ES2349107T3

ES2349107T3 - Método analítico e instrumento.

Info

Publication number: ES2349107T3
Application number: ES06026114T
Authority: ES
Inventors: Rolf Knobel
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2005-12-19
Filing date: 2006-12-16
Publication date: 2010-12-28
Anticipated expiration: 2026-12-16
Also published as: CN101037711B; EP1798652A1; CA2571454A1; CA2571454C; EP1798652B1; CN101037711A; EP1798652B8; US20070166744A1; HK1109787A1; US8239137B2; DE602006016397D1; ATE479152T1; JP4718431B2; JP2007188484A; EP1798650A1; ES2349107T8

Abstract

Un método para determinar la presencia de ácidos nucleicos en una muestra, que comprende: - proporcionar una mezcla de reacción que contenga di5 chos ácidos nucleicos, - detectar señales a partir de dicha mezcla de reacción en intervalos conocidos, - transformar dichas señales en datos de medida, y - crear a partir de dichos datos de medida una curva de crecimiento mediante un algoritmo matemático, que se caracteriza porque dicho algoritmo matemático comprende la fórmula matemática del modelo de curva de crecimiento **(Ver fórmula)** o sus equivalentes matemáticos, en la que los parámetros son los siguientes: 15 x es una medida del tiempo o secuencia de las medidas p1 es la intersección de la curva de crecimiento al inicio de la reacción, p2 es la deriva relativa de la línea basal, p3 es la distancia entre la línea basal y la línea de saturación, p4 es la pendiente en el punto de inflexión de una primera función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento exponencial, p5 es el punto de inflexión de una primera función 25 sigmoidal multiplicativa, p6 es la pendiente en el punto de inflexión de una se gunda función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento a saturación, y p7 es el punto de inyección de una segunda función sigmoidal multiplicativa en la que los valores óptimos de los parámetros se determinan mediante un algoritmo de ajuste de regresión no lineal a dichos datos de medida.

Description

Campo de la invención

El sujeto de la presente invención es un método para la determinación de la presencia de un analito y un instrumento analítico capaz de realizar dicho método.

Antecedentes de la invención

La invención es útil en el campo del análisis o el

diagnóstico, particularmente en el diagnóstico de ácidos nucleicos. El análisis de ácidos nucleicos se ha mejorado considerablemente mediante la invención de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describe en las PE 0 200 362 y PE 0 201 184. Durante la realización de este método, la cantidad de ácidos nucleicos se aumenta exponencialmente, al menos parcialmente, ya que en teoría, a partir de cada secuencia de ácidos nucleicos presente en la mezcla de reacción en cada ciclo de reacción se crea un ácido nucleico adicional, y cada una de tales secuencias puede actuar como un molde para la creación de una nueva secuencia de ácidos nucleicos en el siguiente ciclo de reacción. La cantidad de ácidos nucleicos creada está limitada por la cantidad de reactivo, como la enzima, los cebado- res y nucleótidos, contenidos en la mezcla de reacción. Por lo tanto, la representación de la concentración frente al tiempo o el número de ciclos de la PCR aparece como una curva (asimétrica) sigmoide.

Una mejora adicional de la PCR es la denominada PCR a tiempo real. En este método, se genera una señal y se detecta durante la amplificación. La señal es representativa de la cantidad de ácidos nucleicos generados durante la amplificación y por lo tanto presentes en la mezcla de reacción. En una primera realización, por ejemplo descrita en la PE 0 512 334, la señal se genera mediante un compuesto capaz de intercalarse en los ácidos nucleicos de doble cadena y a la vez cambiar sus propiedades de fluorescencia. En otra realización, como la descrita en la PE 0 543 942, cada reacción de extensión de un cebador da lugar a la escisión de una sonda, marcada mediante un bloqueador de la fluorescencia y un colorante emisor de forma que cuando se escinde la sonda, el bloqueador no puede bloquear la emisión de luz del colorante de marcaje, de forma que se puede detectar la señal.

La determinación de la cantidad de ácidos nucleicos originalmente presentes en la muestra previamente a la amplificación (cuantificación) ha sido el objetivo de varias investigaciones. Generalmente, cuanto mayor sea la cantidad menor será el número de ciclos de reacción necesarios para que se reciba una intensidad definida de la señal (umbral). Los primeros cálculos se basaban, por lo tanto, en la determinación del ciclo umbral o valor (CT). Cuando más elevado es el valor CT, menor es la cantidad original de ácidos nucleicos presentes.

Obviamente, el número (entero) de ciclos de reacción

realizados es sólo una estimación muy poco precisa de la

cantidad originalmente presente. Así, en un nuevo intento de determinar la concentración, las intensidades de la señal que quedan entre distintos datos de medida se interpolan (lineal o logarítmicamente). Esta método basado en la interpolación posee algunas deficiencias en el caso de medidas de señal imprecisas o incluso valores de medida atípicos. Para evitarlo, se han establecido algoritmos para generar curvas de crecimiento continuas a partir de un número definido de medidas durante la reacción de amplificación. Un ejemplo de un algoritmo es el denominado filtro Sawitzky Golay. Las curvas resultantes se denominan curvas de crecimiento. En la PE 0 686 699 se describe una fórmula recursiva condicional que puede utilizarse para ajustar los datos obtenidos a una curva teórica. Sin embargo, la aplicación es incómoda y el proceso de ajuste no está descrito. Puede conducir a fuertes correlaciones entre parámetros y a resultados imprecisos en ciertos casos.

En la WO 97/46714 se describen métodos para monitorizar la hibridación tras una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En particular, la solicitud describe que la sensibilidad de la cuantificación inicial de un molde con representaciones de la fluorescencia frente al número de ciclos puede aumentarse mediante el análisis de la curvas de fusión del producto para controlar la amplificación no específica y mediante los algoritmos de ajuste de la curva de Levenberg-Marquard, de ajuste por regresión no lineal. La curva de ajuste de este documento posee una línea basal inclinada, una línea de “plateau” inclinada y una parte de

crecimiento intermedio.

En Biotechnology Letters 24, 2002, 2053-2056 se describe un método para determinar la eficiencia de la amplificación mediante RT-PCR utilizando un modelo sigmoidal de cuatro parámetros.

En Biochemical and Biophysical Research Communications 294, 2002, 347-353 también se describe un método de simulación de una PCR para determinar la eficiencia de la PCR.

Estos dos modelos de cuatro parámetros matemáticamente equivalentes proporcionan una exactitud limitada especialmente en las áreas que normalmente son críticas para un cálculo del resultado exacto. La línea basal se fuerza para que sea constante y el término sigmoidal simple no puede aproximar la totalidad de la complejidad de una curva de crecimiento general. Por lo tanto, la fase exponencial se aproxima con una exactitud limitada como se puede observar visualmente en las gráficas de ambos artículos. Esto da lugar a un resultado con una exactitud limitada, por ejemplo de CT.

En Phytopathology vol. 83, nº 9, 1993, 928-932 se describen diez funciones matemáticas utilizadas para describir las curvas de progreso de patrón sigmoidal obtenidas en un análisis de regresión no lineal. Estas funciones son combinaciones aditivas de curvas sigmoidales adecuadas para un crecimiento en dos fases.

Es objeto de la presente invención mejorar el análisis cuantitativo, en particular proporcionar un método completamente automatizado utilizando un cálculo matemático para

mejorar la estimación de la curva de crecimiento completa, especialmente para corregir la imprecisión de la medida y los posibles picos de medida.

Breve descripción de las figuras

En la Fig. 1 se representa una curva de crecimiento que muestra un ejemplo de los parámetros del modelo.

En la Fig. 2 se muestra la curva de crecimiento con la curva de la fase exponencial, la curva sigmoidal de saturación parcial y la línea basal que contribuyen al modelo de la curva de crecimiento.

En la Fig. 3 se representa una representación gráfica del test F del método de la invención frente al modelo lineal.

In Fig. 4 se representa la utilización de p2 y p3/p1 como valores típicos de los parámetros de la señal control interno como medida de la caducidad del reactivo y/o un contenido aumentado de hematíes en la muestra.

Resumen de la invención

En una primera realización, la invención está dirigida a conseguir un método para determinar la presencia de ácidos nucleicos en una muestra, como se define en la reivindicación independiente 1.

Otro objeto de la invención es un instrumento analítico para determinar la presencia de un analito en una muestra como se define en la reivindicación independiente 7.

Descripción detallada de la invención

Aunque la invención es útil para la determinación de

cualquier analito, en la mayoría del texto a continuación

la invención se ejemplifica mediante la determinación de ácidos nucleicos. Los métodos para la determinación de la presencia de ácidos nucleicos en una muestra son ampliamente conocidos. Normalmente se basan en la detección de la aparición de hibridación de sondas de ácidos nucleicos, por ejemplo oligonucleótidos, con los ácidos nucleicos a determinar, es decir la formación de híbridos. Sin embargo, también existen métodos que utilizan la detección de la interacción de otros compuestos químicos con los ácidos nucleicos a determinar o con compuestos derivados de estos, por ejemplo la detección de la aparición del intercalado de agentes intercalantes en los ácidos nucleicos de doble cadena. La presente invención proporciona los métodos para determinar el analito siguiendo el curso de una reacción a lo largo de un periodo de tiempo, por ejemplo recogiendo datos recibidos de dicho seguimiento e interpretando los datos recibidos. La presente invención por lo tanto es particularmente útil para el seguimiento de reacciones en las que un cambio detectable en la muestra es una medida de la ausencia, presencia o/y la cantidad de analito presente en dicha muestra. Estas determinaciones también se denominan determinaciones cinéticas.

Una muestra en la definición de la presente invención es un líquido que contiene el analito, por ejemplo los ácidos nucleicos o/y cualquier ácido nucleico derivados de ellos, por ejemplo cualquier producto de una reacción de amplificación, en la que se quiere determinar la presencia de los ácidos nucleicos. La muestra original puede o no

contener el analito en la concentración o cantidad original. La presente invención puede determinar si el analito está presente. La presente invención también puede apoyar y mejorar la determinación de cual es la cantidad o concentración en que la muestra original contiene dicho analito. El preprocesado de los datos de medida resulta en una curva de crecimiento libre de imprecisión estadística continua. Las medidas de cuantificación (por ejemplo el CT) derivadas de esta tienen una robustez y exactitud mejoradas comparado con los métodos actuales.

Una muestra también puede ser un líquido derivado de la muestra original eliminando o añadiendo componentes. Por ejemplo, es ampliamente reconocido que la determinación de ácidos nucleicos en una muestra mejora, si los ácidos nucleicos se aíslan o purifican y por lo tanto se disuelven en un líquido que permite que pueda darse la determinación. Tal purificación de ácidos nucleicos generalmente es conocida para los expertos en la materia. También es bien conocida la relación entre la cantidad de ácidos nucleicos originalmente presentes en una muestra y la cantidad de ácidos nucleicos presentes en una muestra derivada de dicha muestra original. De nuevo, es bien conocido la deducción de la concentración de ácidos nucleicos en dicho volumen de muestra original a partir de la cantidad o concentración de ácidos nucleicos presentes en la muestra derivada de ésta.

Pueden recogerse muestras originales de cualquier origen. En el cuidado de la salud, las muestras habituales son muestras recogidas del cuerpo, preferiblemente el cuerpo

humano, como la sangre o la orina, o muestras derivadas de estas, como el suero o el plasma. En el análisis de alimentos, las muestras pueden ser líquidas directamente, como los zumos, pero también pueden ser líquidos derivados de muestras sólidas, como los extractos a partir de frutas, queso o carne.

Como se ha mencionado anteriormente, muchas muestras, en particular en el campo de la determinación de ácidos nucleicos, requieren un aislamiento previo del analito del resto de componentes de la muestra que interfieren en el análisis. Tal aislamiento es bien conocido para el experto en la materia.

El método de acuerdo con la invención comprende la adición a la muestra del reactante y todos los compuestos necesarios para que ocurra la reacción, creando así la mezcla de reacción. Esta mezcla de reacción es sujeto de la detección. La mezcla de reacción puede proporcionarse durante la parte de detección del método, pero preferiblemente se realiza previamente al inicio de la detección.

La presente invención incluye detectar una señal a partir de la mezcla de reacción. Esta señal debería estar relacionada con la reacción que haya ocurrido, si la ha habido, en la mezcla de reacción. Por lo tanto, cualquier reacción durante la cual pueda generarse una señal que pueda detectarse puede monitorizarse en el proceso de acuerdo con la presente invención. La señal puede ser cualquier señal que sea detectable, por ejemplo de forma electroquímica

o electromagnética. Preferiblemente, la señal es una señal

electromagnética, más preferiblemente una onda electromagnética de una característica particular, como la luz, ya sea visible o invisible al ojo humano. Los instrumentos o dispositivos para la detección de tales señales son generalmente conocidos en la materia.

Un método preferible para la determinación de ácidos nucleicos incluye la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos a detectar. Uno de los métodos de amplificación e ácidos nucleicos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, descrita en las patentes PE 0 201 184 y PE 200 362). Este método es un proceso que incluye un ciclo de reacción que comprende los pasos de someter los ácidos nucleicos de doble cadena en una mezcla de reacción a condiciones desnaturalizantes reversibles, por ejemplo calentando por encima de la temperatura de fusión de los ácidos nucleicos de doble cadena, hibridando un cebador a cada uno de los ácidos nucleicos de cadena sencilla preparados, y extendiendo los cebadores mediante la unión de mononucleótidos a los extremos de dichos cebadores utilizando la secuencia de los ácidos nucleicos de cadena sencilla como molde para las secuencias de nueva formación. Este ciclo de reacción se repite tantas veces como se desee, utilizando productos de extensión de los ciclos anteriores como moldes para la extensión de cebadores en los siguientes ciclos, para preparar tantos productos de extensión como sea necesario para permitir su detección. Se ha demostrado que es apropiado repetir el ciclo de reacción entre 10 y 100 veces, más preferiblemente entre 20 y 60 veces. La cantidad de ciclos ne

cesarios para la generación de ácidos nucleicos detectables puede depender de la cantidad de ácidos nucleicos a determinar. Por ejemplo, para los analitos ácidos nucleico normalmente presentes en la muestra en muy pequeñas cantidades, como en el caso de una infección con virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o virus de la hepatitis C (VHC), es esperable que para realizar el análisis sean necesarios más ciclos que para los analitos normalmente presentes en concentraciones mayores. Estas consideraciones son conocidas para los expertos en la materia.

Preferiblemente, la amplificación de los ácidos nucleicos en la mezcla de reacción es la reacción que se monitoriza. En este caso, el aumento de la cantidad de ácidos nucleicos, en particular aquellos representativos de la presencia o/y la cantidad de los ácidos nucleicos analito, está relacionada con una señal a detectar durante el curso de la reacción. Los métodos basados en la PCR normalmente se denominan PCR cinética. Preferible las reacciones son como las descritas en las patentes PE 0 512 334, PE 0 543 942 y WO 97/46714.

Esta señal puede ser la señal que se genera durante el curso de una reacción sin ninguna acción adicional, es decir un aumento de la temperatura de la mezcla de reacción causado por la liberación de energía de la reacción. En un modo preferible, la muestra se somete a una influencia externa, por ejemplo proporcionando energía a la mezcla de reacción. Esta energía normalmente se proporciona de forma que genere una señal a partir de la mezcla de reacción, por

ejemplo una señal contenida en la mezcla, que se correlaciona con el curso de la reacción que se está dando en la mezcla de reacción. En una realización preferible, la energía se proporciona al aplicar una irradiación con luz a la mezcla de reacción. la luz debe tener la propiedad de provocar una señal a partir de la mezcla de reacción relacionada con la reacción que se está dando.

En un modo preferible, la señal es luz que escapa de la mezcla de reacción. En el caso de irradiar la mezcla de reacción con luz, esta luz puede tener las mismas características que la luz utilizada para la irradiación. Por lo tanto, la detección es detección de la absorción. En un modo preferible, la luz que escapa de la mezcla de reacción es diferente de la luz irradiada. En este caso, la luz que escapa preferiblemente se genera mediante un proceso de fluorescencia. La luz fluorescente se detectará como una medida del curso de la reacción.

La señal se detecta en intervalos conocidos. Un intervalo es la distancia entre detecciones subsiguientes, preferiblemente sin contar duplicados. Los intervalos se escogen para monitorizar adecuadamente el curso de una reacción

o un número de reacciones realizadas en dicha muestra. Por lo tanto, las señales se detectan preferiblemente durante el curso de la reacción. Aunque la detección puede iniciarse al mismo tiempo que se inicia la reacción, esto no es necesario. La detección puede detenerse cuando la reacción llega a completarse, pero puede detenerse antes o puede continuar durante algún tiempo tras completarse la reac

ción. Un experto en la materia sabrá que cuando ya no existen cambios significativos de la señal, la detección puede detenerse.

En general, los intervalos a los que las señales se detectan dependerá de la exactitud de la determinación deseada. En general, cuanto menores sean los intervalos, mayor será la exactitud. Para las PCR cinéticas, se utiliza preferiblemente una longitud de los intervalos de detección de la señal que coincida con el tiempo de un ciclo de reacción. Como las longitudes de los ciclos de reacción preferiblemente son idénticas, los intervalos serán también idénticos. Se apreciará que cada detección puede estar constituida por una serie de medidas durante un periodo de tiempo muy corto (considerablemente menor que, por ejemplo menos de un 1% de la duración del intervalo anteriormente mencionado). Preferiblemente, en la PCR, una señal se detecta más de una vez, preferiblemente entre 2 y 10 veces, durante una fase de plateau de cada ciclo. Una fase de plateau en un ciclo particular es una fase en la que la temperatura de la mezcla de reacción no cambia sustancialmente a lo largo del tiempo. Normalmente, esta es la fase de hibridación de cada ciclo. Esto puede utilizarse para excluir errores del instrumento. Para la PCR, la longitud de un intervalo será preferiblemente de entre 0,1 s y 1 h, más preferiblemente entre 1 s y 10 min., y más preferible entre 5 s y 1 min.

En otros métodos, como la NASBA o SDA, los ciclos pue

den no estar claramente separados entre ellos por pasos

distintos del proceso. Por lo tanto, los intervalos para detectar la señal pueden elegirse de forma más deliberada. Por ejemplo, los intervalos durante tales reacciones pueden ser de entre 0,1 s y 2 min., más preferiblemente entre 1 s y 1 min., y más preferiblemente entre 2 s y 20 s.

La señal puede crearse durante la reacción como resultado de la reacción sin una inducción adicional. Preferiblemente, la señal se induce proporcionando energía a la mezcla de reacción, como energía electroquímica o electromagnética. Preferiblemente, el método de acuerdo con la invención incluye la irradiación de la mezcla de reacción con ondas electromagnéticas, más preferiblemente con luz. La luz preferiblemente se escoge de forma que interaccione con componentes en la mezcla de reacción que dependen del progreso de la reacción a monitorizar. Preferiblemente, cualquier componente de la reacción o componentes relacionados con los componentes de la reacción se diseñan para que absorban la luz irradiada a la mezcla de reacción. Por lo tanto, los métodos preferibles se basan en la irradiación de la muestra con luz con una característica particular y en la detección de la luz que escapa de dicha muestra.

Las características de la luz que incide en dicha muestra dependen del formato y los componentes particulares de la muestra. Los formatos de ensayo bien conocidos para el experto en la materia utilizan marcajes que absorben luz, por ejemplo un marcaje unido a una sonda diseñada para hibridar con los ácidos nucleicos a determinar, o un compuesto químico que absorbe luz. Los formatos incluyen el

cambio de una propiedad detectable, por ejemplo una propiedad causada por el cambio de la composición de la muestra a lo largo del tiempo, preferiblemente la absorción o emisión de luz. Este cambio de propiedades causadas por dicha reacción se determina mediante la detección de una señal recibida de dicha muestra durante el tiempo de reacción. En los formatos basados en la hibridación se detecta una señal relacionada con uno o más marcajes unidos a sondas que hibridan con los ácidos nucleicos cuya presencia se desea determinar o con ácidos nucleicos derivados de los mismos.

Las reacciones preferibles que pueden seguirse con el método de la presente invención se describen en la PE 0 512 334 y PE 0 543 942, cuya descripción se incorpora aquí en referencia a las condiciones en las que se realizan estas reacciones.

Cada señal se transforma entonces en datos de medida. Esto es preferiblemente un número digital que puede almacenarse de forma electrónica en un punto de almacenamiento. Un punto de almacenamiento adecuado es bien conocido como memoria en el área de la informática, por ejemplo en los ordenadores personales. La transformación puede realizarse de acuerdo con métodos ampliamente conocidos en la materia, por ejemplo convertidores analógico/ digital. A partir de dicha memoria pueden leerse los datos de medida y someterse a cálculos que utilizan estos datos. Durante este proceso, los datos pueden someterse a manipulaciones adicionales, por ejemplo corrección de contraste de la señal y resolución multicanal. El resultado de esto se denomina datos de

medida.

En el siguiente paso, los datos de medida se transforman en la curva de crecimiento continua. Un aspecto central de la presente invención es que esta transformación se realiza utilizando una fórmula matemática de un modelo de curva de crecimiento no lineal que utiliza entre 5 y 11 parámetros y un algoritmo de ajuste de regresión no lineal de la curva de crecimiento a los datos de medida. Una fórmula no lineal es una fórmula que no está basada en una relación lineal de los parámetros. La regresión no lineal se describe en términos generales en: D. M. Bates, D. G. Watts: Non- lineal Regression Analysis and its Applications, Wiley (1988).

Un modelo de curva de crecimiento es una fórmula matemática que describe la dependencia continua de una señal- función de una variable tiempo. El valor de la señal se define como una medida de la señal detectada. La variable tiempo se define como un número entero de ciclo cuando se mide la señal y su continua extensión. Preferiblemente, este modelo contiene entre 7 y 10, y más preferiblemente 9 parámetros, los que incluye el valor de la señal y la variable tiempo. Se ha comprobado que este número de parámetros para aproximar la curva de crecimiento real es de una exactitud apropiada, sin que haya un exceso de parámetros (elevada correlación entre parámetros).

Más preferiblemente, los parámetros se seleccionan de entre el grupo que consiste en los datos de medida (señal), tiempo (número de ciclo), intersección de la línea basal,

deriva relativa, crecimiento, pendiente 1, inflexión 1, pendiente 2, inflexión 2 y otros parámetros que describan una curva característica. Más preferiblemente, los parámetros son los datos de medida (señal), tiempo (número de ciclo), intersección de la línea basal, deriva relativa, crecimiento, pendiente 1, inflexión 1, pendiente 2 e inflexión

2. Los detalles y la definición preferible pueden extraerse

de la Tabla 1. Tabla 1:

Parámetro: Dimensión Nombre Descripción

f: Y Datos de medición, (Señal de fluorescencia) unidades de fluorescencia relativas

x: X Tiempo, número de ciclo puntos temporales, números enteros

p1: Y Intersección de la línea basal parte de la señal no bloqueada

p2: 1/X Deriva relativa pendiente de la señal negativa lineal

p3: ΔY Crecimiento saturado por encima de la señal negativa aumento de fluorescencia

p4: 1/X Pendiente 1 <ln(2)

p5: X Inflexión 1 Fase exponencial

p6: 1/X Pendiente 2 >0

p7: X Inflexión 2 centro del crecimiento

p8: Y parámetro de paso (opcional) tamaño de paso

Cuando el valor de la señal (entrada de la medición) y el tiempo variable están disponibles a partir de los datos de medición, el resto de parámetros se determinan aplicando un algoritmo de regresión no lineal. El parámetro p1 básicamente representa la intersección de la curva de crecimiento con el eje y tras un paso opcional (véase p8). El término adicional p3/(1+exp (p4 p5))/ (1+exp(p6 p7)) es negligible en esta definición. El parámetro p2 representa la deriva relativa de la línea basal negativa por ciclo. El parámetro p3 representa la estimación del crecimiento máximo del valor sobre la línea basal. El parámetro p4 representa la pendiente de una función sigmoide aproximada en la fase exponencial temprana. Exp(p4) es una estimación de la eficiencia de amplificación en esta fase que indica que p4 es normalmente inferior al ln(2) para la PCR. El parámetro p5 relacionado representa el punto de inflexión de esta función sigmoide parcial. El parámetro p6 representa la pendiente de una función sigmoide aproximada en la fase de saturación. El parámetro p7 relacionado representa el punto de inflexión de esa función sigmoide parcial. El parámetro p7 es superior a p5 y p6 y es inferior al p4 en esta definición. El parámetro opcional p8 es la estimación de un tamaño de paso de la señal que aparece en un punto predeterminado debido a un cambio permanente en la condición de medición, normalmente un cambio de temperatura.

En la presente invención el modelo de curva de crecimiento en el algoritmo posee la siguiente fórmula I:

imagen1

La definición de los parámetros puede verse en la Tabla 1.

En el caso de cambio de las condiciones de medición en un punto, el modelo preferiblemente posee la representación matemática de la fórmula II que comprende un término adicional comparado con la fórmula I anterior:

imagen1

En esta fórmula II, las variables adicionales se definen como sigue: signo: signo de la función de signo (x):= x/√(x2), 10 x<>0; signo (0):=0.

s: número de ciclo de fase predeterminado (número de ciclo en el que la condición de medición, por ejemplo la temperatura, ha cambiado)

Es obvio para un experto en la materia que la fórmula

15 anterior puede escribirse de diferentes maneras llegando al mismo resultado f(x). Aquellas fórmulas son también adecuadas como modelo y se consideran cubiertas por la definición de la invención. Aquellas fórmulas reescritas se denominan equivalentes matemáticos. Un procedimiento estadísticamente

20 sensible es la transformación de los datos de medición y para aumentar la estabilidad de la varianza de y. Otra transformación puede reducir los denominados efectos de curvatura en el algoritmo de regresión no lineal. La formulación propuesta es apropiada para la varianza de datos de

25 medición constante sobre el rango completo. La interpretación de los parámetros del modelo puede también describirse con la ayuda de los términos línea ba

sal, fase exponencial y fase plateau (saturación) (véase FIG. 2). La fase inicial de línea basal fB se describe con la fórmula lineal

imagen1

La saturación o fase plateau fS se describe con la fórmula sigmoide

imagen1

y la fase exponencial se describe con la fórmula exponencial

imagen1

Para la PCR, la suma de p4 y p6 equivale a alrededor del ln(2) que se refiere a la señal que se dobla después de 10 cada ciclo.

En una realización preferible, el método de acuerdo con la invención incluye el paso de determinar una curva de crecimiento inicial apropiada para el algoritmo de regresión no lineal mediante el cálculo automático a partir de

15 los datos de medición, un grupo de valores de partida para todos los parámetros antes de iniciar un algoritmo de regresión.

Un grupo de valores de inicio preferibles para los parámetros de inicio se proporciona en la Tabla 2. Cada uno 20 de dichos parámetros puede predeterminarse o puede calcu

larse a partir de los datos de medición actuales.

Tabla 2:

20

Parámetro: Descripción del valor inicial Fórmula del valor inicial

p1: Mínimo =Min (ydata)

p2: 0 0

p3: Máximo - Mínimo =Max (ydata) - Min (ydata)

p4: 0,59 =ln(1,8)

p5: valor x tras alcanzar y un cuarto entre p1 y p1+p2 =LOOKUP(Min(ydata) +0,25* (Max(ydata)-Min (ydata)); ydata;xdata))

p6: 0,18 =ln(1,2)

p7: valor x tras alcanzar y la mitad entre p1 y p1+p2 =LOOKUP(Min(ydata) +0,5 * (Max(ydata)-Min (ydata)); ydata; xdata))

p8: 0 (parámetro de tamaño de paso opcional) 0

La estimación del valor inicial para el parámetro p1 es el mínimo de todos los datos medidos. Para p2 se utiliza el cero. La estimación del valor inicial para el parámetro

5 p3 es el máximo de todos los datos medidos menos el mínimo de todos los datos medidos. Para el parámetro p4 se utiliza el valor inicial ln(1,8)=0,59. Para la estimación inicial de p5 se utiliza el número de ciclo en el que el dato ha aumentado en un 25% del rango total de datos medidos. Para

10 el parámetro p6 se utiliza el valor inicial ln(1,2)=0,18. Para la estimación inicial de p7 se utiliza el número de ciclo en el que los datos han aumentado la mitad del rango total de datos de medición.

La elección de los valores de parámetro iniciales determina la cantidad de iteraciones necesarias y así la duración del proceso de cálculo. Se ha encontrado sorprendentemente que la elección preferible de los parámetros y sus valores de acuerdo con la presente invención reducen considerablemente este esfuerzo de cálculo.

Así, la curva de crecimiento inicial resultante se adapta iterativamenta al mejor ajuste, con la intención de recibir una curva de crecimiento con los parámetros que mejor reflejan el curso de la reacción en cualquier momento, incluso entre los tiempos utilizados para detectar la señal. Para poder iniciar la adaptación iterativa de la curva de crecimiento, se alteran los parámetros utilizados en la curva inicial. Esto puede realizarse mediante algoritmos conocidos de regresión no lineal. Entre estas fórmulas están los métodos de regresión no lineal que determinan la suma mínima de las desviaciones. Preferiblemente esto se realiza al minimizar la suma del cuadrado de las desviaciones en la dirección y. Preferiblemente esto se realiza mediante un algoritmo Levenberg-Marquardt o un algoritmo Nelder-Mead simplex. El algoritmo Levenberg-Marquardt utiliza un proceso de aumento paso a paso con aproximaciones simplificadas para las segundas derivadas en el parámetro. Además, es un método de optimización combinada que se adapta automáticamente a uno de sus submétodos preferidos (más rápidos). El algoritmo Levenberg-Marquardt lo conocen generalmente los expertos en la materia. En una realización preferible de la presente invención, se utiliza un algorit

mo Levenberg-Marquardt en combinación con el modelo de curva de crecimiento de acuerdo con la presente invención. Como criterio de detención para el algoritmo se encontró apropiado parar tras 5 pasos de iteración, cada uno de los pasos conduce a una reducción relativa predeterminada inferior a la suma de la función de la desviación al cuadrado. Para este límite de mejora relativo 1x10-2 / número de ciclo, se encontró apropiado para un cálculo fidedigno totalmente automático. Si esto no se logra tras 100 iteraciones, el algoritmo se detiene de todas formas. Es apropiado evitar un desbordamiento numérico para añadir un rango de limitación de parámetros (por ejemplo p3>0) para la siguiente iteración que va a tener lugar un una función de penalización para el término de optimización (suma de las desviaciones al cuadrado).

El objetivo de la iteración es encontrar la adaptación óptima de la curva de crecimiento en los datos de medición. Durante este proceso, se determina un grupo de parámetros. Los valores para los parámetros optimizados de este grupo se denominan a partir de ahora valores de parámetro optimizado. La curva de crecimiento que contiene los valores de parámetro optimizado se denomina curva de crecimiento optimizada. Preferiblemente, la curva de crecimiento es una curva de crecimiento global. Una curva de crecimiento global es una curva definida sobre el rango total de los valores x. Es evidente, que la denominación de los parámetros (p1 a p8) es totalmente arbitraria. Pueden escogerse otros

símbolos, por ejemplo de la a "a" la "h".

En el caso de curvas casi lineales podría haber problemas con la determinación de los parámetros que podría ocasionar en la convergencia a un óptimo local de la suma de desviaciones cuadradas. Para superar este problema, un

5 método es utilizar modelos simplificados (por ejemplo p6=p7=0 o adicionalmente p3=0,2) y comparar los resultados de regresión con el criterio de la información de Schwarz (SIC) para seleccionar el modelo con el número de parámetros apropiados.

10 Otra aplicación del modelo es utilizar el error están-dar de y estimado al modelo para una comprobación de la validez de la curva. Para invariancia de la escala, el siguiente número se calcula y se compara con un límite preestablecido.

imagen2

15 SEy: Error estándar de y estimado frente al modelo de

regresión

Avg(y): Media de todos los datos de y

Si la expresión anterior excede el límite de desvia

ción relativa, un grupo de datos se caracteriza como invá20 lido.

Una aplicación adicional del modelo es la detección y eliminación o corrección de valores atípicos. Existen dos implementaciones directas. Una es validar cada desviación de datos residual del modelo de regresión frente a un lími25 te preestablecido y eliminar el valor atípico cuando se excede ese límite. Es posible sustituir el valor atípico de

tectado mediante la curva encontrada por el modelo de regresión. Una segunda implementación utiliza la desviación total relativa de la curva total a partir del modelo de regresión. Si se supera el criterio no se elimina el valor atípico. Si falla, el punto de dato con la mayor desviación residual se elimina y la regresión se hace de nuevo. Es significativo tener el criterio preestablecido de límite atípico de desviación relativa más pequeño que el límite de desviación relativa

imagen3

10 En la fórmula anterior, el parámetro p3 posee una importancia particular. Si en la curva de crecimiento p3 es 0, entonces no hay señal de crecimiento. Esto se traduce en que el ácido nucleico a detectar en la muestra no está presente. En la alternativa, si p3 es un valor positivo, el

15 ácido nucleico a detectar está presente en la muestra. Para poder determinar un crecimiento estadísticamente significativo, se ajusta un criterio para el parámetro t para todas las hipótesis nulas del parámetro de crecimiento p3 de acuerdo con el siguiente test t:

20 t0 (p3=0) comparado con t=p3*/c33

t0: límite de discriminación predeterminado para el va

lor t t:valor t para la hipótesis nula (negativa) p3*: estimación del parámetro del modelo de crecimiento

25 c33: tercer elemento diagonal de la matriz de covarianza de la regresión. Este valor estima el error estándar del parámetro óptimo determinado. Puede calcularse a partir de

la inversa de la matriz derivada de acuerdo con la bibliografía estándar.

Si el valor t es inferior al valor predeterminado puede asumirse que p3 no es significativamente diferente de cero (hipótesis nula). La presencia de un valor p3 positivo en sí, puede utilizarse como indicativo de la presencia del analito y la determinación de un valor 0 para p3 puede utilizarse como indicativo de la ausencia del analito en particular. Esto es útil cuando es necesaria una determinación cualitativa. Un mensaje apropiado puede crearse en una unidad de comparación de datos en el instrumento analítico o en una computadora utilizada para la evaluación de datos y puede mostrarse a la persona que supervisa el proceso. En la alternativa, los datos pueden almacenarse en una memoria y conectarse con datos de otras fuentes y transferirse a otra parte.

Otro método para la determinación cualitativa de la presencia de un analito puede aplicarse si se prefiere a una curva de crecimiento que no alcanza completamente su fase de saturación. Esto puede ocurrir con un pequeño número de mediciones o un aumento de señal tardío. El método consiste en la comparación estadística de la hipótesis de estimación (lineal) de la curva negativa y la hipótesis de estimación (modelo) de la curva de crecimiento total. Para ello, se determina la suma de las desviaciones al cuadrado de ambos modelos de regresión y la regresión lineal. Junto con los números apropiados para los grados de libertad, se realiza un test estadístico F. Si el valor F es inferior al

valor predeterminado puede asumirse que el modelo de curva total no es significativamente diferente a la regresión lineal (hipótesis nula). La FIG 3 muestra la representación gráfica de este método. La representación matemática de este test se muestra en la siguiente fórmula

imagen1

en la que tenemos

F: valor F calculado SSR(L) suma de los residuales al cuadrado de una regresión lineal, 10 SSR(M) suma de los residuales al cuadrado del modelo

de regresión,

n Número de puntos de medición de datos, y

m Número de parámetros del modelo, 7 en el modelo de

la fórmula I.

imagen1

en la que tenemos xi número de ciclos de los datos de medición, yi datos de medición, y^ valor de modelo calculado, y p parámetro del modelo.

En más detalle, si el valor F es inferior al valor predeterminado (por ejemplo 20) puede asumirse que la presente curva de crecimiento no es significativamente diferente de una curva negativa. La presencia de un valor F por encima de un valor predeterminado en sí puede utilizarse como indicativo de la presencia del analito y la determinación de un valor F por debajo de un valor predeterminado puede utilizarse como indicativo de la ausencia del analito en particular. Esto es útil cuando es necesaria una determinación cualitativa. Puede crearse un mensaje apropiado en una unidad de comparación de datos en el instrumento analítico o en la computadora utilizada para la evaluación de los datos y puede mostrarse a la persona que supervisa el proceso. Como alternativa, los datos pueden almacenarse en una memoria y conectarse con datos de otras fuentes y transferirse a otro lugar.

Una refinación del proceso de regresión consiste en simplificar el modelo de PCR en el caso que uno de los parámetros p4, p5, p6, p7 no sean significativamente diferentes de 0. Para ello, puede utilizarse un test t similar para el parámetro utilizando la matriz de covarianza. Entonces en un segundo paso el modelo de PCR refinado puede utilizarse con p4’=p5’=0 y p3’=2*p3. Esto representa una función sigmoide simple con una deriva en la línea basal y un paso opcional. Después de una regresión no lineal similar a la descrita anteriormente, el test t para p3’ puede realizarse de forma similar para la discriminación positiva ne

gativa.

El resultado de la transformación de los datos de medición para una curva de crecimiento que utiliza una regresión no lineal que se ajusta a la curva de crecimiento utilizando un modelo de acuerdo con la invención, preferiblemente la fórmula de la invención, conduce a una curva de crecimiento final que se define por unos parámetros optimizados. Esta curva de crecimiento relaciona cada valor del eje X con un valor del eje Y que puede alterarse si se compara con los datos de medición. Por lo tanto, la curva de crecimiento corrige convenientemente los picos en los datos de medición debidos a errores de lectura del detector o creados a partir de una falsa irradiación.

El siguiente paso preferible del método de acuerdo con la invención comprende comparar una o más características de las curvas de crecimiento con los valores de referencia. Los valores de referencia pueden diferir dependiendo del propósito de la determinación. Normalmente, los valores de referencia consisten de cualquier parámetro o combinación de parámetros de la curva de crecimiento de una medición de referencia.

Dos ejemplos se visualizan en la FIG 4. Se utilizan como valores típicos ambos p2 y p3/p1. Si los valores de parámetro de señal de control interno están en el rango inferior izquierdo de la gráfica, se puede asumir la expiración del reactivo. Si los valores del parámetro de la señal de control interno están en el rango inferior derecho, el contenido de glóbulos rojos en la muestra puede detectarse.

La presente invención es útil para la determinación cualitativa del analito, es decir, la determinación que el analito está presente en una cantidad que excede un umbral predefinido ("positivo" o "negativo"). En este caso, es preferible utilizar una medición estadística para determinar la presencia o ausencia del analito.

La presente invención también es útil para la determinación cuantitativa de los analitos, es decir para determinar la cantidad de analito o su concentración en la muestra. En este caso, se utiliza la curva de crecimiento optimizada en lugar de los datos de medición originales. Por lo tanto, los efectos negativos de la imprecisión de los datos de medición son mínimos, al reducir los valores atípicos en los datos de medición. Otros pasos de cálculo para determinar el resultado final pueden ser los mismos que en el método estándar.

Otro sujeto de la invención es un instrumento analítico para determinar la presencia de un analito como se define en la reivindicación 7.

Dichos instrumentos pueden montarse a partir de unidades disponibles comercialmente. La presente invención, no obstante, proporciona que el uso de unidades más baratas pueden lograr los mismos resultados o incluso mejores en la determinación de analitos. En particular, la unidad de detección de señal utilizada en el instrumento de la presente invención puede elegirse por ser menos precisa. Este es el caso de por ejemplo, el conversor de valores analógicos a digital con un número reducido de dígitos, la omisión de

preamplificadores o una fuente de luz más oscura. Una opción especialmente atractiva es utilizar filtros de transmisión de longitud de onda más estrechos que producen una reducción de cruce de luz (interferencia) en el caso de de

5 tección multicolor en paralelo de múltiples analitos. Las unidades de acuerdo con la invención no necesitan estar separadas físicamente, pero pueden combinarse en una o más unidades combinadas.

En un aspecto preferible de la invención, el instru

10 mento comprende una fuente de luz. De nuevo, como el algoritmo de la presente invención puede ordenar mucho mejor los picos creados al variar las intensidades de la fuente de luz, pueden utilizarse fuentes de luz más baratas que las utilizadas en la actualidad, o es menos necesaria la

15 estabilización de la fuente de luz. En un aspecto de la invención, la señal es una señal de fluorescencia. Los detectores de luz se adaptan por ser capaces de recibir y detectar la fuente de fluorescencia.

El modelo utilizado en el programa de computadora uti20 lizado por el instrumento se basa en la fórmula o sus equivalentes matemáticos.

imagen1

El instrumento puede utilizarse para la determinación cuantitativa del analito, si dicha computadora se carga además con un algoritmo para seleccionar un valor de dicha

25 curva de crecimiento indicativo de la concentración de dicho ácido nucleico presente en dicha muestra.

Las ventajas de utilizar el nuevo algoritmo son numerosas. Debido a la imprecisión de los ensayos, por ejemplo por eventos inesperados durante la medición, como picos, los datos de medición pueden ser incorrectos. El nuevo algoritmo mejora la corrección de dichos datos erróneos. Por otro lado, los componentes del instrumento utilizado para la detección pueden contribuir a las variaciones en los datos de medición no relacionados con la presencia del analito, por ejemplo por la variación de la intensidad de la luz proporcionada por la fuente de luz. Dichas variantes pueden corregirse mediante el nuevo modelo de curva de crecimiento. Además, es posible utilizar componentes en el instrumento con una precisión reducida, debido a que el modelo corregirá la imprecisión creada por este componente.

El método de la invención para la comparación de las curvas de crecimiento utiliza números característicos determinados de forma precisa de la curva de crecimiento y estadísticamente estima cualquier error, por ejemplo en CT, intersección de línea basal, deriva de la línea basal (pendiente), nivel de señal máximo (en relación al 100% de la escisión de la sondad de oligonucleótidos, hibridación, intercalación o similar), eficiencia de escisión, eficiencia de amplificación, aumento relativo y absoluto de la señal, número de ciclos umbral primer o segundo derivado máximo y otras mediciones "codo".

Un ejemplo de curva de crecimiento que muestra el significado físico de los parámetros de acuerdo con la invención se muestra en la FIG 1. Muestra los datos de medición

en puntos de luz, una curva de crecimiento continua, una línea de base (línea inferior) y una línea de saturación (línea superior). p1 es el valor y para x = 0 en la línea de base, p2 es la pendiente de la línea de base, p3 es el

5 valor y para x = 0 en la línea de saturación, p4 es la pendiente de la curva de crecimiento en el valor x de p5, y p6 es la pendiente de la curva de crecimiento en x = p7.

Mientras que la invención anterior se ha descrito en cierto detalle con el propósito de aclarar y facilitar su

10 entendimiento, quedará claro para el experto en la materia al leer esta descripción que pueden realizarse varios cambios en la forma y el detalle sin alejarse del alcance de la invención, definido por las reivindicaciones anexadas.

15

Claims

Reivindicaciones

1. Un método para determinar la presencia de ácidos nucleicos en una muestra, que comprende:

-proporcionar una mezcla de reacción que contenga di5 chos ácidos nucleicos,

-detectar señales a partir de dicha mezcla de reacción en intervalos conocidos,

-transformar dichas señales en datos de medida, y

-crear a partir de dichos datos de medida una curva

10 de crecimiento mediante un algoritmo matemático, que se caracteriza porque dicho algoritmo matemático comprende la fórmula matemática del modelo de curva de crecimiento

imagen1

o sus equivalentes matemáticos, en la que los parámetros son los siguientes: 15 x es una medida del tiempo o secuencia de las medidas p1 es la intersección de la curva de crecimiento al

inicio de la reacción, p2 es la deriva relativa de la línea basal, p3 es la distancia entre la línea basal y la línea de

20 saturación,

p4 es la pendiente en el punto de inflexión de una primera función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento exponencial,

p5 es el punto de inflexión de una primera función 25 sigmoidal multiplicativa, p6 es la pendiente en el punto de inflexión de una se

gunda función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento a saturación, y

p7 es el punto de inyección de una segunda función sigmoidal multiplicativa en la que los valores óptimos de los parámetros se determinan mediante un algoritmo de ajuste de regresión no lineal a dichos datos de medida.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho algoritmo comprende la formula

imagen1

o sus equivalentes matemáticos, en la que: 10 p1 es la intersección de la curva de crecimiento al

inicio de la reacción, p2 es la deriva relativa de la línea basal, p3 es la distancia entre la línea basal y la línea de

saturación,

15 p4 es la pendiente en el punto de inflexión de una primera función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento exponencial,

p5 es el punto de inflexión de una primera función sigmoidal multiplicativa,

20 p6 es la pendiente en el punto de inflexión de una segunda función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento a saturación, y

p7 es el punto de inyección de una segunda función sigmoidal multiplicativa, 25 p8 es el tamaño de paso de la señal en un punto en el que cambian las condiciones de medida, y

sign significa el signo de la función (x) = x/√(x2), x <> 0; sign (0) = 0 y s es un número de paso de ciclo predeterminado a partir del cual la condición de medida cambia.
3.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en el que para los cálculos adicionales se reemplazan dichos datos de medida por datos generados utilizando dicho modelo de curva de crecimiento.
4.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende la comparación de uno o más datos característicos de dicha curva de crecimiento con valores de referencia correspondientes.
5.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende la utilización de un algoritmo para determinar un valor a partir de dicha curva de crecimiento indicativa de la concentración de dichos ácidos nucleicos presente en dicha muestra.
6.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que además comprende el paso de determinar a partir de dicha curva de crecimiento si los ácidos nucleicos están presentes o ausentes en dicha mezcla de reacción
7.

Un instrumento analítico para la determinación de la presencia de un analito, que comprende:

-una unidad de detección de la señal,

-una unidad de transformación de señal en datos de medida,

- una memoria de datos de medida,

-una unidad de transformación de los datos de medida

en curva de crecimiento,

-una unidad de transformación de la curva de creci

miento en datos digitales, y

-una unidad de comparación de la curva de crecimien5 to,

cuya unidad de transformación de dichos datos de medida en curva de crecimiento comprende un ordenador que contiene un algoritmo totalmente automatizado para el ajuste de regresión no lineal de acuerdo con la reivindicación 1.

10 8. El instrumento de acuerdo con la reivindicación 7, que además comprende una fuente de luz.
9. El instrumento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha señal es una señal fluorescente.
10. El instrumento de acuerdo con la reivindicación 7,

15 en el que dicho ordenador contiene adicionalmente un algoritmo para seleccionar un valor de dicha curva de crecimiento indicativo de la concentración de dichos ácidos nucleicos presentes en dicha muestra.