CN101037711B

CN101037711B - 分析方法和仪器

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Publication number: CN101037711B
Application number: CN2006101723516A
Authority: CN
Inventors: R·克诺贝尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2005-12-19
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2026-12-18
Also published as: US8239137B2; JP2007188484A; CN101037711A; CA2571454A1; HK1109787A1; ATE479152T1; EP1798652B1; CA2571454C; US20070166744A1; EP1798652B8; EP1798652A1; ES2349107T3; ES2349107T8; JP4718431B2; DE602006016397D1; EP1798650A1

Abstract

本发明的主题是一种利用基于数学模型的特定算法来确定分析物的方法，该数学模型用于将测量数据变换成生长曲线，并且本发明的主题是包括用于更精确地确定分析物的计算单元的分析仪器。

Description

分析方法和仪器

技术领域

本发明的主题是用于确定分析物的存在的方法和能够执行所述方法的分析仪器。

背景技术

本发明在分析学或诊断学领域中是有用的，特别是在核酸的诊断中是有用的。通过如在EP 0 200 362和EP 0 201 184中所公开的聚合酶链反应(PCR)的发明已经显著改进了核酸的分析。在该方法过程期间，核酸的量至少部分地按指数规律增加，因为在理论上根据在每个反应周期中存在于反应混合物中的每个核酸序列产生附加的核酸，并且每个所述序列可以充当用于产生随后的反应周期中的又一核酸序列的模板。通过被包括在反应混合物中的反应物(象酶、引物和核苷酸)的量限制所产生的核酸的量。因此，相对于PCR的时间或周期数而绘出的浓度类似(不对称的)S形曲线。

PCR的进一步的改进是所谓的实时PCR。在该方法中，在扩增期间产生并检测信号。该信号代表在扩增期间所产生的核酸的量，并因此存在于反应混合物中。在(例如在EP 0 512 334中所公开的)第一实施例中，通过能够插入双链核酸同时改变其荧光属性的化合物产生该信号。在(如在EP 0 543 942中所公开的)另一实施例中，引物的每个延伸反应导致探针的裂开(cleavage)，该探针的裂开通过猝灭剂和发射器染色(emitter dye)来标记，以致当裂开探针时，猝灭剂不能熄灭指示器染色的光发射，以便可以检测到信号。

确定最初存在于扩增之前的试样中的核酸的量(量化或定量)已经是若干种研究的目标。通常，量越高，需要用以接收信号的所限定的强度(阈值)的反应周期数就越小。因此，最早的计算基于阈值周期(C_T)值的确定。C_T值越高，存在的核酸的初始量就越低。明显地，实施的反应周期的(整)数可以仅是最初存在的量的非常粗略的估计。因此，在确定浓度的进一步尝试中，(线性或用对数)内插位于各别的测量数据之间的信号强度。在不精确的信号测量或甚至测量异常值(峰值)的情况下，这种基于内插的方法具有一些缺陷。为了避免该缺陷，建立算法，以在扩增反应期间从限定数量的测量中产生连续的生长曲线。算法的一个例子是所谓的Sawitzky Golay滤波器。得到的曲线被称为生长曲线。在EP 0 686 699中描述了一种条件递归公式，该条件递归公式可被用于将所测量的数据拟合成理论曲线。然而，该申请是棘手的，并且没有描述拟合过程。该申请在某些情况下会导致强参数相关和不精确的结果。

在WO 97/46714中公开了监控聚合酶链反应(PCR)之后的杂交的方法。特别地，该申请公开了，通过用以控制非特定扩增的产品熔融曲线的分析，以及通过非线性回归拟合Levenberg-Marquard曲线拟合算法可以增大利用荧光与周期数曲线图的初始模板量化的灵敏度。然而，在本文献中，描述了用以指引PCR扩增检测(荧光与周期数曲线图)的任何回归方法的应用。

在Biotechnology Letters(第24期，2002年，第2053-2056页)中公开了一种利用四个参数化S形模型来确定RT-PCR的扩增效率的方法。

在Biochemical and Biophysical Research Communications(第294期，2002年，第347-353页)中也描述了一种用于确定PCR的效率的PCR模拟方法。

特别是在通常对精确的结果计算要求严格的领域中，这两个在数学上等效的四参数模型提供了有限的精确度。迫使基线是恒定的，并且简单的S形项不能够近似通常的生长曲线的完全复杂度。因此，利用有限的精确度近似指数生长期，如在两篇论文的图示中可在视觉上观察到的那样。这导致具有有限精确度的结果，例如C_T。

发明内容

本发明的目的是改进定量分析，特别是提供利用更好地估计整个生长曲线的数学计算的全自动方法，特别是正确的测量不精确性和可能的测量峰值。

在第一实施例中，本发明涉及一种用于确定在试样中存在核酸的方法，该方法包括：

-提供包含所述核酸的反应混合物，

-以已知间隔检测来自所述反应混合物的信号，

-将所述信号变换成测量数据，以及

-通过数学算法根据所述测量数据产生生长曲线，

其中，所述数学算法包括基于5和11个参数之间的参数的数学生长曲线模型公式，并且其中通过对所述测量数据应用回归拟合算法而确定所述参数的最佳值，所述生长曲线模型公式至少包括：

-背景曲线估计，

-饱和曲线估计，以及

-依据下面公式的中间生长曲线估计

1/(1+exp(-p₄(x-p₅)))/(1+exp(-p₆(x-p₇)))

其中

p₄是表示指数生长的第一倍增S形函数的拐点处的斜率，

p₅是第一倍增S形函数的拐点，

p₆是表示饱和生长的第二倍增S形函数的拐点处的斜率，以及

p₇是第二倍增S形函数的拐点。

本发明的另一主题是一种用于确定在试样中存在分析物的分析仪器，该分析仪器包括：

-光源，

-信号检测单元，

-信号至测量数据变换单元，

-测量数据存储器，

-测量数据至生长曲线变换单元，以及

-生长曲线解释单元，

其中，所述测量数据至生长曲线变换单元包括计算机，该计算机装载有利用数学算法将生长曲线非线性回归拟合成测量数据的全自动算法，所述数学算法包括基于5和11个参数之间的参数的数学生长曲线模型公式，其中通过对所述测量数据应用回归拟合算法而确定所述参数的最佳值，并且其中所述生长曲线模型公式至少包括：

-背景曲线估计，

-饱和曲线估计，以及

-依据下面公式的中间生长曲线估计

1/(1+exp(-p₄(x-p₅)))/(1+exp(-p₆(x-p₇)))

其中

p₄是表示指数生长的第一倍增S形函数的拐点处的斜率，

p₅是第一倍增S形函数的拐点，

p₇是第二倍增S形函数的拐点。

本发明的另一主题是一种用于根据测量数据确定存在分析物的计算机程序，该计算机程序包括：

-通过数学算法根据测量数据产生生长曲线，

-背景曲线估计，

-饱和曲线估计，以及

-依据下面公式的中间生长曲线估计

1/(1+exp(-p₄(x-p₅)))/(1+exp(-p₆(x-p₇)))

其中

p₄是表示指数生长的第一倍增S形函数的拐点处的斜率，

p₅是第一倍增S形函数的拐点，

p₇是第二倍增S形函数的拐点。

附图说明

在图1中描述了示出示范性模型参数的生长曲线。

在图2中示出了具有指数生长期曲线、部分饱和S形曲线和有助于生长曲线模型的基线的生长曲线。

在图3中描述了对本发明的方法与线性模型的F测试的图形表示。

在图4中描述了将p₂和p₃/p₁用作内部控制信号的参数的典型值，该内部控制信号作为用于试样中的试剂失效和/或增加的红细胞含量的量度。

具体实施方式

在本发明对于对任何分析物的确定是有用的同时，在下面大部分情况下，本发明示例性地被用于确定核酸。用于确定在试样中存在核酸的方法通常是已知的。这些方法通常基于检测核酸探针(例如低核苷酸)与要被确定的核酸的杂交的发生，也就是杂种的形成。然而，也存在利用检测其他化学化合物与要被确定的核酸或与从其获得的化合物的相互作用的方法，例如检测将插入染料插入到双链核酸中的发生。本发明提供了通过在一个周期时间上跟踪反应过程来确定分析物的手段，例如通过收集收集从所述跟踪接收到的数据和解释接收到的数据来确定分析物的手段。因此，本发明对于反应的跟踪是特别有用的，其中试样中的可检测的变化是存在于所述试样中的分析物不存在、存在或/和量的量度。那些确定也被称为动力学确定。

本发明的定义的试样是包含分析物的液体，例如包含核酸或/和从其得到的任何核酸，例如包含扩增反应的任何产品，其中要确定核酸的存在。初始试样可以或不可以包含初始浓度或量的分析物。本发明能够确定是否完全存在分析物。本发明也支持和改进了其中初始试样包含多少量或浓度的所述分析物的确定。测量数据的预处理导致连续的统计学不精确度自由生长曲线。从那里获得的定量量度(例如C_T)具有相比当前方法的提高的稳定性和精度。

试样也可以是通过去除或添加化合物而从初始试样获得的液体。例如广泛地认识到，如果隔离或提纯核酸，并其后在允许进行确定的液体中溶解，则改进了试样中核酸的确定。这种核酸提纯通常对本领域的熟练技术人员是公知的。也熟知的是，最初在试样中存在的核酸的量与存在于从所述初始试样获得的试样中的核酸的量相关。而且，也公知从存在于从那里获得的试样的核酸的量或浓度推断所述初始试样体积中的核酸的浓度。

可以从任何源获得初始试样。在卫生保健中，公共试样是从身体(优选的人体)获得的试样(诸如血液或尿)或从那里得到的试样(象血清或血浆)。在食品分析中，试样可以是直接液体(诸如汁液)，但也可以是从固态试样获得的液体，象来自水果、干酪或肉类的提取物。

如上面所提及的那样，多种试样、特别是核酸确定领域中的试样需要有助于分析的从试样中的化合物隔离分析物。这种隔离对本领域的熟练技术人员是公知的。

依据本发明的方法包括对需用于发生反应的试剂和所有化合物添加试样，因此产生反应混合物。该反应混合物是检测的对象。在该方法的检测部分期间可以提供反应混合物，但优选地在检测的开始之前完成。

本发明包括从反应混合物中检测信号。该信号应与反应发生相关，即使有的话，该信号在反应混合物中。因此，在依据本发明的过程中可以监控任何反应，在该反应期间可产生可被检测到的信号。该信号可以是例如电化学地或电磁地可检测的任何信号。优选地，该信号是电磁信号，更优选的是有特定特征的电磁波，诸如光，该电磁波对人眼睛可视或不可视的。用于检测这种信号的仪器或装置通常在现有技术中是公知的。

用于确定核酸的优选方法包括要被检测的核酸序列的扩增。用于核酸的扩增的方法之一是聚合酶链反应(PCR，在EP 0 201 184和EP200 362中所公开的)。该方法是包括反应周期的过程，该反应周期包括使反应混合物中的双链核酸遭受可逆变性条件的步骤，例如通过加热到高于双链核酸的熔融温度之上，对所准备的每个单链核酸的引物退火，并利用作为新近形成的序列的模板的单链核酸的序列，通过将单核苷酸附到所述引物的末端来延伸引物。利用较早周期的延伸产品作为下一周期中的引物的延伸的模板，重复该反应周期如所期望的那么多次，以准备如需要允许其检测的那么多种延伸产品。已证明便利地在10次和100次之间重复反应周期，更优选在20次和60次之间重复反应周期。需用于可检测的核酸产生的周期的量可以取决于要被确定的核酸的量。例如，对于通常以非常微小的量存在于试样中的分析物核酸，象在感染有艾滋病病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)的情况下那样，实施分析将被预期比对于通常以较高浓度存在的分析物进行更多周期。这些考虑对本领域的熟练技术人员是公知的。

优选地，反应混合物中的核酸的扩增是所监控的反应。在这种情况下，核酸的量的增加、特别是那些代表分析物核酸的存在或/和量的增加与在反应过程期间要被检测的信号相关。那些基于PCR的方法通常被称作动力学PCR。优选的反应是在EP 0 512 334、EP 0 543 942和WO 97/46714中所公开的那些反应。

该信号可以是在反应过程期间没有任何进一步作用地产生的信号，也就是通过反应所释放的能量引起的反应混合物的温度的上升。在优选模式中，试样遭受来自外部的影响，例如通过给反应混合物提供能量产生的影响。通常以从反应混合物提供信号的形式提供该能量，该信号例如被包含在混合物中的标记，这与出现于反应混合物中的反应的过程相关。在一个优选实施例中，通过对反应混合物施加光辐射来提供能量。该光应具有激发来自涉及反应发生的反应混合物的信号的属性。

在优选模式中，该信号是逸出反应混合物的光。在利用光辐射反应混合物的情况下，该光可以具有与被用于辐射的光相同的特征。然后，检测是吸收检测。在优选模式中，逸出反应混合物的光不同于辐射光。在这种情况下，优选地通过荧光过程产生逸出光。该荧光可被检测为反应过程的量度。

以已知的间隔检测该信号。间隔是随后的检测之间的距离，优选地不计数副本(duplicate)。选择那些间隔，以充分监控反应的过程或在所述试样中所执行的多个反应。因此，优选地在反应过程期间检测信号。当可以与反应的开始一起开始检测时，这是不需要的。当反应已完成时可以停止检测，但也可以较早地停止检测，或可以在反应完成之后继续一些时间。本领域的熟练技术人员将已知，当再也没有信号的明显改变时，可以停止检测。

通常，以其来检测信号的间隔将取决于期望的确定精度。通常，间隔越短，精度将越高。对于动力学PCR，优选地，用于信号检测的每个间隔的长度与一个反应周期的时间相符。因为反应周期的长度优选的是相等的，该间隔也将是相同的。应理解，通过非常短的时间(明显短于如上面所提及的间隔，例如仅低1％)内的一系列测量可以组成每次检测。优选地，在PCR中，在每个周期的平坦阶段期间，多于一次地检测信号，优选地在2与10次之间。特定周期中的平坦阶段是其中反应混合物的温度基本上不随着时间改变的阶段。通常，这是每个周期的退火阶段。这可被用于排除仪器错误。对于PCR，一个间隔的长度将优选地在0.1秒与1小时之间，更优选地在1秒与10分钟之间，并且最优选地在5秒与1分钟之间。

在其他方法中，象在NASBA或SDA中，周期不可通过各别的过程步骤明显地相互分离。因此，可以更慎重地选择用于检测信号的间隔。例如，在这种反应期间的间隔可以是在0.1秒直至2分钟之间，更优选地在1秒与1分钟之间，并且最优选地在2秒与20秒之间。

由于没有进一步诱因的反应，在该反应期间可以产生信号。优选地，通过给反应混合物提供能量(诸如电化学或电磁能量)来感应信号。优选地，依据本发明的方法包括利用电磁波照射反应混合物，更优选地利用光来照射反应混合物。优选地这样选择光，以致该光与依赖于要被监控的反应进度的反应混合物中的化合物相互作用。优选地，将反应的任何化合物或与反应的化合物相关的化合物设计成吸收被照射到反应混合物的光。因此，优选的方法基于利用具有特定特征的光照射试样和检测逸出所述试样的光。

照射(imping)到所述试样上的光的特性取决于试样的特定格式和化合物。对本领域的熟练技术人员公知的化验格式利用吸光标记(例如被附到为与要被确定的核酸杂交而设计的探针的标记)或吸光化学化合物。那些格式包括可检测的属性(例如通过试样的成分随时间的改变引起的属性)的改变，优选地包括光的吸收或发射。通过在反应时间期间检测从所述试样接收到的信号确定通过所述反应引起的属性的变化。在基于杂交的格式中，检测涉及一个或多个标记的信号，这些标记被附到与要确定其存在的核酸或从那里获得的核酸杂交的探针。

在EP 0 512 334和EP 0 543 942中公开了利用本发明方法可以跟踪的优选反应，上述申请的关于运行那些反应的条件的公开内容在此被并入。

每个信号然后被变换成测量数据。这优选的是可被电子存储到存储器中的数字号码。合适的存储器公知为计算机商业中的存储器，例如个人计算机中的存储器。依据在本领域中广泛已知的方法完成该变换，例如模拟/数字变换器。从所述存储器中可以读取测量数据，以成为利用那些数据的计算的对象。在该过程期间，该数据可遭受进一步的操纵，例如遭受暗信号校正和多信道分辨率。其结果将被称为测量数据。

在下一步骤中，将测量数据变换成连续的生长曲线。本发明的核心方面在于通过利用使用5和11个参数之间的参数的数学非线性生长曲线模型公式和用于将生长曲线非线性回归拟合到测量数据的算法完成该变换。非线性公式是不基于参数的线性关系的公式。在D.M.Bates、D.G.Watts的Nonlinear Regression Analysis and itsApplications(Wiley，1988年)中以通用术语描述了非线性回归。

生长曲线模型是描述了根据时间变量的信号函数的连续相关性的数学公式。该信号值被定义为检测到的信号的量度。时间变量被定义为当测量信号时的整数周期数及其连续延伸。优选地，该模型包括在7和10之间，并且优选地包括9个参数，这9个参数包括信号值和时间变量。已经发现该数量的参数适当精确地近似真实的生长曲线，但并不过参数其(参数之间的高相关性)。

更优选地，从包括测量数据(信号)、时间(周期数)、基线截距、相对漂移、生长、斜率1、弯曲1、斜率2、弯曲2和描述了曲线特征的另一参数的组中选择参数。更优选地，参数是测量数据(信号)、时间(周期数)、基线截距、相对漂移、生长、斜率1、弯曲1、斜率2和弯曲2。从表1可以获得细节和优选的限定。

表1：

参数	维	名称	描述
				f	Y	测量数据(荧光信号)	相对荧光单元
x	X	时间，周期数	数据点，整数
				p₁	Y	基线截距	未熄灭的信号部分
p₂	1/X	相对漂移	线性负信号的斜率
				p₃	ΔY	负信号以上的饱和的生长	荧光增量
p₄	1/X	斜率1	＜ln(2)
				p₅	X	弯曲1	指数阶段
p₆	1/X	斜率2	＞0
				p₇	X	弯曲2	生长中部
p₈	Y	(可选的)步长参数	步长尺寸

当从测量数据可得到信号值(来自测量的输入)和时间变量时，通过应用非线性回归算法确定其它参数。参数p₁基本上表示在可选的步骤(参见p₈)之后与y轴的生长曲线的截距。附加项p₃/(1+exp(p₄p₅))/(1+exp(p₆p₇))在该定义中是可忽略的。参数p₂表示每周期的负基线的相对漂移。参数p₃表示基线上的值的最大生长的估计。参数p₄表示早期指数阶段中的近似S形函数的斜率。Exp(p₄)是在该阶段中的扩增效率的估计，该阶段意味着，对于PCR，p₄典型地小于ln(2)。相关参数p₅表示部分S形函数的拐点。参数p₆表示饱和阶段中的近似S形函数的斜率。相关参数p₇表示部分S形函数的拐点。在该定义中，参数p₇高于p₅和p₆，并且参数p₇小于p₄。可选参数p₈是由于测量条件中的参数变化(通常为温度变化)而出现在预设置点处的信号步长尺寸的估计。

更优选地，算法中的生长曲线模型具有下面的公式I：

f (x) = p_{1} \cdot (1 + p_{2} \cdot x) + \frac{p_{3}}{[1 + \exp {- p_{4} \cdot (x - p_{5})}] \cdot [1 + \exp {- p_{6} \cdot (x - p_{7})}]}

从表1中可以看出这些参数的定义。

在测量条件在一个点处变化的情况下，该模型优选地具有公式II的数学表示，该公式II与上面的公式I相比具有附加项：

f (x) = p_{1} \cdot (1 + p_{2} \cdot x) + \frac{p_{3}}{[1 + \exp {- p_{4} \cdot (x - p_{5})}] \cdot [1 + \exp {- p_{6} \cdot (x - p_{7})}]} - \frac{p_{8}}{2} \cdot [1 + sign {s - x + 0.5}]

在该公式II中，如下定义附加变量：

sign：符号函数sign(x)：＝x/√(x²)，x＜＞0；sign(0)：＝0。

s：预置的步长周期数(在该测量条件(例如温度已改变)处的周期数)。

对本领域的熟练技术人员明显的是，可以以导致相同结果f(x)的不同形式写上面的公式。那些公式也被适用作模型，并被认为通过本发明的定义所覆盖。那些被再写的公式被称作数学等价物。在统计学上切合实际的程序是用以增加y方差稳定性的y测量数据的变换。另一变换在非线性回归算法中可以减少所谓的曲率效应。所提出的公式适用于在整个范围上的恒定的测量数据方差。

借助项基线、指数阶段和平坦(饱和)阶段(参见图2)也可以描述模型参数的解释。利用以下线性公式描述基线起始阶段f_B

f_B(x)＝p₁(1+p₂x)。

利用以下S形公式描述饱和或平坦阶段f_S

f_S(x)＝f_B(x)+p₃/(1+exp(-p₆(x-p₇)))，

并且利用以下指数公式描述指数阶段

对于PCR，p₄和p₆的和等于ln(2)，这指的是每个周期之后的信号倍增。

在优选实施例中，依据本发明的方法包括以下步骤：在开始回归算法之前，通过从测量数据自动计算所有参数的值的起始集，为非线性回归算法确定合适的起始生长曲线。

在表2中给出起始参数的值的优选起始集。可以预置或从实际测量数据中计算所述参数的每个参数。

表2：

参数	起始值描述	起始值公式
			p₁	最小	＝Min(y数据)
p₂	0	0
			p₃	最大-最小	＝Max(y数据)-Min(y数据)
p₄	0.59	＝ln(1.8)
			p₅	在y达到p₁和p₁+p₂之间的四分之一之后的x值	＝LOOKUP(Min(y数据)+0.25*(Max(y数据)-Min(y数据))；y数据；x数据))
p₆	0.18	＝ln(1.2)
			p₇	在y达到p₁和p₁+p₂之间的二分之一之后的x值	＝LOOKUP(Min(y数据)+0.5*(Max(y数据)-Min(y数据))；y数据；x数据))
p₈	0(可选的步长尺寸参数)	0

参数p₁的起始值估计是所有所测量的数据的最小值。对于p₂，使用零。参数p₃的起始值估计是所有所测量的数据的最大值减去所有所测量的数据的最小值。对于参数p₄，使用起始值ln(1.8)＝0.59。对于p₅的起始估计，使用周期的数目，其中数据已经被增加至整个测量数据范围的25％。对于参数p₆，使用起始值ln(1.2)＝0.18。对于p₇的起始估计，使用周期的数目，其中数据已经被增加到整个测量数据范围的中间。

起始参数值的选择是确定需要的迭代的量，并因此确定计算程序的长度。已经惊人地发现依据本发明的参数及其值的优选选择，以显著减小计算工作。

然后，得到的起始生长曲线迭代地适于甚至在用于检测信号的时期之间的最佳拟合，其目的是接收具有最佳反应在任何时间的反应的过程的参数的生长曲线。为了开始生长曲线的迭代适配，改变如被用于起始曲线中的参数。这可以通过已知的非线性回归算法完成。那些公式之一是确定偏差的最小和的非线性回归方法。优选地，这可以通过最小化在y方向上的偏差的平方和来完成。优选地，这可以通过Levenberg-Marquardt或Nelder-Mead单形算法完成。该Levenberg-Marquardt算法利用具有参数中的二阶导数的简化近似的步进增量过程。此外，组合的优化方法自动适于其子方法中的优选的(更快速)的一种。该Levenberg-Marquardt算法通常对本领域的熟练技术人员是公知的。在本发明的优选实施例中，与依据本发明的生长曲线模型结合使用Levenberg-Marquardt算法。因为停止用于该算法的标准，所以已经发现，适合在5个迭代步骤之后停止，每个步骤导致小于平方偏差函数的和的预置相对减小。对于该相对改进限制，已经发现1×10^-2/周期数适用于可靠的全自动计算。如果这不能在100次迭代之内到达，则无论如何停止该算法。适于避免数值溢出，以针对发生的下面的迭代添加参数限制范围(例如p₃＞0)，或对优化项(平方偏差和)增加惩罚函数。

迭代的目的是找到生长曲线与测量数据的最佳适配。在该过程期间，确定一组参数。该组被优化的参数的值在下面被称作被优化的参数值。包括被优化的参数值的生长曲线被称作被优化的生长曲线。优选地，生长曲线是全局生长曲线。全局生长曲线是在x值的整个范围上被限定的曲线。明显的是，参数(p₁至p₈)的命名全部是任意的。可以选择其它符号，例如a至h。

在几乎线性曲线的情况中，可能是具有可能导致收敛到平方偏差的和的局部优化的参数的过确定的问题。为了克服该问题，一种方法是使用简化的模型(例如p₆＝p₇＝0，或附加地p₃＝0.2)，并且将回归结果与施瓦茨信息准则(SIC，Schwarz Information Criterion)进行比较，以选择具有合适数量参数的模型。

模型的另一应用是将y估计的标准误差用于曲线有效性检查的模型。对于标度不变性，计算下面的数，并相对于预置限制进行比较。

SEy：相对于模型回归的y估计的标准误差

Avg(y)：所有y数据的平均值

如果上面的表达式超过相对偏差限制，则数据集被表征为无效的。

模型的附加应用是异常值的检测和去除或校正。存在两个直接的实施方式。一个是相对于预置限制检查与模型回归的每个剩余数据偏差，并且当超过那个限制时，去除该异常值。可能用通过回归模型找到的曲线替代检测到的异常值。第二实施方式利用来自模型回归的整个曲线的相对总偏差。如果准则

通过，则不去除异常值。如果该准则没有通过，则去除具有最高剩余偏差的数据点，并且再次进行回归。有意义的是具有小于相对偏差限制的预置准则相对偏差异常值限制。

在上面的公式中，参数p₃具有特别的重要性。如果在生长曲线中p₃是0，则不发生信号生长。这翻译成，不存在在试样中要被检测的核酸。在可替换的方案中，如果p₃是正值，则在试样中存在要被检测的核酸。

为了确定统计学上重要的生长，则依据下面的t-测试设置生长参数p₃的零假设的t-参数的准则：

t₀(p₃＝0)与t＝p₃*/c₃₃相比

t₀：t-值的预置辨别限制

t：零假设的t值(“负的”)

p₃*：生长模型参数的估计

c₃₃：回归的协方差矩阵的第三个对角线元素。该值估计所确定的最佳参数的标准误差。依据标准文献，其可以从导数矩阵的逆矩阵中计算出。

如果t值小于预置值，则可以假定p₃不明显不同于零(零假设)。在自身中存在正p₃值可被用作分析物的存在的指示，并且将p₃值确定为零可被用作不存在特定分析物的指示。当需要定性确定时，这是有用的。在分析仪器中或在用于数据的估计的计算机上的数据比较单元中可以产生合适的消息，并可给管理该过程的人示出。在可替换的方案中，数据可被存储在存储器中，并可以与来自其它源的数据相联系，以及被转移到其他地方。

可以应用定性确定存在分析物的另一方法，该方法优选地被用于没有完全达到其饱和阶段的生长曲线。这可以发生小量的测量或迟的信号增加。该方法包括负曲线(线性)估计假设和全生长曲线(模型)估计假设的统计学比较。为此，确定来自模型回归和线性回归的平方偏差的和。与自由度的合适数一起执行统计学F-测试。如果F值小于预置值，则可以假定，全模型曲线不显著不同于线性回归(零假设)。图3示出了该方法的图形表示。在下面的公式中示出该测试的数学表示

F = (\frac{SSR (L)}{SSR (M)} - 1) \cdot \frac{n - m}{m - 2}

其中有

F 所计算的F-值

SSR(L) 线性回归的余量的平方和，

SSR(M) 模型回归的余量的平方和，

n 测量数据点的数目，以及

m 模型参数的数目，在公式I的模型中是7。

SSR (L) = Σ_{i = 1}^{n} {y_{i}}^{2} - \frac{1}{n} \cdot {(Σ_{i = 1}^{n} y_{i})}^{2} - \frac{{(Σ_{i = 1}^{n} (x_{i} \cdot y_{i}) - \frac{1}{n} \cdot Σ_{i = 1}^{n} x_{i} \cdot Σ_{i = 1}^{n} y_{i})}^{2}}{Σ_{i = r}^{n} {x_{i}}^{2} - \frac{1}{n} \cdot {(Σ_{i = 1}^{n} x_{i})}^{2}}

SSR (M) = Σ_{i = 1}^{n} {(y_{i} - \hat{y} (x, \overset{&RightArrow;}{p}))}^{2}

其中有

xi 测量数据的周期数

yi 测量数据

y ^所计算的模型值，以及

p 模型参数。

详细地，如果F值小于预置值(例如20)，则可以假定，本生长曲线不显著不同于负曲线。在自身中存在预置值以上的F值可被用作存在分析物的指示，并且确定预置值以下的F值可被用作不存在特定分析物的指示。当要求定性确定时，这是有用的。在分析仪器中或在被用于数据估计的计算机上的数据比较单元中可以产生合适的消息，并可给管理该过程的人示出。在可替换的方案中，数据可被存储在存储器中，并可与来自其它源的数据相联系，以及被转移到其他地方。

在参数p₄、p₅、p₆、p₇中的一个不显著不同于0的情况下，回归过程的精炼在于简化PCR模型。为此，可以使用利用协方差矩阵的参数的类似t-测试。然后在第二步中，利用p₄’＝p₅’＝0和p₃’＝2*p₃，可以使用精炼的PCR模型。这表示具有基线漂移和可选步骤的简单的S形函数。然后在如上面所描述的类似的非线性回归之后，为了进行正负辨别，类似地可以简单地进行p₃’的t-测试。

利用使用依据本发明的模型(优选地本发明的公式)的生长曲线的非线性回归拟合将测量数据变换到生长曲线的结果导致通过被优化的参数限定的最终生长曲线。该生长曲线使X轴上的每个值与Y轴上的值相关，这可与测量数据相比地被更改。因此，该生长曲线便利地校正由检测器错读的或通过错误照射产生的峰值测量数据。

依据本发明的方法的下一优选步骤包括将一个或多个生长曲线特征与参考值(多个参考值)相比。这些参考值可取决于确定的目的而不同。典型地，参考值由参考测量结果的生长曲线的参数的任何一个或组合组成。

在图4中示出两个例子。p₂和p₃/p₁被用作典型值。如果内部控制信号的参数值在图形的下部左侧范围中，则可以假定试剂失效。如果内部控制信号的参数值在下部右侧范围中，则可以检测试样中的增加的红细胞含量。

本发明对于分析物的定性确定是有用的，也就是确定分析物以超过预定阈值(“正”或“负”)的数量存在。在这种情况下，优选地使用统计学量度，用于确定分析物的存在或者不存在。

本发明对于分析物的定量确定也是有用的，也就是用于确定分析物在试样中的数量或其浓度。在这种情况下，使用取代初始测量数据的被优化的生长曲线。因此，最小化了测量数据不精确度、测量数据异常值的负效应。与标准方法中相同的用于确定最后结果的其他计算步骤可以保留。

本发明的另一主题是用于确定存在分析物的分析仪器，该分析仪器包括：

-信号检测单元，

-信号至测量数据变换单元，

-测量数据存储器，

-测量数据至生长曲线变换单元，

-生长曲线至数字数据变换单元，以及

-生长曲线比较单元，

其中，所述测量数据至生长曲线变换单元包括装载有利用通过5和11个参数之间的参数来限定的生长曲线模型的用于将生长曲线非线性回归拟合到测量数据的算法的计算机。

从在市场上可得到的单元可以组装这种仪器。然而，本发明提供了，较便宜的单元可被用于得到确定分析物的相同或甚至优良的结果。特别地，可将被用于本发明的仪器中的信号检测单元选择成更不精确的。这是针对例如具有减小的数位的模数变换器的情况，省略了前置放大器或更暗的光源。对用户特别有吸引力的选项是更狭窄的波长透射滤波器，该更狭窄的波长透射滤波器导致在多个分析物的并行多色检测的情况下减少光交叉(串扰或渗出)。依据本发明的单元并不需要被物理分离，而是可被组合成一个或多个组合单元。

在本发明的优选方面中，仪器包括光源。而且，因为本发明的算法可以更好地分类通过改变光源的强度而产生的峰值，所以比目前可以使用更廉价的光源，或需要光源较少的稳定性。

在本发明的一个方面中，信号是荧光信号。光检测器适于能够接收和检测荧光。

被用于在该仪器上运行的计算机程序的优选模型基于以下公式：

f (x) = p_{1} \cdot (1 + p_{2} \cdot x) + \frac{p_{3}}{[1 + \exp {- p_{4} \cdot (x - p_{5})}] \cdot [1 + \exp {- p_{6} \cdot (x - p_{7})}]}

或其数学等价物。

如果所述计算机进一步地装载有在表示存在于所述试样中的所述核酸的浓度的所述生长曲线上选择值的算法，则该仪器可被用于定量确定分析物。

利用新的算法的优点是多样性。由于化验的不精确度，例如在测量期间由于不期望的事件(象峰值)，测量数据可以是不正确的。新的算法改进了这种错误数据的校正。另一方面，被用于检测的仪器的部件可以有助于不涉及分析物的存在的测量数据的变化，例如通过光源提供的光的强度的变化。通过新的生长曲线模型可以校正这种变化。此外，能使用具有减小的精确度的仪器中的部件，因为该模型将校正通过该部件产生的不精确度。

用于生长曲线的比较的本发明的方法利用生长曲线的准确确定的特征数，并且以统计学方式估计任何误差、例如C_T中的误差、基线截距、基线漂移(斜率)、最大信号电平(涉及100％寡核苷酸探针裂开、杂交、插入等)、裂开效率、扩增效率、相对和绝对信号增加、阈值周期数、第一或第二导数最大值以及其他“肘(elbow)”量度。

在图1中示出表明依据本发明的参数的物理意义的示范性生长曲线。图1示出了光点中的测量数据、连续的生长曲线、基线(下部线)和饱和线(上部线)。p₁是对于基线上x＝0的y值，p₂是基线的斜率，p₃是对于饱和线上x＝0的y值，p₄是在p₅的x值处的生长曲线的斜率，并且p₆是x＝p₇处的生长曲线的斜率。

本发明的进一步的主题是用于根据测量数据确定存在分析物的计算机程序，该计算机程序包括

-通过数学算法根据测量数据产生生长曲线，

其中，所述数学算法包括通过5和11个参数之间的参数来限定的生长曲线模型公式，通过非线性回归拟合确定所述参数。

针对本发明的方法和仪器，在上面说明了计算机程序的优选细节。特别地，优选地在依据本发明的仪器上加载计算机程序，以便在包括依据本发明的其单元的仪器上指引本发明的方法的步骤。在另一优选实施例中，也可以在计算机可读介质上记录该计算机程序。

虽然出于清楚和理解的目的详细描述了前面的发明，但是对本领域的熟练技术人员清楚的是，根据该公开内容可以进行形式和细节上的各种改变，而不偏离本发明的真正的范围。例如，上面所描述的所有技术和设备可以各种组合来使用。

Claims

1.一种用于确定在试样中存在核酸的方法，该方法包括：

-提供包含所述核酸的反应混合物，

-以已知间隔检测来自所述反应混合物的信号，

-将所述信号变换成测量数据，以及

-通过数学算法根据所述测量数据产生生长曲线，

其中，所述数学算法包括基于5和11个参数之间的参数的数学生长曲线模型公式，并且其中，通过对所述测量数据应用回归拟合算法而确定所述参数的最佳值，所述生长曲线模型公式包括：

f (x) = p_{1} \cdot (1 + p_{2} \cdot x) + \frac{p_{3}}{[1 + \exp {- p_{4} \cdot (x - p_{5})}] \cdot [1 + \exp {- p_{6} \cdot (x - p_{7})}]}

或其数学等价物，其中

x是测量的时间或序列的量度，

p₁是反应的起始的生长曲线的截距，

p₂是基线的相对漂移，

p₃是基线与饱和线之间的距离，

p₄是表示指数生长的第一倍增S形函数的拐点处的斜率，

p₅是第一倍增S形函数的拐点，

p₇是第二倍增S形函数的拐点。

2.依据权利要求1所述的方法，其中，所述算法包括以下公式

f (x) = p_{1} \cdot (1 + p_{2} \cdot x) + \frac{p_{3}}{[1 + \exp {- p_{4} \cdot (x - p_{5})}] \cdot [1 + \exp {- p_{6} \cdot (x - p_{7})}]} - \frac{p_{8}}{2} \cdot [1 + sign {s - x + 0.5}]

或其数学等价物，其中

p₁是反应的起始的生长曲线的截距，

p₂是基线的相对漂移，

p₃是基线与饱和线之间的距离，

p₄是表示指数生长的第一倍增S形函数的拐点处的斜率，

p₅是第一倍增S形函数的拐点，

p₆是表示饱和生长的第二倍增S形函数的拐点处的斜率，

p₇是第二倍增S形函数的拐点，

p₈是其中测量条件改变的点处的信号步长尺寸，并且sign意味着函数sign(x)：＝x/√(x²)，x＜＞0；sign(0)：＝0，并且s是预置的步长周期数，测量条件已经根据该s改变。

3.依据权利要求1至2中的任何一个所述的方法，进一步包括将所述生长曲线的一个或多个数据特征与相对应的参考值进行比较。

4.依据权利要求1至2中的任何一个所述的方法，进一步包括利用算法根据表示存在于所述试样中的所述核酸的浓度的所述生长曲线来确定值。

5.依据权利要求1至2中的任何一个所述的方法，进一步包括下面的步骤：

-根据所述生长曲线确定在所述反应混合物中是否存在核酸或不存在核酸。

6.依据权利要求5所述的方法，其中，统计学测试被用于与背景曲线估计进行比较。

7.一种用于确定存在分析物的分析仪器，该分析仪器包括：

-信号检测单元，

-信号至测量数据变换单元，

-测量数据存储器

-测量数据至生长曲线变换单元，

-生长曲线至数字数据变换单元，以及

-生长曲线比较单元，

其中，所述测量数据至生长曲线变换单元包括装载有利用数学算法将生长曲线非线性回归拟合到测量数据的全自动算法的计算机，所述数学算法包括基于5和11个参数之间的参数的数学生长曲线模型公式，其中，通过对所述测量数据应用回归拟合算法而确定所述参数的最佳值，并且其中，所述生长曲线模型公式包括：

f (x) = p_{1} \cdot (1 + p_{2} \cdot x) + \frac{p_{3}}{[1 + \exp {- p_{4} \cdot (x - p_{5})}] \cdot [1 + \exp {- p_{6} \cdot (x - p_{7})}]}

或其数学等价物，其中

x是测量的时间或序列的量度，

p₁是反应的起始的生长曲线的截距，

p₂是基线的相对漂移，

p₃是基线与饱和线之间的距离，

p₄是表示指数生长的第一倍增S形函数的拐点处的斜率，

p₅是第一倍增S形函数的拐点，

p₇是第二倍增S形函数的拐点。

8.依据权利要求7所述的仪器，进一步包括光源。

9.依据权利要求7所述的仪器，其中，所述信号是荧光信号。

10.依据权利要求7所述的仪器，其中，所述计算机进一步装载有在表示存在于所述试样中的所述核酸的浓度的所述生长曲线上选择值的算法。