ES2611592T3 - Amplificación de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la presencia y/o cantidad de un primer ácido polinucleico en una muestra que comprende someter a la muestra a amplificación de ácidos nucleicos en la que el producto se puede detectar por la presencia de una señal generada por la formación del ácido polinucleico a partir del primer polinucleótido caracterizado porque la reacción de amplificación de ácidos nucleicos se realiza, en el mismo recipiente de reacción, con una cantidad predeterminada de un segundo ácido polinucleico que se somete a amplificación de ácidos nucleicos, el producto de la cual se puede detectar por la presencia de la misma señal generada por la formación de ácidos polinucleicos a partir del segundo polinucleótido como la generada por la formación de ácidos polinucleicos a partir del primer polinucleótido en el que las señales de la amplificación del primer ácido polinucleico y el segundo ácido polinucleico se resuelven en base a un conjunto de lecturas de señal frente a tiempo y en el que el producto del segundo ácido polinucleico se produce con diferentes cinéticas de reacción del producto del primer ácido polinucleico de tal manera que el segundo ácido polinucleico actúa como un control interno para el método.

Description

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Amplificacion de acidos nucleicos Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere al campo de la amplificacion de acidos nucleicos. En particular, se refiere a un metodo para la amplificacion especlfica y deteccion de una muestra de prueba y un control interno en el mismo recipiente de reaccion.

ANTECEDENTES

La tecnologla de amplificacion de acidos nucleicos (NAAT) es una herramienta inestimable y potente en muchas areas de la investigacion y el diagnostico. Dichas tecnicas de NAAT permiten la deteccion y cuantificacion de un acido nucleico en una muestra con sensibilidad y especificidad altas as! como el analisis cuantitativo de acidos nucleicos en una muestra.

La amplificacion de acidos nucleicos puede usarse para determinar la presencia de una acido nucleico plantilla particular en una muestra, como se indica por la presencia de un producto de la amplificacion despues de la implementacion de una NAAT particular. A la inversa, la ausencia de cualquier producto de la amplificacion indica la ausencia de acido nucleico plantilla en la muestra. Dichas tecnicas son de gran importancia en aplicaciones de diagnostico, por ejemplo, para determinar si un patogeno esta presente en la muestra.

El estado de la tecnica ha descrito una variedad de tecnicas de termociclado e isotermicas para la amplificacion de acidos nucleicos. Las tecnicas de termociclado, como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), usan ciclado de temperatura para conducir ciclos repetidos de slntesis de ADN que llevan a que grandes cantidades de ADN nuevo sean sintetizadas en proporcion a la cantidad original de ADN plantilla. Tambien se han desarrollado una variedad de tecnicas isotermicas que no conflan en el termociclado para conducir la reaccion de amplificacion. Se han desarrollado tecnicas isotermicas, que utilizan polimerasas de ADN con actividad de desplazamiento de cadenas para reacciones de amplificacion que no implican un paso de slntesis de ARN. De manera similar, para las reacciones de amplificacion que implican un paso de slntesis de ARN, se han desarrollado tecnicas isotermicas que pueden usar transcriptasa inversa, RNasa H y/o una polimerasa de ARN dependiente de ADN (ver por ejemplo, Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies - A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Volumen 27, Publicacion 3 Marzo 2008, paginas 224 - 243).

Una cosa que todas las tecnicas de NAAT tienen en comun es que es a menudo esencial que la reaccion se monitorice por controles adecuados para asegurar que un resultado negativo se debe realmente a la ausencia del acido nucleico en lugar que a otros factores, por ejemplo la presencia de inhibidores en una muestra. El estado de la tecnica describe varios metodos para lograr esto.

Un metodo es realizar dos reacciones de amplificacion en recipientes separados en paralelo. Un recipiente contiene la muestra de prueba y la otra contiene un acido nucleico de una secuencia conocida, que sirve como control positivo, ademas de la muestra de prueba. Si no se detecta amplificacion en la muestra de prueba pero puede detectarse un producto de la amplificacion en la muestra de control, la prueba puede considerarse verdadero negativo. De igual manera, si no hay producto de la amplificacion en el control, debe haber presente in inhibidor en la muestra.

El uso de un control interno, es decir, un control que se amplifica en el mismo recipiente de reaccion, tiene algunas ventajas sobre usar dos recipientes para establecer si hay inhibidores. En primer lugar, se requieren menos tubos y reactivos, reduciendo de esta manera el coste unitario por prueba donde se requiere absolutamente un control de inhibidores. En segundo lugar, se requieren menos manipulaciones. En tercer lugar, como se requieren menos tubos, pueden analizarse mas muestras por capacidad unitaria del hardware usado para ejecutar la reaccion. Por ejemplo, usando un sistema de deteccion de 96 pocillos estandar, pueden analizarse 96 muestras usando un control interno mientras que solo pueden analizarse 48 muestras cuando se deben usar dos recipientes por prueba.

El metodo de control interno presenta el desaflo tecnico de diferenciar entre la senal resultante del polinucleotido objetivo en la muestra y la senal resultante del acido nucleico de control. Para detectar las senales de una muestra y acido nucleico de control en el mismo recipiente, es necesario que la secuencia del acido nucleico de control tenga alguna diferencia asociada del acido nucleico objetivo para permitir a un sistema de deteccion diferenciar entre los dos productos amplificados. Mas aun, necesita haber algun medio de diferenciar las senales respectivas de los dos procesos de amplificacion. Esto se ha logrado por el uso de sistemas indicadores separados para la muestra de prueba y el control respectivamente. Por ejemplo, pueden emplearse dos sondas fluorescentes de diferentes maximos de emision (o lo suficientemente diferentes de sus senales respectivas para ser diferenciadas) una de las cuales solo da una senal en el enlace a los productos del proceso de amplificacion de la muestra de prueba, y uno de los cuales solo da una senal cuando enlaza con los productos de los productos de lo

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control. De este modo, detectando dos senales independientes de una muestra, es posible seguir los procesos de amplificacion respectivos en el mismo recipiente de reaccion.

Alternativamente, cuando sea apropiado, puede realizarse un analisis de curva de fusion de los resultados de una reaccion de amplificacion para evaluar si hay senal de la muestra de prueba y el control. Esto puede abarcar o no el uso de sondas fluorescentes (ver, por ejemplo EP1109934). La muestra de prueba y el control son de esta manera amplificados con las mismas cineticas de reaccion. La desventaja del analisis de curva de fusion es que requiere un paso adicional tras la reaccion de amplificacion para detectar el control que no solo alarga el proceso sino que tambien anade complejidad significativa al hardware que se requiere para detectar el control y el acido nucleico amplificado. Cuando hay que emplear dos o mas sistemas indicadores, el hardware usado para detectar el indicador debe ser lo suficientemente sofisticados para realizar mediciones y diferenciar al menos dos senales indicadoras. Ademas, para aplicaciones practicas en diagnosticos, estas lecturas deben realizarse en una muestra pequena, o multiples muestras pequenas: tlpicamente los volumenes de reaccion estan entre 10-100 pl para evitar costes de reactivos altos por prueba. Esto requiere hardware muy sofisticado que es muy caro.

Por lo tanto, hay una necesidad en la tecnica de metodos de deteccion mejorados para la detection de acidos nucleicos y controles internos en el mismo recipiente de reaccion. En particular, un metodo por el que un control interno pueda ser monitorizado sin la necesidad de que dos senales indicadoras separadas se midan independientemente, serla de gran beneficio ya que esto omitirla la necesidad de hardware caro que pueda medir senales multiples tras la NAAT. Ademas, hay algunas tecnicas de NAAT que utilizan tecnologlas indicadoras por las que no es posible medir mas de un tipo de senal de una muestra. Dichos metodos incluyen sistemas indicadores basados en bioluminiscencia (Solicitudes de Patente Internacional publicadas WO 2004/062338 y WO 2006/010948), turbidez (Solicitud de Patente Internacional Publicada Wo 01/83817) o ciertas metodologlas electroqulmicas.

SUMARIO DE LA INVENCION

La invention proporciona un metodo para la amplificacion especlfica y deteccion de un acido polinucleico y un control interno en el mismo recipiente de reaccion, como se define en las reivindicaciones.

Por lo tanto, en una realization la presente invencion proporciona un metodo para determinar la presencia y/o cantidad de un primer acido polinucleico en una muestra que comprende someter la muestra a la amplificacion del acido nucleico en la que el producto se puede detectar por la presencia de una senal generada por la formation del acido polinucleico del primer polinucleotido caracterizado porque la reaccion de amplificacion del acido nucleico se realiza, en el mismo recipiente de reaccion, con una cantidad predeterminada de un segundo acido polinucleico que se somete a amplificacion del acido nucleico, el producto del cual se puede detectar por la presencia de la misma senal generada por la formacion del acido nucleico a partir del segundo polinucleotido como la generada por la formacion del acido polinucleico a partir del primer polinucleotido en donde las senales de la amplificacion del primer acido polinucleico y el segundo acido polinucleico se resuelven en base a un conjunto de lecturas de senal frente a tiempo y en donde el producto del segundo acido polinucleico se produce con diferentes cineticas de reaccion a partir del producto del primer acido polinucleico de tal manera que el segundo acido polinucleico actua como un control interno para el metodo.

En esta especificacion el termino "primer acido polinucleico" se usa de manera intercambiable con "muestra de prueba" y "polinucleotido objetivo".

El producto de la amplificacion del acido nucleico se puede detectar por la presencia de una senal generada por la formacion del acido polinucleico. La senal puede generarse a partir del producto de la amplificacion directamente (por ejemplo detectando producto polinucleico generado por la amplificacion del acido nucleico) o la senal puede generarse a partir de subproductos de la amplificacion (por ejemplo detectando productos que se producen durante el proceso de amplificacion).

El principio subyacente de la invencion es el reconocimiento de que un control interno no necesita necesariamente implicarse en exactamente el mismo proceso de amplificacion que el de la muestra de prueba. Mas bien, tanto la muestra de prueba y el estandar necesitan solamente compartir el mismo recipiente y reactivos de amplificacion pero no necesariamente procesos de amplificacion exactamente equivalentes. Por lo tanto, es posible distinguir los productos de la amplificacion del acido nucleico objetivo y del control.

De esta manera es posible combinar en un unico recipiente dos reacciones de amplificacion que tienen diferentes cineticas de amplificacion. Cuando los dos metodos de amplificacion tienen cineticas de reaccion lo suficientemente diferentes es posible, a partir de un conjunto de lecturas de senal frente a tiempo, resolver senales resultantes de la amplificacion de la muestra de prueba, de la amplificacion resultante del control interno. Las senales respectivas de los dos procesos de amplificacion pueden variar, por ejemplo, respecto a su magnitud de senal maxima. De esta manera, se logra un control interno efectivo que puede analizarse en hardware mas simple que el de los metodos fluorescentes que requieren medir dos senales del recipiente.

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Un metodo de acuerdo con la invencion puede ponerse en practica con cualquier NAAT conocida en la tecnica en la que el producto de la amplificacion se pueda detectar por la presencia de una senal generada por la formacion del acido nucleico.

Algunas tecnicas de NAAT requieren que la temperatura de la muestra se cicle entre diferentes temperaturas para lograr la amplificacion de una secuencia de acidos nucleicos objetivo. Ejemplos de tales metodos son Reaccion de Cadena de Polimerasa (PCR, US 4683202) y Reaccion de Cadena de Ligasa (LCR, US5185243). Otras NAAT pueden funcionar sustancialmente a una temperatura individual. De estas algunas son dependientes de la transcripcion como parte del proceso de amplificacion, por ejemplo Amplificacion Basada en Secuencia de Acidos Nucleicos (NASBA, US5409818) y Amplificacion Mediada por Transcripcion (TMA; US5399491) mientras otras son dependientes de la accion de una Helicasa o Recombinasa por ejemplo Amplificacion Dependiente de Helicasa (HDA; WO2004027025) y Amplificacion de Polimerasa Recombinasa (RpA; WO03072805) respectivamente, otras son dependientes de la actividad de desplazamiento de la cadena de ciertas polimerasas de ADN, por ejemplo, Amplificacion por Desplazamiento de la Cadena (SDA; US455166), Amplificacion Isotermica mediada por Bucle (LAMP; WO 00/28082, WO 01/34790), Reaccion de Desplazamiento Quimerico (RDC) (WO9794126), Amplificacion en Clrculo Rodante (RCA; Lizardi, P. M. et al. Nature Genetics, (1998) 19.225-231), Amplificacion Quimerica Isotermica de Acidos Nucleicos (ICAN; WO0216639, Proceso de Amplificacion SMart (SMAP; WO2005063977).

Los metodos usados para la amplificacion del acido nucleico objetivo y el control pueden ser el mismo o diferentes.

En una realizacion de la invencion el control interno se amplifica usando una amplificacion del acido nucleico exponencial mientras que la muestra de prueba se amplifica usando un proceso de amplificacion no exponencial. Sin embargo, en una realizacion preferida es el control interno el que se amplifica usando una amplificacion del acido nucleico no exponencial y la muestra de prueba usando una amplificacion del acido nucleico exponencial. Esto se prefiere ya que hay menos posibilidades de que la amplificacion asociada con el control interno deje fuera de la competencia la de la muestra de prueba.

Ejemplos de NAAT exponenciales que pueden usarse de acuerdo con las realizaciones de la presente invencion incluyen, pero no estan limitadas a, reaccion de cadena de polimerasa, SDA, LAMP, ICAN, SMAP, RDC, (exponencial)-RCA, NASBA, TMA, HDA y RPA.

Ejemplos de NAAT no exponenciales que pueden usarse de acuerdo con las realizaciones de la presente invencion incluyen, pero no estan limitadas a, Amplificacion en circulo rodante, PCR asimetrica, LAMP asimetrica (aislamiento de ADN monocatenario de productos de Amplificacion Isotermica mediada por Bucle (LAMP). Kentaro Nagamine, Yoko Kuzuhara et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.290, No.4, 1195-1198, 2002) o cualquiera de las NAAT exponenciales anteriormente mencionadas realizadas bajo condiciones que afectan a la capacidad del proceso de amplificacion de recopiar con exito copias del acido nucleico plantilla original.

La invencion no requiere estrictamente que el control interno se amplifique por un proceso de amplificacion no exponencial (por ejemplo lineal) y al muestra de prueba por un proceso exponencial. Mas bien, es solamente necesario que las cineticas y/o amplitudes de senal asociadas con las reacciones de amplificacion respectivas difieran significativamente. Por lo tanto, en una realizacion adicional, la invencion proporciona un metodo en el que el primer acido nucleico y el control interno se amplifican usando amplificacion del acido nucleico exponencial y en el que dos reacciones de amplificacion tienen cineticas de reaccion diferentes, es decir, cuando las dos reacciones tienen fundamentalmente diferente descripcion cinetica (es decir, cuando una descripcion matematica diferente es necesaria para describir las cineticas del control interno en comparacion con la muestra de prueba, por ejemplo cuando un proceso es lineal y el otro es exponencial). En esta realizacion, es necesario ser capaz de cerciorarse, a partir de una muestra negativa, que la senal del control interno no es, de hecho, una senal de la muestra de prueba. Por ejemplo, estas cineticas de reaccion diferentes pueden lograrse en virtud de la senal del control interno

a) que tiene una amplitud menor o mayor que la de la muestra de prueba

b) que tiene un tiempo de retardo mas largo o mas corto antes de la amplificacion maxima

c) que tiene una tas intrlnseca mas lenta o mas rapida de amplificacion, o

Las caracterlsticas anteriores permiten que algoritmos matematicos analicen un conjunto de lecturas de senales frente al tiempo para cerciorarse que la senal abarca la de la muestra positiva, una senal del control interno solamente o ninguna senal de o la muestra de prueba o el control interno (como ocurrirla en presencia de un inhibidor).

Por ejemplo, con referencia al i) anterior, podrla emplearse un algoritmo para comprobar si la senal alcanzo alguna vez una amplitud de Ais, asociada con la amplitud esperada del control interno. Si la amplitud no logro alcanzar una amplitud de Ais esto se asociarla entonces con la inhibicion de la muestra. Si la amplitud fue mayor de Ais, se esperara que la senal provenga de la muestra de prueba. "Mayor que X" por lo tanto significa que la amplitud

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es al menos 1.2 veces, 1.5 veces, 1.8 veces, 2 veces, 2.5 veces, 3 veces, 3.5 veces, 4 veces, 4.5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8, veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o incluso 100 veces mayor que la amplitud del control interno. El valor de Ais puede por lo tanto determinarse facilmente realizando el metodo de la invencion sin el primer acido polinucleico.

De manera similar, con referencia al ii) anterior, podrla emplearse un algoritmo para comprobar si se logro una senal de amplitud particular se logro en el momento TIS, que se asociarla exclusivamente con una senal del control interno, o si una senal de una amplitud particular no se alcanzo hasta despues del momento Tis, que se asociarla con una muestra inhibida. Si una senal de una amplitud particular se alcanzo antes del momento Tis, esto se asociarla con una senal de la muestra de prueba.

Ademas, con referencia al iii) anterior, podrla emplearse un algoritmo para comprobar si la tasa de cambia de una senal alcanzo una cantidad predeterminada ASis asociada exclusivamente con la senal de un control interno, si la tasa de cambio de la senal no excedio la ASis asociada con una muestra inhibida o si la senal fue mayor que ASis, que se asociarla entonces con una senal de una muestra positiva. "Mayor que ASis" significa de este modo que la tasa de cambio de una senal es al menos 1.2 veces, 1.5 veces, 1.8 veces, 2 veces, 2.5 veces, 3 veces, 3.5 veces, 4 veces, 4.5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8, veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o incluso 100 veces mayor que la tasa de cambio del control interno. El valor de ASIS puede de este modo determinarse facilmente realizando el metodo de la invencion sin el primer acido polinucleico.

Ademas, podrla emplearse un algoritmo para ajustar la senal generada de una muestra con modelos cineticos particulares para cerciorarse que descripcion cinetica encaja mejor con los datos. Por ejemplo, si la tasa de cambio de la senal encajo con una ecuacion de tasa exponencial con un ajuste mejor que una ecuacion de tasa lineal entonces la senal puede asignarse a la amplificacion del acido polinucleico objetivo en la muestra de prueba en lugar que al control interno, mientras que si la senal se ha ajustado mejor a una ecuacion de tasa lineal entonces la senal podrla asignarse al control interno, si la senal se aproxima a una llnea recta de gradiente cero, entonces la senal podrla asignarse para ser la de una muestra inhibida. Los algoritmos adecuados seran evidentes para los expertos en la tecnica.

Hay una variedad de maneras en la que las cineticas de los procesos de amplificacion pueden variar. Por ejemplo, las cineticas de amplificacion pueden describirse por a) la tasa constante de amplificacion b) el tiempo para alcanzar la amplificacion maxima c) las amplitudes de partida y finales del parametro medido (es decir, las aslntotas superior e inferior de la curva) y d) si la amplitud de la senal en el momento de amplificacion maxima es mas cercana a la aslntota superior o inferior. Dicha descripcion de una curva cinetica se conoce como Curva de Richards (ver Figura 1). Sin embargo, tambien pueden preverse una variedad de otros medios para describir y diferenciar entre dos procesos cineticos diferentes distintos de los descritos en la Curva de Richards.

Pueden lograrse diferentes cineticas de amplificacion de varias maneras. En una realizacion de la invencion, se proporciona un control interno en el que los sitios de enlace de cebadores usados para amplificar exponencialmente la secuencia de polinucleotidos de interes estan o parcialmente ausentes o son no optimos en el control. Varios ejemplos de como puede disenarse dicho control interno se muestran en la Figura 10. Por ejemplo en metodos que requieren dos sitios de enlace de cebadores (A y B) para la amplificacion exponencial (por ejemplo reaccion de cadena de polimerasa, amplificacion por desplazamiento de cadena y Amplificacion Quimerica Isotermica de Acidos Nucleicos) se pueden lograr diferentes cineticas por los siguientes medios:

- solo uno de los sitios de enlace de cebadores (A o B) esta presente en el control interno

- ambos sitios de enlace de cebadores estan presentes pero mas separados en la secuencia en comparacion con el polinucleotido objetivo. "Mas separados" significa de este modo que la distancia entre los dos cebadores es mayor por al menos 10 nucleotidos, 50 nucleotidos, 100 nucleotidos, 500 nucleotidos, 1000 nucleotidos o incluso 5000 nucleotidos

- ambos sitios de enlace estan presentes pero separados por una region que es mas lenta de copiar para una polimerasa en comparacion con el polinucleotido objetivo

- ambos sitios de enlace de cebadores estan presente pero uno o ambos de los sitios de cebadores contienen desajustes que provocan que la amplificacion tenga lugar menos eficientemente

- uno o ambos sitios de enlace de cebadores estan presentes en una molecula de acido polinucleico circular pero en una orientacion que evita la amplificacion exponencial

Todos estos ejemplos podrlan resultar en cineticas de amplificacion para el control interno que son distinguibles del proceso exponencial que amplifica el acido polinucleico objetivo y son por lo tanto una realizacion de la presente invencion. Este enfoque no requiere que haya presente ningun reactivo adicional en la mezcla de amplificacion distinto que el acido polinucleico del control interno; por lo tanto es facil prever como es posible acomodar tanto la amplificacion de la muestra de prueba como la amplificacion del control interno en la misma mezcla de reaccion en la que ambos procesos estan sometidos a las mismas concentraciones de polimerasa, precursores de polinucleotidos, pH, sales y otros aditivos.

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Cuando un metodo de amplificacion usa mas de dos sitios de enlace de cebadores para permitir la amplificacion exponencial de un acido polinucleico objetivo (por ejemplo Amplificacion Isotermica mediada por Bucle (LAMP)), algunos de estos sitios de cebadores se requieren absolutamente para la amplificacion exponencial, por lo que algunos meramente afectan la tasa de amplificacion. Como tal, variando que sitios de cebadores hay presentes en el control interno, se pueden modular las cineticas de amplificacion. Este metodo forma una realizacion de la invencion.

La generacion de secuencias de polinucleotidos del control interno que contienen solo un subconjunto de sitios de enlace de cebadores deseados e intercaladas con secuencias de eleccion es facil usando tecnologlas de ADN recombinantes modernas. Ademas la generacion de plantillas circulares es conocida en la tecnica a traves del uso de ligasas de ADN.

En una realizacion adicional el control interno se amplifica por cebadores diferentes, o cebadores parcialmente diferentes, en comparacion con la secuencia de polinucleotidos objetivo de interes ofreciendo as! mas medios para amplificar el polinucleotido del control interno a traves de un perfil cinetico significativamente diferente (Figura 1l). La palabra "diferente" de este modo significa que los cebadores usados para la amplificacion del acido polinucleico objetivo y el control interno tienen menos del 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30% o incluso menos del 25% de homologla. Ademas, limitando la cantidad de los cebadores usados para la amplificacion del control interno, es posible limitar la cantidad total de amplicon producido del acido polinucleico del control interno, esto significarla que la senal del control interno serla de menor amplitud que la de la muestra de prueba. "Limitar la cantidad" de este modo significa que los cebadores usados para la amplificacion del control interno se anaden en concentraciones que son menores del 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o incluso del 5% que las concentraciones de cebadores usados para la amplificacion del polinucleotido objetivo. Solo es necesario que el mecanismo de amplificacion proporcionado por estos cebadores diferentes sea compatible con el proceso de amplificacion asociado con la amplificacion de la muestra de prueba para que los dos procesos tengan lugar en el mismo recipiente. El experto en la tecnica, provisto con las ensenanzas de la presente invencion, sera capaz de cerciorarse de si los cebadores son adecuados para su uso en el proceso de amplificacion elegido.

En una realizacion adicional, se efectua un control interno tomando ventaja de la actividad de ciertas protelnas que actuan en las secuencias de polinucleotidos usadas como el control interno, por lo que la protelna genera sitios de cebado para la polimerasa usada dentro del polinucleotido de control, sin la necesidad de enlazar cebadores extranos en el proceso de amplificacion de tal manera que los polinucleotidos de novo resultantes de copiar el polinucleotido suministrado se genera a una tasa lineal (o mas lenta) que la del polinucleotido de interes de la muestra de prueba. Siempre que dicha protelna pueda funcionar bajo las condiciones de amplificacion es posible combinar ambas reacciones de amplificacion en el mismo recipiente. Ejemplos de dichas protelnas incluyen RNasa, Hs, Nickasas, endonucleasa de restriccion, y protelnas de cebado (por ejemplo protelna de cebado de adenovirus pTP). Una manera de lograr esto (Figura 12a) es anadir a la mezcla de la reaccion un acido polinucleico (que no es similar a la secuencia del acido polinucleico objetivo) que puede ser accionado por algun aditivo para generar sitios de cebado para la slntesis de acidos nucleicos. Preferiblemente el aditivo es una protelna que genera sitios de cebado o a traves de accion enzimatica en el polinucleotido de control interno o a traves de alguna capacidad de actuar como un cebador por si mismo. Por ejemplo, los inventores han descubierto que la TLi RNasaH puede provocar amplificacion lineal de polinucleotidos de una manera de tipo lineal bajo condiciones usadas para realizar metodos como Amplificacion Isotermica mediada por Bucle (LAMP) o RDC. De este modo se puede lograr un control interno anadiendo a la mezcla de amplificacion el polinucleotido del control interno (definido como un polinucleotido que no tiene homologla con el polinucleotido objetivo y sitios de enlace de cebadores deliberados para cualquiera de los cebadores usados que puedan ser accionados por el aditivo) y por ejemplo Tli RNasaH.

Alternativamente, un medio adicional de provocar la amplificacion del control interno sin sitios de enlace de cebadores o reactivos/protelnas/enzimas adicionales, es usar como un control interno un acido polinucleico capaz de auto-replicacion bajo las condiciones de amplificacion usadas para amplificar cualquier acido nucleico objetivo de la muestra de prueba (Figura 12b). Ejemplos de secuencias de acidos polinucleicos capaces de auto-replicacion incluyen plantillas circulares de experimentar amplificacion en circulo rodante (como en RCA lineal) o plantillas lineales por lo que las estructuras de horquilla generadas en el extremo 3' provocan que la plantilla se recopie a si misma (esto es una caracterlstica inherente de la tecnologla LAMP por ejemplo). Esto forma una realizacion adicional de la invencion.

Algunos procesos de amplificacion de acidos nucleicos han sido descritos como "lineales" en lugar de "exponenciales" en la tecnica, debido al hecho de que las cineticas de produccion de amplicones parecen ajustarse a una ecuacion de llnea recta. En muchos casos, cineticas "lineales" o "cercanas a lineales" han demostrado mejorar, por ejemplo, los metodos de cuantificacion o medios para amplificar varios objetivos de acidos nucleicos sin desplazar el amplicon a una poblacion particular de secuencias (algunos metodos de amplificacion exponencial son mas proclives a hacerlo). Ejemplos de metodos de amplificacion "lineales" o "cercanos a lineales" incluyen el RCA anteriormente mencionado (donde solo se usa un cebador individual), PCR asimetrico (WO03040397) y tambien "Amplificacion lineal de secuencias de acidos nucleicos especlficas" (US 6743605), tambien el nuevo metodo

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isotermico descrito en la W0/2007/030505, por nombrar unos pocos. En general, dichos metodos "lineales" describen procesos de amplification por los que la molecula de acido nucleico objetivo se copia (quizas repetidamente) pero las copias no se copian a ellas mismas.

Sin embargo, es posible para un proceso de amplificacion diferir de otro en virtud de que las copias se copian solo parcialmente, o se copian con menos eficiencia o se copian solo bajo ciertas condiciones.

En otra realization de la presente invention, se logran diferentes cineticas de reaction amplificando el primer acido polinucleico y el control interno con el mismo o dos procesos de amplificacion similares pero de tal forma que cada proceso de amplificacion pueda controlarse independientemente como para afectar a las cineticas de amplificacion. Los inventores han reconocido que dentro de un unico recipiente donde los reactivos para dos procesos de amplificacion distintos se mezclan, uno de los procesos de amplificacion puede favorecerse en virtud de las condiciones elegidas. De esta manera es posible afectar al "tiempo para la amplificacion maxima" como se describe en la curva de Richards, en particular. Esto puede permitir la diferenciacion cinetica de dos procesos de amplificacion y por lo tanto permitir la presente invencion. Por lo tanto, en una realizacion la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno se realiza con la misma tecnica de amplificacion, en la que la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno puede controlarse por condiciones extrlnsecas.

En una realizacion, las dos reacciones de amplificacion se realizan a temperaturas diferentes. En cualquier reaccion de amplificacion en la que la temperatura se cicle repetidamente o amplificaciones que se realizan mayormente de manera isotermica, la temperatura por lo tanto se refiere a la temperatura a la que el acido polinucleico se amplifica y/o la temperatura a la que los cebadores enlazan con los sitios de enlace de cebadores en el acido polinucleico. En esta realizacion es posible realizar la reaccion de amplificacion a una temperatura mediante la que se favorece uno de los dos procesos de amplificacion y por lo tanto tiene lugar a una tasa mas rapida que el otro proceso de amplificacion luego para cambiar mas tarde la temperatura de tal forma que el proceso de amplificacion pueda tener lugar a una tasa mas alta que antes del cambio de temperatura. Esto podrla lograrse por la selection cuidadosa de cebadores de tal manera que la temperatura de fusion (Tm) de los cebadores asociados con los procesos respectivos siendo significativamente diferentes. Se considera por lo tanto que dos cebadores que tienen Tm diferentes cuando la Tm de los cebadores difiere por al menos 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C o 10°C. Un metodo en el que se usan cebadores con valores de Tm diferentes para amplificar el primer acido polinucleico y el control interno es una realizacion de la presente invencion.

Otra manera de lograr esto, mas aplicable a PCR, es elegir dos procesos de amplificacion por los que el tiempo de extension requerido para la amplificacion es sustancialmente diferente. La reaccion puede comenzarse bajo condiciones en las que una de las reacciones de amplificacion puede tener lugar dado un tiempo de extension particular pero la otra se inhibe completa o sustancialmente; tras un periodo apropiado de tiempo el tiempo de extension podrla, por ejemplo aumentarse para adaptarse mejor al otro proceso de amplificacion. De esta manera serla posible cerciorarse si se observo la amplificacion (a traves de un tipo de senal individual) de dos procesos de amplificacion separados. Por lo tanto, un metodo en el que se varla el tiempo de amplificacion para lograr diferentes cineticas de reaccion forma una realizacion de la invencion.

Un ejemplo de un medio para producir la amplificacion de un control interno de cineticas notablemente diferentes a las usadas en la muestra de prueba se muestra en la Figura 5A. La tecnica BART-LAMP (Ensayo Bioluminiscente en Tiempo Real-Amplification Isotermica mediada por Bucle) que se usa en este ejemplo se describe con mas detalle a continuation. Aqul se muestra la salida BART de la amplificacion de una molecula de acido nucleico objetivo donde dos de los seis cebadores usados normalmente en el LAMP se omiten de la mezcla de amplificacion. Como consecuencia, para una cantidad dada de ADN objetivo, el tiempo de retardo para alcanzar la amplificacion maxima es mucho mas largo que el de la mezcla de amplificacion completa que contiene seis cebadores. Ademas, la amplitud del pico de luz de BART (un reflejo de la tasa de amplificacion intrlnseca) es mucho mas amplio que el observado normalmente con la mezcla de amplificacion completa que contiene los seis cebadores. Por lo tanto un medio de implementar la presente invencion es tener el control interno amplificado a traves del metodo LAMP pero omitiendo, por ejemplo, dos de los seis cebadores empleados normalmente para la amplificacion.

Un ejemplo adicional de un medio para producir amplificacion de un control interno de cineticas notablemente diferentes al usado en la muestra de prueba se muestra en la Figura 5b. En este caso, un proceso de amplificacion que depende de la Tli RNasaH y Bst Polimerasa se muestra actuando en un objetivo de ADN que consiste de ADN co-purificado con Tli RNasaH durante la purification de la Tli RNasa H de E.Coli recombinante. La amplificacion produce amplicon de muy alto peso molecular de una forma cercana a lineal. Como resultado, el pico de luz BART parece muy diferente (mas amplio) que los picos de luz resultantes de, por ejemplo LAMP. Como tal, el tipo de proceso de amplificacion demostrado aqul ejemplifica la presente invencion.

La verification de que la amplificacion dependiente de la Tli RNasa H puede actuar como un control interno se muestra en la Figura 6. Aqul el LAMP y el proceso de amplificacion dependiente de Tli RNasa se combinan en el mismo tubo. Cuando la prueba es positiva se ve un fuerte pico de luz de el LAMP a aproximadamente 30 minutos,

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cuando la prueba es negativa, se observa en su lugar la amplificacion lenta del proceso de amplificacion dependiente de Tli RNAsa. Esto refleja los datos del modelo mostrado en las figuras 3a y 3b (recordando que el BART indica la tasa instantanea de amplificacion mientras que la figura 3 muestra la acumulacion de acido nucleico). Como tal, es posible cerciorarse a partir de una muestra de si una muestra es o no positiva, negativa o esta inhibida combinando la reaccion LAMP con el proceso de amplificacion dependiente de Tli RNasa.

Otra ventaja importante de la presente invencion es que ambas reacciones de amplificacion pueden detectarse con la misma senal. Por lo tanto, el metodo de la presente invencion obvia la necesidad de adquirir y mantener equipamiento especializado que serla necesario si se necesitase detectar mas de una senal.

Varias senales que pueden usarse para detectar la amplificacion de acidos nucleicos son conocidas en la tecnica. Estas incluyen senales electroqulmicas, turbidez, senales de bioluminiscencia y senales fluorescentes. La deteccion por la misma senal por lo tanto significa que ambas reacciones de amplificacion se detectan con el mismo tipo de senal, por ejemplo bioluminiscencia.

En una realizacion, se usa el sistema indicador BART-LAMP para detectar las senales. Este sistema se ha explicado con detalle en la WO2004/062338 y la WO2006/010948. El BART es un ejemplo de un sistema indicador disenado para NAAT isotermicas que da un unico tipo de senal de una muestra: una senal bioluminiscente. El BART utiliza la deteccion dependiente de luciferasa de luciernaga de pirofosfato inorganico: este se produce en grandes cantidades cuando las secuencias 'objetivo' se detectan usando NAAT. Como tal, los diagnosticos moleculares pueden lograrse con BART simplemente midiendo la luz emitida de los tubos cerrados, en un ensayo de fase homogeneo. El BART esta probado con varias NAAT diferentes, funcionando entre 50-63° C. El indicador BART es un medio particularmente efectivo de seguir la tasa de amplificacion de una NAAT ya que la salida de luz representa una medida de la tasa instantanea de amplificacion (mientras que las salidas fluorescentes muestran la acumulacion de una senal y por lo tanto las mediciones tienen que diferenciarse para obtener las tasas de amplificacion). A modo de ejemplo, la Figura 4 muestra el BART siendo usado en conjuncion con LAMP para detectar una serie de dilucion de una molecula de ADN objetivo particular. Observar que a medida que la cantidad de ADN objetivo en la muestra disminuye, la fase de retardo para alcanzar el tiempo de incremento de luz maxima aumenta (Que es proporcional a la fase de retardo para alcanzar la amplificacion maxima). Dicho de otra manera, el tiempo para alcanzar el pico de luz caracterlstico asociado con muestras positivas en BART aumenta en proporcion inversa a la cantidad de acido nucleico objetivo en la muestra. Se hace hincapie en que aunque ejemplos adicionales hacen uso del sistema indicador BART, la presente invencion no esta limitada al uso del BART y es igualmente aplicable a metodos como fluorescencia, turbidez, otras tecnicas espectroscopicas o metodos de medicion electroqulmicos.

El segundo acido polinucleico, que actua como un control interno, es necesario que sea elegido de tal manera que su secuencia sea lo suficientemente diferente de la secuencia del primer polinucleotido. Dos acidos polinucleicos son considerados suficientemente diferentes cuando son menos del 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, o incluso 5% homologos. La cantidad de acido nucleico que es necesario anadir a la reaccion sera evidente para el experto en la tecnica y puede determinarse facilmente, por ejemplo probando varias concentraciones de acido polinucleico en la NAAT que se va a usar. Sin embargo, se espera que la cantidad de acido polinucleico que sera necesario anadir se encuentra entre 10 pg y 100 ag, 100 ng y 100 fg o incluso 100 pg y 100 fg.

El termino "control interno", como se usa en la presente, se refiere a cualquier acido nucleico que se sabe se amplifica bajo ciertas condiciones proporcionadas en el metodo de la invencion. El control interno no esta por lo tanto restringido a acidos polinucleicos que se obtuvieron de la misma fuente que el acido polinucleico de prueba, sino que mas bien abarca cualquier acido polinucleico teniendo en cuenta que tal acido polinucleico satisfaga los criterios establecidos para el segundo acido polinucleico. El control interno puede usarse como un control de la misma reaccion y tambien puede usarse como un estandar para cuantificar la muestra de prueba. Es importante destacar que los inventores han demostrado que la amplificacion de un control interno se inhibe por la presencia de inhibidores en una muestra, confirmando de este modo la idoneidad del control interno como un control para la amplificacion de la muestra de prueba (ver figura 7).

Preferiblemente, el metodo de la invencion se realiza en un recipiente sellado. Esto es de gran utilidad ya que reduce o incluso evita la posibilidad de que la muestra se contamine. Ademas, reduce o incluso evita la posibilidad de que se contamine el laboratorio. Esto es particularmente importante ya que si incluso una copia del acido nucleico plantilla escapase al laboratorio, podrla potencialmente contaminar otras muestras a ser probadas y dar resultados de falsos positivos. Por lo tanto, la capacidad de evitar la contaminacion es de particular importancia cuando un metodo de la invencion se usa en una aplicacion diagnostica. Los metodos para sellar el recipiente de reaccion seran evidentes para el experto en la tecnica e incluyen, pero no estan limitados a, pellculas de plastico, cera, aceite y coberturas de papel de aluminio.

Un metodo de acuerdo con la invencion puede usarse en aplicaciones de diagnostico. En particular el metodo permite la identificacion de organismos en una muestra de un paciente y otras muestras. El organismo puede ser cualquier microorganismos como virus, bacterias y hongos. El microorganismo puede ser patogeno pero

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tambien puede ser un microorganismo no patogeno.

"Muestra de paciente" se refiere a cualquier muestra tomada de un paciente y puede incluir sangre, heces, hisopos, muestras de tejido, orina o llquidos espinales. Otras muestras de pacientes adecuadas y metodos para extraerlas son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Un "paciente" o "sujeto" del que se toma la muestra puede ser un humano o un animal no humano. Cuando una muestra no es referida especlficamente como una muestra de paciente, el termino tambien comprende muestras tomadas de otras fuentes. Ejemplos incluyen hisopos de superficies, muestras de agua (por ejemplo aguas residuales, agua marina, agua del lago, agua potable) cualquier otra muestra ambiental (por ejemplo aire) muestras alimenticias, productos cosmeticos, productos farmaceuticos, productos de fermentacion, cultivos celulares y de microorganismos y otras muestras en la que es deseable la detection de un microorganismo.

En un aspecto adicional, se proporciona un kit como se define en las reivindicaciones para su uso en un metodo de acuerdo con la invention.

Preferiblemente dicho kit comprende todos los componentes necesarios para poner en practica el metodo de la invencion, excepto el acido polinucleico objetivo que se va a probar, excepto cuando el acido polinucleico objetivo forma parte de un control positivo suministrado o en pruebas cuantitativas en las que la cantidad conocida del objetivo se anade por referencia.

Un kit para su uso en un metodo de acuerdo con la invencion comprende un acido polinucleico para su uso como un control interno; cebadores para la amplification del acido polinucleico objetivo y el control interno con diferentes cineticas de reaction; y componentes para detectar una senal electroqulmica, turbidez, senal bioluminiscente o senal fluorescente de tal manera que los productos de la amplificacion de dicho primer acido polinucleico y dicho control interno se pueden detectar por la misma senal y las senales de la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno pueden resolverse en base a un conjunto de lecturas de senal frente a tiempo; y preferiblemente comprende una polimerasa de acido nucleico y los sustratos para la polimerasa de acido nucleico. Mas preferiblemente, el kit comprende ademas reactivos de tamponamiento, como una fuente de iones de magnesio. Alternativamente, un kit para su uso en un metodo de acuerdo con la invencion, como se define en las reivindicaciones, puede comprender solo algunos de estos componentes y/o componentes adicionales. La muestra y cualquier otro componente que se haya omitido del kit puede despues anadirse al kit durante el uso.

Cuando se usa la BART para la deteccion de acidos polinucleicos se pueden incluir en el kit una luciferasa termoestable, luciferina y un enzima que convierte PPi a ATP, como ATP sulfurilasa, y cualquier otro sustrato o cofactor requerido del enzima que convierte PPi a ATP, como adenosina 5' fosfosulfato. Por lo tanto en una realization un kit para el uso con BART comprende polimerasa de acido nucleico, b) el estandar interno, c) al menos dos cebadores adecuados para la amplificacion de la muestra de prueba y el estandar interno, d) una luciferasa termoestable, e) luciferina, f) ATP sulfurilasa y g) adenosina 5' fosfosulfato.

Preferiblemente, al menos uno de los componentes del kit se liofiliza o esta en otra forma que es adecuada para su almacenamiento en el kit. Mas preferiblemente, todos los componentes del kit se liofilizan o estan en una o mas formas adecuadas para su almacenamiento. Dichas otras formas incluyen componentes a los que se les han anadido factores estabilizantes y/o una mezcla maestra refrigerada o congelada que contiene los componentes del kit.

Una aplicacion adicional de un metodo de acuerdo con la invencion es para determinar si una secuencia de acidos nucleicos particular esta presente en un codigo genetico del organismo. Por ejemplo, podrla usarse para determinar si el acido nucleico del que el acido nucleico plantilla se origina ha sido modificado geneticamente, para la deteccion del ADN asociado con una raza de planta no modificada geneticamente particular o una planta modificada geneticamente, para la deteccion de ADN asociado con razas con pedigrl de animales o para aplicaciones de diagnostico medico o veterinario como pruebas geneticas o forenses.

Se describiran ahora varios aspectos y realizaciones de la presente invencion con mas detalle a modo de ejemplo. Se apreciara que se puede hacer modification del detalle sin salirse del alcance de las reivindicaciones.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Ejemplo de un modelo matematico para una curva de crecimiento/amplificacion conocida como Curva de Richards. a) version de la ecuacion de la curva de Richards adaptada para la amplificacion del acido nucleico; b) dos procesos de amplificacion con cineticas identicas; c) dos procesos de amplificacion que difieren en la cantidad de amplicon que pueden producir finalmente; d) dos procesos de amplificacion que difieren en el tiempo que les toma alcanzar la amplificacion maxima; e) dos procesos de amplificacion con diferentes tasas de amplificacion; f) dos procesos de amplificacion en done, en el momento de alcanzar la amplificacion maxima, la senal difiere entre como estan de cerca de las aslntotas respectivas; g) dos procesos de amplificacion que se describen ambos por la curva de Richards: N.B. uno de los procesos aparece en una primera inspection que es lineal (es decir una llnea recta). Como tal, en la practica, no es

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siempre facil (o necesario) estar seguro de si un proceso es verdaderamente exponencial o lineal a partir de un conjunto particular de mediciones; la cuestion con respecto a la presente invencion es si los procesos separados pueden desconvolucionar inequlvocamente de la senal compartida.

Figura 2. Modelo matematico. Esto demuestra el principio general de que es posible seguir dos procesos separado, en un tubo cerrado, usando una unica senal siempre que los dos procesos den salidas de senales que sean lo suficientemente diferentes por medio de su descripcion cinetica o amplitud.

Figura 3. Modelo matematico que demuestra que, incluso cuando los dos proceso tienen lugar simultaneamente, en oposicion a secuencialmente, como se muestra en la Figura 1, sigue siendo posible diferenciar la amplificacion de la muestra de prueba en comparacion con la amplificacion del control en virtud de las diferencias en la tasa intrlnseca de amplificacion.

Figura 4. Amplificacion exponencial de una serie de dilucion de una secuencia de acidos nucleicos objetivo usando la tecnologla de amplificacion LAMP en combinacion con la tecnologla indicadora BART. La tecnologla BART es un sistema indicador bioluminiscente por el que solo se puede emitir un tipo de senal de la muestra. El BART, a diferencia de otros sistemas indicadores, da tanto un aumento como una disminucion rapida durante la amplificacion: el tiempo hasta el pico de luz es inversamente proporcional a la cantidad de acido nucleico objetivo en la muestra. Ademas, la anchura del pico de luz es una funcion de la tasa inherente de amplificacion de la NAAT que se esta monitorizando.

Figura 5a. Amplificacion exponencial retardad de un acido nucleico objetivo;

Figura 5b. Tasa reducida de cambio de salida bioluminiscente observada en la amplificacion isotermica de acidos nucleicos a traves de un proceso dependiente de la Tli-RNasaH que muestra una tasa inherente mucho mas lenta de amplificacion en comparacion con, por ejemplo, LAMP. De hecho el proceso parece estar cercano a una tasa lineal de amplificacion. El mecanismo preciso de este proceso dependiente de la Tli- RNAsaH no esta claro pero parece estar provocado por la accion de la Tli-RNasaH en ADN que contiene pequenas cantidades de heteroduplex de ARN-ADN originados de cualquiera o ambas de la transcripcion o ADN Primasa.

Figura 6. Amplificacion exponencial y no exponencial registrada de un unico tubo de ensayo en presencia (1) o ausencia (2) del acido nucleico objetivo.

Figura 7. Inhibicion de amplificacion de ADN genomico en Lamp-BART con concentraciones diferentes de Agua de Peptona Tamponada (BPW), un inhibidor conocido para las NAAT, o CTP. 7a. Inhibicion de muestra que contiene el objetivo (1 - sin BPW, 2 BPW diluida 5x, 3 - diluida 2x, 4 - BPW no diluida); 7b. Inhibicion de control no plantilla (1 - sin BPW, 2 BPW diluida 5x, 3 - diluida 2x, 4 - BPW no diluida); 7c. Inhibicion de muestra que contiene el objetivo (1-3) y control no plantilla con diferentes concentraciones de CTP (1 y 4 - sin CTP, 2 y 5 2 mM de CTP, 3 y 6 - 3 mM de CTP).

Figura 8. Modelo matematico que demuestra dos procesos que tienen lugar simultaneamente en ausencia y presencia de inhibidores. a) Dos tipos de cineticas en ausencia de inhibidores; b) Monitorizacion en tiempo real de muestras positivas y negativas con control de inhibicion interno.

Figura 9. Amplificacion de una molecula de ADN objetivo, a traves de la NAAT conocida como RDC, en presencia de un control interno basado en amplificacion basada en RNasaH Tli seguido por BART. En el gris claro punteado se muestra la amplificacion exitosa de la molecula de ADN objetivo como se evidencia por el rapido aumento y despues la mas rapida todavla disminucion en la luz de la muestra. Esta amplificacion tiene lugar en presencia del control interno. En negro solido se muestra el resultado de la amplificacion cuando no hay presente ADN objetivo y la unica amplificacion detectada es del control interno. En este caso, el pico de luz del sistema indicador BART es visiblemente mas ancho que el de la molecula de ADN objetivo, en particular, carece de la disminucion rapida en la luz despues de las emisiones de luz maximas, asociadas con los procesos de amplificacion exponenciales. Como tal, respecto al trazo negro, es facil para un observador establecer que a) los reactivos de amplificacion no estan inhibidos, ya que ha tenido lugar la amplificacion, pero que b) la amplificacion es del control interno y no de la muestra de prueba ya que la forma de la salida del BART no es la asociada con la amplificacion exponencial rapida. Un algoritmo informatico serla capaz de distinguir entre las dos curvas sobre la base de que el resultado positivo tienen una tasa negativa mucho mas rapida tras el pico de luz en comparacion con la del control interno.

La Figura 10 muestra una variedad de metodos para lograr, en un unico recipiente, dos procesos de amplificacion de cineticas diferentes.

La Figura 11 refleja todas las caracterlsticas mostradas en la figura 10 excepto que en este caso el polinucleotido del control interno puede contener sitios de enlace de cebadores para cebadores no usados

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para amplificar el acido polinucleico objetivo.

La Figura 12 muestra dos alternativas para usar polinucleotidos del control interno que tienen sitios de enlace de cebadores o para que los cebadores usados amplifiquen el acido polinucleico objetivo o cualquier otro cebador ayude a amplificar el control interno.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Se amplifico LAMP-BART de ADN de Salmonella genomico purificado con el ChargeSwitch® direct gDNA Kit (Invitrogen) en Lamp-BART a 55° C en Lucy, con hardware de formacion de imagenes a medida (Lumora). La mezcla de la reaccion contenla: 0,8 pM de cebador de LampB

(AACCTTGTGGAGCATATTCGTGGTTTTCCGCCATTGGCGAATTTATG), 0,8 pM de cebador de LampF (TCTCTTGGCGCCCACAATGTTTTTAAGCGAACGTGTTTCCG), 0,4 pM de cebador de LoopB (CAATGGCGCGTTATATTTG), 0,4 pM de cebador de LoopF (GAGCGCTTCCATAATTAATTTC), 0,2 pM de cebador de DisplB (CATTACTGCTCGTAATTC), 0,2 pM de cebador de DisplF (ATATCTGAAGTTTTGCAGC) (MWG), 1,6 mM de dNTPs (total) (Invitrogen), 0,16 U/pl Bst (NEW ENGLAND BIOLABS), 0,1 mg/ml de luciferina (Europa Bioproducts), 0,5 mM de adenosina 5'-fosfosulfato (Biolog), 5,6 pg/pl de luciferasa de luciernaga (Ultra Glow, Promega), 0,125 U/ml ATP-sulfurilasa (Sigma) en 1x de tampon Thermopol (New England Biolabs) con algunos estabilizantes y aditivos. El volumen total de cada reaccion fue de 20 pl. Las senales del BART observadas respondieron a la amplificacion de ADN exponencial por un aumento de la luz seguido por una rapida disminucion de la luz para la muestras positivas que contenlan diferentes numero de copias de objetivo de partida y por un decaimiento gradual constante para la muestra negativa que no contenla ningun ADN objetivo (Figura 4).

Ejemplo 2

Se observo la amplificacion exponencial retardada de un acido nucleico objetivo bajo condiciones identicas a las del Ejemplo 1 pero omitiendo los cebadores LoopB y LoopF. El tiempo de retardo anterior a la senal flash se detecto incluso para alto numero de copias del acido nucleico objetivo y se volvio significativamente mas largo; el aumento exponencial fue mucho mas lento (Figura 5a). El ancho medio del flash observado en este ejemplo fue tres veces mayor que en la amplificacion exponencial descrita en el Ejemplo 1.

Se demostro la tasa reducida de amplificacion por una amplificacion isotermica tipo lineal no especlfica de los acidos nucleicos a traves de un proceso conducido por Tli-RNasaH a 55° C, en Lucy, hardware de formacion de imagen a medida (Lumora). La mezcla de la reaccion contenla: 0,32 U/pl Tli-RNasaH (Takara), 1,6 mM de dNTPs (total) (Invitrogen), 0,16 U/pl de Bst (New England Biolabs), 0,5 mM de adenosina 5'-fosfosulfato (Biolog), 5,6 pg/pl de luciferasa de luciernaga (Ultra Glow, Promega), 0,125 U/ml de ATP-sulfurilasa (Sigma) en 1x de tampon Thermopol (New England Biolabs) con algunos estabilizantes y aditivos. El volumen total de cada reaccion fue de 20 pl. Las senales del BART observadas respondieron a la amplificacion del acido nucleico en aumento gradual, casi lineal, significativamente ralentizado, seguido por una disminucion en la salida de luz (Figura 5b). La anchura media de estas senales fue incluso mayor que en el caso anterior.

Ejemplo 3

Se combino la amplificacion exponencial de ADN de Salmonella genomico por LAMP en un unico ensayo de tubo con la amplificacion dependiente de Tli-RNasaH casi lineal anteriormente mencionada de acidos nucleicos y se monitorizo por BART a 55° C en Lucy, hardware de formacion de imagenes a medida (Lumora). La mezcla de la reaccion contenla: 0,8 pM de cebador de LampB, 0,8 pM de cebador de LampF, 0,4 pM de cebador de LoopB, 0,4 pM de cebador de LoopF, 0,2 pM de cebador de DispIB, 0,2 pM de cebador de DispIF (MWG), 0,32 U/pl) de Tli- RNAsaH (Takara), 1,6 mM de dNTPs (total) (Invitrogen), 0,16 U/pl de Bst (New England Biolabs), 0,1 mg/ml de luciferina (Europa Bioproducts), 0,5 mM de adenosina 5'-fosfosulfato (Biolog), 5,6 pg/pl de luciferasa de luciernaga (Ultra Glow, Promega), 0,125 U/ml ATP-sulfurilasa (Sigma) en 1x de tampon Thermopol (New England Biolabs) con algunos estabilizantes y aditivos, ADN objetivo para la amplificacion conducida por Tli-RNasaH. El volumen total de cada reaccion fue de 20 pl. La muestra que contenla la secuencia objetivo respondio con un flash fuerte reflejando la produccion exponencial rapida de ADN. La muestra sin la secuencia objetivo pro con el ADN objetivo para la amplificacion conducida por Tli-RNasaH respondio (es decir el control interno) con un aumento lento de la senal de luz (Figura 6).

Ejemplo 4

Se demostro la inhibicion de la amplificacion de ADN genomico de Salmonella (2 ng por ensayo) con agua de peptona tamponada (BPW) o CTP en LAMP-BART bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 3. Se anadieron 3,5 pl de BPW o CTP pre-diluidos a diferentes concentraciones en 15 pl de la mezcla de ensayo conteniendo o ADN objetivo, o muestras positivas o muestras negativas de ADN no objetivo. Los resultados observados en las muestras

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positivas y negativas con BPW se muestran en la Fig. 7a y la Fig. 7b y con CTP en la Fig. 7c, respectivamente. La adicion de BPW no diluido y pre-diluido 2x inhibio completamente la amplificacion no exponencial en muestras negativas y ralentizo significativamente la amplificacion exponencial en las muestras positivas. El BPW diluido 5x tuvo solo un efecto de ralentizacion leve en ambas amplificaciones. De manera similar, la adicion de 3mM de CTP inhibio completamente la amplificacion no exponencial en las muestras negativas y ralentizo significativamente la amplificacion exponencial en las muestras positivas, mientras que 2mM de CTP solo ralentizo ambas amplificaciones. Esto muestra que la amplificacion conducida por Tli-RNasaH casi lineal actuo como un control interno efectivo para la deteccion de inhibidores.

Ejemplo 5

Los resultados del modelado matematico de las cineticas exponenciales y no exponenciales lentas requeridas para el control de inhibicion interno en NAAT en un unico tubo de ensayo se muestran en la Figura 8a. Los resultados del modelado matematico del efecto del inhibidor en el unico parametro en la deteccion en tiempo real de la NAAT con un control de inhibicion interno se muestran en la Figura 8b.

Ejemplo 6

Se hizo una mezcla de reaccion de los siguientes constituyentes a 4° C: 20 mM de Tris-HCl pH 8,8, 10 mM de (NH4)2SO4, 10 mM de KCl, 4,8 mM de MgSO4, 0,1% de Triton X-100, 500 pM de cada uno de dNTP, 10 U de RNasaOut, 25 pmol Lm-InlA-RDCus3r2d (tgactgaaccagctaagcctgUAAaa), 25 pmol de Lm-InlA-RDCus3r2d (cgttgctgtgtagctgttaatacUAAat), 6,25 pmol de InlA Df-v2 (ataatctactgtttgagatg), 6,25pmol de InlA Db-v2 (taatgctaagtttcatgtg), 0,1 mg/ml de LH2, 0,5 mM de APS, 140 pg de rLUC, 3,125 U de ATP sulfurilasa, 4 $ U de fragmento grande de Bst polimerasa, 1 U de Tli RNAsa H II. Se anadieron 20 pl de la mezcla anterior a dos tubos separados que contenlan 5 pl de o 10 o 0 copias de un plasmido que alberga el gen InIA. Las reacciones se colocaron de 4° C a un sistema de formacion de imagenes BART y se ejecuto durante 260 minutos a 60° C con 240 adquisiciones de imagenes.

En gris claro punteado se muestra la amplificacion exitosa de la molecula de ADN objetivo como se evidencia por el rapido aumento y despues la todavla mas rapida disminucion en la luz de la muestra. Esta amplificacion tiene lugar en presencia del control interno. En negro solido se muestra el resultado de la amplificacion cuando no hay presente ADN objetivo y la unica amplificacion detectada es del control interno.

Claims (17)

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo para determinar la presencia y/o cantidad de un primer acido polinucleico en una muestra que comprende someter a la muestra a amplificacion de acidos nucleicos en la que el producto se puede detectar por la presencia de una senal generada por la formacion del acido polinucleico a partir del primer polinucleotido caracterizado porque la reaccion de amplificacion de acidos nucleicos se realiza, en el mismo recipiente de reaccion, con una cantidad predeterminada de un segundo acido polinucleico que se somete a amplificacion de acidos nucleicos, el producto de la cual se puede detectar por la presencia de la misma senal generada por la formacion de acidos polinucleicos a partir del segundo polinucleotido como la generada por la formacion de acidos polinucleicos a partir del primer polinucleotido en el que las senales de la amplificacion del primer acido polinucleico y el segundo acido polinucleico se resuelven en base a un conjunto de lecturas de senal frente a tiempo y en el que el producto del segundo acido polinucleico se produce con diferentes cineticas de reaccion del producto del primer acido polinucleico de tal manera que el segundo acido polinucleico actua como un control interno para el metodo.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1 en el que

   (a) el primer acido polinucleico se amplifica en amplificacion de acidos nucleicos exponencial y el control interno se amplifica en amplificacion nucleica no exponencial;

   (b) el primer acido polinucleico se amplifica usando amplificacion de acidos nucleicos no exponencial y el control interno se amplifica usando amplificacion nucleica exponencial; o

   (c) el primer acido polinucleico se amplifica usando amplificacion de acidos nucleicos exponencial y el control interno tambien se amplifica usando amplificacion de acidos nucleicos exponencial, y en el que las dos amplificaciones de acidos nucleicos tienen diferentes cineticas de reaccion.
3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1, 2a o 2b en el que la amplificacion nucleica exponencial se selecciona del grupo consistente de reaccion de cadena de polimerasa, Amplificacion por Desplazamiento de la Cadena (SDA), Amplificacion Isotermica mediada por Bucle (LAMP), Amplificacion Quimerica Isotermica de Acidos Nucleicos (ICAN), Proceso de Amplificacion SMart (SMAP), Reaccion de Desplazamiento Quimerico (RDC), Amplificacion en circulo rodante (exponencial) (RCA-exponencial), Amplificacion Basada en Secuencia de Acidos Nucleicos (NASBA), Amplificacion mediada mediante Transcripcion (TMA), Amplificacion Dependiente de Helicasa (HAD) y Amplificacion de Polimerasa Recombinasa (RPA) y/o en el que la amplificacion nucleica lineal se selecciona del grupo consistente de amplificacion en circulo rodante, reaccion de cadena de polimerasa asimetrica (PCR asimetrica), amplificacion en circulo rodante, PCR asimetrica y LAMP asimetrica.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 2c, en el que

   (a) la amplificacion de acidos nucleicos del primer acido polinucleico y el control interno difieren en uno o mas de los siguientes parametros:

   (i) amplitud

   (ii) tiempo de retardo antes de la amplificacion maxima o

   (iii) tasa intrinseca de amplificacion; o

   (b) la amplificacion de acidos nucleicos implica el uso de cebadores que enlazan con los dos sitios de enlace de cebadores en el acido polinucleico y en el que los sitios de enlace de cebadores estan mas separados en el control interno en comparacion con el primer acido polinucleico;

   (c) la amplificacion de acidos nucleicos implica el uso de cebadores que enlazan con los dos sitios de enlace de cebadores en el acido polinucleico y en el que los sitios de enlace de cebadores estan separados por una region que es mas lenta de copiar para una polimerasa en comparacion con el polinucleotido objetivo; o

   (d) la amplificacion de acidos nucleicos implica el uso de cebadores que enlazan con los dos sitios de enlace de cebadores en el acido polinucleico y en el que uno o ambos sitios de enlace en el control interno contienen desajustes que provocan que la amplificacion tenga lugar menos eficientemente en el control interno en comparacion con la amplificacion del primer acido polinucleico.
5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en el que la amplificacion de acido nucleicos implica el uso de uno o mas cebadores que enlazan con los sitios de enlaces de cebadores en el acido polinucleico y al menos uno de los sitios de enlace de cebadores usados para amplificar exponencialmente la primera secuencia de polinucleotidos esta o parcialmente ausente o es no optimo en el control interno para lograr diferentes cineticas de reaccion.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 4, en el que uno de los sitios de enlace de cebadores presentes en el primer acido polinucleico esta ausente en el control interno y en el que la amplificacion de acidos nucleicos requiere dos sitios de enlace de cebadores.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 5, en el que uno o ambos sitios de enlace de cebadores estan presentes en una

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   molecula del acido polinucleico circular pero en una orientacion que evita la amplification exponencial y en el que la reaction de amplificacion requiere dos sitios de enlace de cebadores.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el primer acido polinucleico y el control interno se amplifican por diferentes tecnicas de amplificacion de acidos nucleicos.
9. 9. El metodo de las reivindicaciones 1-7, en el que el primer acido polinucleico y el control interno tienen menos de un 100% de homologla.
10. 10. El metodo de las reivindicaciones 1-9, en el que

    (a) la reaccion se realiza en un recipiente sellado; y/o

    (b) la senal usada para la detection de los productos de la amplificacion se selecciona del grupo consistente de: una senal fluorescente, una senal electroqulmica, una senal bioluminiscente y turbidez.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10b, en el que la senal bioluminiscente se detecta por ensayo bioluminiscente en tiempo real.
12. 12. El metodo de las reivindicaciones 1-11, en el que

    (a) la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno se realiza con la misma tecnica de amplificacion pero en el que la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno pueden controlarse por condiciones extrlnsecas; y/o

    (b) la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno se realiza a temperaturas diferentes; y/o

    (c) los cebadores usados para la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno tienen diferentes valores de Tm.
13. 13. El metodo de las reivindicaciones 1-12 para

    (a) su uso en aplicaciones diagnosticas;

    (b) detectar un organismo en una muestra; o

    (c) detectar un microorganismo en una muestra.
14. 14. Un kit para realizar el metodo de las reivindicaciones 1-13 que comprende un acido polinucleico para su uso como un control interno y cebadores que permiten la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno con diferentes cineticas de reaccion, en el que el kit comprende componentes para detectar una senal electroqulmica, turbidez, senal bioluminiscente o senal fluorescente de tal manera que los productos de la amplificacion de dicho primer acido polinucleico y dicho control interno pueden detectarse por la misma senal y las senales de la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno pueden resolverse en base a un conjunto de lecturas de senal frente a tiempo.
15. 15. El kit de la reivindicacion 14, que comprende:

    (a) un acido polinucleico de control que contiene al menos dos sitios de enlace de cebadores que estan separados por una region que es mas lenta de copiar para una polimerasa en comparacion con el polinucleotido objetivo y dos cebadores que pueden enlazar con dichos sitios de enlace de cebadores en el acido polinucleico de control;

    (b) al menos dos cebadores que enlazan con al menos dos sitios de enlace de cebadores en el acido polinucleico objetivo y en el acido polinucleico de control que contienen desajustes que provocan que la amplificacion tenga lugar menos eficientemente en el control en comparacion con la amplificacion del primer acido polinucleico;

    (c) un acido polinucleico de control y cebadores que dan lugar en el acido polinucleico de control a ser amplificados por una tecnica de amplificacion de acidos nucleicos diferente en comparacion con el acido polinucleico objetivo;

    (d) un acido polinucleico de control que es un acido polinucleico circular y que contiene dos sitios de enlace de cebadores, y cebadores que enlazan con el acido polinucleico de control en una orientacion que evita la amplificacion exponencial del acido polinucleico de control;

    (e) uno o mas cebadores que enlazan con los sitios de enlace de cebadores en el acido polinucleico, en donde al menos uno de los sitios de enlace de cebadores usados para amplificar exponencialmente la primera secuencia de polinucleotidos esta o parcialmente ausente o no es optima en el control interno para lograr diferentes cineticas de reaccion;

    (f) uno o mas cebadores que permiten la amplificacion del primer acido polinucleico y el control interno a diferentes temperaturas;

    (g) cebadores para la amplificacion del primer acido polinucleico y para la amplificacion del acido nucleico de control, en donde la temperatura de fusion de los cebadores usados para la amplificacion del primer acido

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    65

    polinucleico y el acido nucleico de control tienen una temperatura de fusion diferente; o

    (h) un acido polinucleico de control que comprende solo uno de los sitios de enlace de cebadores presentes

    en el primer acido polinucleico.
16. 16. El kit de la reivindicacion 14 o la reivindicacion 15, en el que el kit comprende una luciferasa termoestable, luciferina y un enzima que convierte PPi a ATP y cualquier otro sustrato o cofactor requerido del enzima que convierta PPi a ATP.
17. 17. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que

    (a) la amplificacion de acidos nucleicos es exponencial y requiere dos sitios de enlace de cebadores y uno de los sitios de enlace de cebadores presentes en la primera secuencia de polinucleotidos esta ausente en el control interno, de tal manera que la amplificacion de acidos nucleicos del primer acido polinucleico y el control interno difieren en uno o mas de los siguientes parametros:

    i. amplitud;

    ii. tiempo de retardo antes de la amplificacion maxima; o iii tasa intrlnseca de amplificacion

    (b) en el que los cebadores enlazan con dos sitios de enlace de cebadores en el acido polinucleico y en el que los sitios de enlace de cebadores estan mas separados en el control interno en comparacion con el primer acido polinucleico, de tal manera que las dos amplificaciones de acidos nucleicos son exponenciales y tienen diferentes cineticas de reaccion.