别波动点包括：
S1.1，计算所述原始荧光数据或上次所述修正荧光数据的
Figure 965507DEST_PATH_IMAGE002
值；
S1.2，当所述
Figure 682927DEST_PATH_IMAGE004
值大于预设的波动上限或小于预设的波动下限时，则所述原始PCR扩增曲线中第i所述循环数对应的点为所述波动点。
3.根据权利要求1所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：S2步中所述修正波动点的原始荧光数据包括：
S2.1，取第一个所述波动点前N个循环数所述原始荧光数据或所述修正荧光数据的一阶差分均值为第一个波动点的合理差；
S2.2，计算第一个波动点的原始荧光数据与其上一相邻所述循环数对应的原始荧光数据或所述修正荧光数据的差值；
S2.3，将第一个波动点及其之后各点的原始荧光数据或修正荧光数据减去所述差值后，再加上所述合理差，作为第一个波动点及其之后各点的修正荧光数据；
S2.4，重复执行S1步识别波动点；
S2.5，重复执行S2.1至S2.4步，至到波动点消失或重复次数达到预设要求。
4.根据权利要求1所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：所述六参数模型为：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
，
其中，y为所述修正荧光数据，x为所述循环数，a、b、c、d、e、k为参数。
5.根据权利要求1所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：所述对数期识别步骤为：
第一步，计算所述原始荧光数据或修正荧光数据的
Figure 392651DEST_PATH_IMAGE006
值；
第二步，依次判断所述
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 488914DEST_PATH_IMAGE008
第二阈值且
Figure DEST_PATH_IMAGE009
第二阈值成立时，记录第i所述循环数对应的点为对数期起点及终点；
Figure 622961DEST_PATH_IMAGE010
第二阈值且
Figure DEST_PATH_IMAGE011
第二阈值成立时，则更新第i循环数对应的点为对数期终点；直到
Figure 12965DEST_PATH_IMAGE012
第二阈值且
Figure DEST_PATH_IMAGE013
第二阈值时，确定第i循环数对应的点为对数期终点；
第三步，对数期循环数的个数为：对数期终点-对数期起点+1，若所述对数期循环数的个数大于预设值，则记录对数期起点至对数期终点为一个对数期区段；
第四步，重新执行第二步，直到完成所有
Figure 821652DEST_PATH_IMAGE014
值的判断为止，得到若干个所述对数期区段；
第五步，选择包含对数期循环数的个数最多的对数期区段为初始对数期；
第六步，依次计算初始对数期起点和终点原始荧光数据或修正荧光数据的
Figure DEST_PATH_IMAGE015
和
Figure 802115DEST_PATH_IMAGE016
值；
第七步，依次判断
Figure DEST_PATH_IMAGE017
第三阈值或
Figure 906731DEST_PATH_IMAGE018
第三阈值成立时，将第i-1循环数对应的点或第j+1循环数对应的点加入初始对数期，直到
Figure DEST_PATH_IMAGE019
第三阈值或
Figure 536426DEST_PATH_IMAGE020
第三阈值成立为止，确定对数期。
6.根据权利要求1所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：所述基线期识别步骤为：
第一步，计算所述原始荧光数据或所述修正荧光数据的所述
Figure DEST_PATH_IMAGE021
值；
第二步，依次判断，当首次满足第四阈值
Figure 319443DEST_PATH_IMAGE022
第五阈值时，则记录第i循环数对应的点为基数期起点，直到首次出现
Figure DEST_PATH_IMAGE023
第四阈值或
Figure 718195DEST_PATH_IMAGE024
第五阈值时，记录第i循环数对应的点为基数期终点；
第三步，循环执行第二步，直到判断至所述对数期起点为止，得到若干个备选基线期；
第四步，将与对数期相邻的所述备选基线期作为基线期。
7.根据权利要求1所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：所述背景荧光数据包括所述基线期的所述修正荧光数据的均值或最小值。
8.根据权利要求1所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：所述阈值线包括所述基线期的所述修正荧光数据标准差的10倍。
9.根据权利要求1所述的确定PCR扩增曲线Ct值的方法，其特征在于：所述
Figure DEST_PATH_IMAGE025
值的计算方法为：
Figure 259291DEST_PATH_IMAGE026
，
其中，
Figure DEST_PATH_IMAGE027
为原始荧光数据标准差或修正荧光数据标准差，
Figure 376283DEST_PATH_IMAGE028
为原始荧光数据或修正荧光数据，i为循环数，
Figure DEST_PATH_IMAGE029
即为第i循环数所对应的原始荧光数据或修正荧光数据。
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CN117153257A (zh) * 2023-10-27 2023-12-01 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司 Pcr扩增曲线有效扩增的实时判定方法及装置

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