CN115836133A - 用于检测疑似冠状病毒样品中的核酸序列的方法和便携式装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过利用逆转录技术和/或等温扩增，使用靶区域的特异性寡核苷酸引物，检测和鉴定不同类型的样品中的核酸的特定序列的方法和便携式装置(1)，由此使用鉴别性扩增试剂以间接和非特异性的形式或直接和特异性的形式进行所述核酸的扩增，所述鉴别性扩增试剂的信号(比色的或荧光)由进行反应的便携式装置(1)记录。该装置通过移动应用程序(9)控制，移动应用程序(9)还记录由装置(1)获取的数据，分析该数据并将其存储在云端中的远程服务器(10)，云端中的远程服务器(10)又分析所有数据的全局集合，以便允许例如流行病的演变的全局分析。本发明可用于在不同的药物、兽医、食品、环境、生物技术或生物安全领域中检测和鉴定用于不同类型诊断的相关核酸序列，尤其可用于SARS‑CoV‑2病毒的快速、低成本和即时诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过优化的逆转录酶技术和/或等温扩增，使用待测靶区域的特异性寡核苷酸引物，检测和鉴定不同类型样品中的特定核酸序列的方法和便携式装置，其中使用鉴别性扩增试剂以间接和非特异性方式或直接和特异性方式进行所述核酸序列的扩增，所述鉴别性扩增试剂的信号(比色或荧光)由进行反应的便携式装置记录，其对不同临床、制药、兽医、食品、环境、生物技术或生物安全领域的不同类型诊断具有有用的应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是临床分子生物学实验室的一种常见且不可或缺的技术，其允许一个或多个DNA片段的拷贝以指数方式扩增，产生数百万个已确定的DNA序列拷贝。该技术依赖于热循环，涉及将试剂暴露于重复的加热和冷却循环，这也要求使用昂贵和复杂的设备以受控和可重复的方式达到所述循环。自发明以来，这项技术已经有了很大的发展，允许越来越广泛的应用。这些进步之一是开发了实时PCR，其可以根据PCR产物指数生产的监测实时分析PCR生长曲线。
对于涉及的定量监测，有两种主要方法：(i)间接法，即使用双链DNA嵌入染料，所述嵌入染料的荧光随DNA双链的复制而以非特异性方式增加；和(ii)直接法，其使用以下物质的结合：基于聚合酶5'核酸酶活性的TaqMan探针，其目前是许多同基因定性和定量检测的基础；或发夹探针，其利用由探针与扩增靶标的特异性杂交引起的荧光团与淬灭剂之间的分离。
然而，通过正常或实时PCR进行的诊断存在局限性，因此无法应用于即时(Point-of-Care，PoC)诊断。即，它们需要专门的和昂贵的人员和设备，需要几个小时才能得出结果，并且容易受到经常存在于待分析样品中的污染物(诸如，例如，血红蛋白、盐、螯合剂、醇等)的抑制，这是在扩增中失败的主要原因，即使存在足够拷贝的靶核酸来扩增，导致假阴性。特别是，实时PCR技术增加了这样的局限性，即多重反应限于设备的检测能力，并且进一步地，需要高的技术和知识能力来开发在商业试剂盒中不可获得的新测试。
鉴于这些局限性，一些小组开发了核酸扩增的替代技术，以克服PCR和实时PCR的限制步骤。
从这个意义上说，如本发明所述，逆转录过程和等温扩增的发展揭示了其本身是特别令人感兴趣的，因为其可以促进在目标点(例如医疗诊所或资金较少的地方)的简单诊断系统的集成(PoC装置)。通常，等温扩增技术基于对抑制剂(其通常抑制PCR)具有较高耐受性的聚合酶，使反应更稳定。另一方面，当使用等温温度时，进行反应的设备变得不那么复杂，成本也更低。例如，本发明的便携式装置是实时PCR装置成本的一小部分(<1/200)。
等温扩增技术
目前有一系列等温扩增技术。
LAMP是一种DNA扩增技术。RT-LAMP结合了LAMP和逆转录步骤以允许RNA检测。该技术是等温的，在恒定温度下执行并且不需要热循环仪。
在LAMP中，使用多组寡核苷酸引物和具有高链置换以及复制能力的聚合酶在60-65℃的恒温下扩增靶序列。扩增的产物可以通过光度测定法检测，测量由溶液中的沉淀引起的浊度(其作为扩增的次级产物产生)，或通过pH敏感染料的颜色变化(其由于扩增过程中的聚合酶活性而变化)。这允许用简单的装置用肉眼检测扩增。使用这种嵌入荧光团如SYTOTM9，可以实时测量浊度或通过荧光检测反应。其它荧光团如SYBRTM绿色可用于产生可见的颜色变化，而不需要昂贵的检测设备。由于荧光团分子嵌入DNA，与DNA的扩增有相关性，因此LAMP可以是定量的。
LAMP是一种相对新的DNA扩增技术，由于其简单性和低成本，可以带来一些好处。LAMP可用于现场研究和PoC检测。LAMP技术在血液样本中的正常PCR反应抑制剂方面显示了更为可靠的结果，这允许在无法最佳提取DNA和RNA的情况下应用该技术。
就局限性而言，LAMP不如PCR通用，因为尽管其主要用作检测工具，但其不允许PCR的所有其它分子生物学技术。由于LAMP使用4-6个靶区作为寡核苷酸引物，因此设计用于该技术的寡核苷酸引物也是极其困难的。这种寡核苷酸引物混合物的结果之一是非特异性扩增的增加，以及随之而来的假阳性，例如，通过使用不具有核酸外切酶活性的DNA链置换聚合酶，不允许使用Taqman探针，间接法也不允许区分所述假阳性。然而，在本发明中，使用标记有荧光的特异性寡核苷酸探针，使得其具有自淬灭性，当与LAMP反应的扩增产物的环区杂交时，这种自淬灭性被取消，这允许我们以特异性方式监测样品扩增，并因此避免在该技术中常见的假阳性。
HDA使用解旋酶产生单链模板，用于寡核苷酸引物的杂交和随后通过聚合酶延伸寡核苷酸引物。除了不需要热循环仪之外，HDA与其他等温DNA扩增方法相比具有几个优点，反应方案简单，是等温反应，其可以在整个过程中在单一和恒定的温度下进行。这些特性为开发用于当地(in loco)和PoC的简单便携式DNA诊断装置提供了巨大的潜力。
寡核苷酸引物和缓冲液的预先优化对于方案的执行是必需的。通常，这种优化是通过PCR进行的，因此需要使用单独的系统来进行真正的扩增。
尽管HDA在不需要热循环仪方面有很大优势，因此允许在实验室外进行研究，但检测潜在危险微生物所需的大部分工作都是在研究实验室/医院的环境中进行的。目前，HDA无法对大量样品进行大规模诊断，而在可包含来自多个微孔的样品板的热循环仪中进行的PCR反应允许一次从最多96个样品扩增和检测预期的靶DNA。与用于PCR试剂的试剂相比，HDA试剂的采购成本也相对昂贵(Vincent M et al(2004)EMBO,5(8):795–800.VeltkampHW et al(2020)Micromachines(Basel)11(3):238；专利US7282328B2)。
RCA是一种单向核酸复制过程，其可以快速合成DNA或RNA的环状分子的多个拷贝，例如质粒、噬菌体基因组和病毒的环状RNA基因组。
RCA被开发为滚环复制的简化版本，一种等温DNA扩增技术。RCA机制广泛用于分子生物学和生物医学纳米技术，特别是生物传感领域(作为一种信号放大的方法)。RCA已成功用于检测临床样品中病毒和细菌DNA的存在，这对于传染病的快速诊断极为有益。其还用作芯片上放大的方法，用于核酸微阵列(DNA和RNA)。RCA技术也可应用于DNA纳米结构和DNA水凝胶的构建。RCA产物也可用作周期性组装纳米物质或蛋白质、合成金属纳米线和形成纳米岛的模板。
RCA是一种高度通用的DNA扩增工具，广泛用于许多领域，其中灵敏度和/或特异性的限制、费力的样品的制备和/或信号放大程序先前已经阻止了其它工具的使用。
迄今为止，RCA的绝大多数研究集中在生物技术和生物学应用上。然而，由于许多DNA和RNA纳米结构需要相对较大或较长的重复结构，该方法在纳米技术中的应用也越来越多，这似乎是合理的。
MDA和SDA是不借助PCR的DNA扩增技术。这些方法可以快速扩增足以用于基因组分析的最小DNA样品量。该反应通过使随机六聚体寡核苷酸引物与模板退火开始：通过高保真酶在恒温下进行DNA合成。
与常规PCR扩增技术相比，MDA产生的产物尺寸较大，错误频率较低。该方法在“全基因组扩增”(whole genome amplification，WGA)中得到了广泛的应用，是单细胞基因组测序遗传研究的一种有前景的方法。SDA是一种用于扩增核酸的等温体外技术，其基于Hind-I从识别位置切割半硫代磷酸形式的非修饰链的能力，以及外切酶缺陷型klenow(exo-klenow)延长3'末端并使DNA链下游移位(dislocate)的能力。指数扩增由有义和反义反应的偶联产生，其中有义反应的置换链充当反义反应的靶标，反之亦然。
这些技术具有一些局限性，诸如等位基因丢失(Allelic dropout，ADO)、优先扩增和寡核苷酸引物-寡核苷酸-引物相互作用。这些局限性降低了基因分型的精确性。
RPA是PCR反应的等温替代方案。通过向RPA反应中添加逆转录酶，我们可以检测RNA和DNA，而不需要单独的步骤来产生cDNA。由于是等温的，RPA使用的设备比PCR简单得多。通过使最佳温度在37至42℃之间，并具有在室温下扩增的能力，尽管扩增速度较慢，这意味着理论上RPA反应可以快速进行，只需拿着试管。这使得RPA成为开发低成本、快速和PoC模式分子测试的优秀候选方案。
发表的科学文献通常缺乏等温扩增技术(诸如RPA、HDA和LAMP)的性能的详细比较，一种相对于另一种，通常将一种单独的等温技术与标准PCR试验进行比较。这使得难以独立于制造商、发明人或拥护者的权利来评估这些技术的优点。此外，难以将任何扩增技术的性能特征与寡核苷酸引物的设计分离：对于相同靶标，一组针对靶标RPA的“好的”寡核苷酸引物能够比“坏的”寡核苷酸LAMP引物提供更快的扩增或更灵敏的检测。正如PCR和任何其它扩增技术所发生的，显然存在发表偏倚，性能较差的寡核苷酸引物很少被认为有报道价值。
TMA和NASBA均为模拟逆转录病毒RNA复制的等温扩增反应。两者均特异于靶RNA序列，并且由于它们在临床、环境和食品样本中检测病原体方面的广泛应用而受到欢迎。两者均有商业试剂盒。作为用于RNA扩增的RT-PCR的替代方案，NASBA和TMA具有不需要热循环仪方案的优点。这两种技术均使用RNA聚合酶从寡核苷酸引物区域的启动子产生RNA，并使用逆转录酶从RNA模板产生DNA。对于TMA，逆转录酶本身在其合成其互补DNA时降解初始RNA模板。对于NASBA，这项RNA扩增技术得到了改进，引入了第三种酶活性，RNaseH，以在不经热变性步骤的情况下从cDNA中破坏RNA。在反应过程中，寡核苷酸正向引物与样品中存在的任何靶RNA结合。逆转录酶和RNase H，与反向寡核苷酸引物一起，产生具有靶序列和T7启动子的dsDNA。依赖于DNA T7的RNA聚合酶使用该dsDNA产生许多与原始靶RNA互补的RNA链。在这种NASBA的初始阶段之后，每个最近合成的RNA均可以在循环阶段中复制，导致与靶互补的RNA的指数扩增。因此，消除了热循环步骤，产生称为自我持续序列复制的等温扩增方法。NASBA和TMA的最终产物可以使用凝胶电泳和比色测试来检测。
SARS-CoV-2诊断
2019年12月，首次检测到名为“SARS-CoV-2”的新型冠状病毒，自2020年3月11日起，世界卫生组织将其列为大流行，引起一种称为“COVID-19”的呼吸道疾病。冠状病毒是人类和许多不同种类动物(包括骆驼、牛、猫和蝙蝠)中常见的一大类病毒。动物冠状病毒很少能感染人类并随后在人群中传播，诸如MERS-CoV、SARS-CoV和现在这种新型病毒SARS-CoV-2。
虽然我们仍在了解其传播方式及其引起的疾病的严重性，但这种新的COVID-19疾病已迅速传播到全世界100多个地方。2020年4月30日，全球确诊病例317万例，其中痊愈病例95.8万例，死亡22.5万例。
目前，由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19疾病的诊断主要通过分子途径进行，并且用于这种类型的诊断的选择的诊断方法是实时PCR，有一系列商业试剂盒(例如，cobasSARS-CoV-2(Roche)、TaqPath COVID-19Combo Kit(Thermo Fisher)、1copy COVID-19QPCRKit(1DROP Inc)、Abbott Real-time SARS-COV-2(Abbott))。
只有在实验室环境中和专业人员的情况下才能实施该方法，进一步涉及在卫生专业人员方面对样品的选择进行一系列的护理，考虑到该病毒的高水平感染，这使得整个诊断过程极其昂贵和耗时-平均而言，分析的结果需要72小时才能显示出来，这在很大程度上也是由于缺少试剂和昂贵的实时PCR设备。
为了满足改进现有检测和鉴定SARS-Cov-2的诊断方法和系统的明确需要，本申请人的目的是开发一种用于集成便携式装置的新技术系统和方法，以改善临床诊断，允许对任何生物样品中存在的冠状病毒科病毒，特别是严重急性呼吸综合征2(SARS-Cov-2)的冠状病毒种的特异性和灵敏性检测。
在本发明中，所开发的便携式装置允许快速检测(～30分钟)多种类型的样品中的病毒(SARS-Cov-2)的存在，由此其可以由任何人(本领域的非专业人员)使用，并且其为便携式的，因此几乎可以在任何地方进行该测试。所有这些均消除了潜在感染者和之前参与样品收集和分析过程的卫生专业人员之间的传染风险。尽管如此，健康实体对阳性结果的跟踪也能够实时执行，因为诊断是通过移动装置进行的，该移动装置与便携式装置通信，并将所有信息发送到云端中的远程服务器。
这也使预防措施能够在没有先例的情况下以更迅速的方式执行，这将有助于大大降低该疾病传播的风险，从而降低其达到我们目前所达到的大流行水平。就试剂和设备而言，降低的成本还允许在在目前无法实时进行PCR实验室检测的地区可以更广泛地传播和提供检测。
最近，还存在所谓的快速检测盒，其允许在5至15分钟内以视觉方式(无需借助设备)对疾病进行免疫学诊断。然而，这些测试只允许评估免疫反应，不能直接检测病毒的存在，仅对晚期病例(症状出现后4至7天)有效。在分子检测的情况下，例如在本发明中，可以在第一症状出现前2-5天进行诊断，从而也可以直接检测疾病的病毒载量，这是确定感染他人可能性的最相关因素。因此，免疫检测将永远不会取代这种疾病的分子检测。此外，所述快速检测已经显示出相当低水平的可靠性，能够在高达80％的情况下失败。
在PoC水平上，有两种系统用于诊断COVID-19，即Spartan Cube COVID-19System(Spartan Bioscience)和Xpert Xpress SARS-CoV-2(Cepheid)。然而，由于这些装置并不完全是PoC，因为它们没有以远程方式执行检测的自主权。
在本发明中，便携式装置包含电池，并且其其真正的小尺寸(换句话说，它适合于外套口袋)使其真正便携用于PoC。
发明内容
本发明涉及一种用于检测和鉴定不同类型的样品中的特定核酸序列的集成系统和方法以及用于检测和鉴定不同类型的样品中的特定核酸序列的方法，其中存在由移动应用程序(9)控制的便携式装置(1)，移动应用程序(9)记录由便携式装置(1)获取的数据，分析该数据并将其存储在云端中的远程服务器(10)中。移动应用程序(9)还记录由便携式装置(1)获取的数据，分析该数据并将其存储在云端中的远程服务器(10)中，其中云端中的远程服务器(10)又分析所有数据的全局集合，以便允许例如流行病的演变的全局分析。
附图说明
图1.由移动应用程序(9)控制并直接或间接连接到云端中的远程服务器(10)的便携式装置(1)的组件的方案。
图2.使用标记有荧光团FAM的特异性寡核苷酸探针在便携式装置(1)上进行和监测基因N的阴性样品的检测实例。荧光强度在整个检测过程中保持不变，证明由于缺乏靶病毒RNA，未发生逆转录和等温扩增。
图3.使用标记有荧光团FAM的特异性寡核苷酸探针在便携式装置(1)上对基因N进行和监测的阳性样品的检测实例。荧光强度从～1100秒开始呈指数级增加，这是逆转录和等温扩增的结果，与靶病毒RNA的存在有争议。
发明的一般描述
本发明涉及一种用于检测和鉴定疑似冠状病毒样品中的特定核酸序列的集成系统，其中存在由移动应用程序(9)控制的便携式装置(1)，移动应用程序(9)记录由便携式装置(1)获取的数据，分析该数据并将其存储在云端中的远程服务器(10)中。通过优化的逆转录酶和/或等温扩增技术，使用待测靶区域的特异性寡核苷酸引物，进行疑似冠状病毒样品中核酸的特异性序列的检测和鉴定，由此使用鉴别性扩增试剂，以间接和非特异性的方式，或直接和特异性的方式进行所述核酸的扩增，所述鉴别性扩增试剂的信号(比色的或荧光)由进行反应的便携式装置(1)记录，便携式装置(1)由移动应用程序(9)控制并直接或间接连接到云端中的远程服务器(10)，对于不同临床、药物、兽医、食品、环境、生物技术和生物安全领域的不同类型诊断具有有用的应用。
本发明还涉及一种用于检测和鉴定疑似冠状病毒样品中所述特定核酸序列的方法。
该用于检测和鉴定核酸序列的方法，其基于一个或多个基因组区域的逆转录和/或等温扩增，实时鉴别扩增片段并使用便携式装置(1)，无论是来自纯化的核酸样品还是直接来自可能被所述核酸污染的样品，其特征在于以下步骤：
a)收集和处理待分析样品；
b)将收集的样品加入容器(2)，容器(2)含有用于逆转录和/或等温扩增以及用于实时鉴别扩增的试剂；
c)将容器(2)加入便携式装置(1)中，便携式装置(1)将恒温加热所述容器以进行逆转录和/或等温扩增，并将记录鉴别所述扩增的信号；
d)将便携式装置(1)记录的信号传输到移动应用程序(9)和/或直接传输到云端(10)中的远程服务器；
e)分析装置(1)记录的信号，以确定最终结果：检测或不检测样品中的靶核酸序列。
f)将最终结果记录在云端中的远程服务器(10)中，以实现对流行病和/或大流行病的地理控制的远程访问和一般分析。
本发明可用于在不同的药物、兽医、食品、环境、生物技术或生物安全领域中检测和鉴定用于不同类型诊断的相关核酸序列，尤其可用于SARS-CoV-2病毒的快速、低成本、即时(point of interest)诊断。
用所述方法检测的核酸序列为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列。
核酸序列来源于人、动物和/或病原体(包括细菌、真菌、病毒或其它微生物)。
核酸序列属于病毒，根据Baltimore分类，第I类-双链DNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)，第II类-单链DNA病毒(例如细小病毒)，第III类-双链RNA病毒(例如呼肠孤病毒)，第IV类-正义单链RNA病毒(例如冠状病毒、小核糖核酸病毒、披盖病毒(Togavirus))，第IV类-阴性或反义单链RNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)，第VI类-在蛋白质形成中具有DNA中间产物的单链正义RNA病毒(逆转录病毒)，或第VII类-在复制中具有RNA中间产物的双链DNA病毒(嗜肝DNA病毒)。
在一个实施方案中，核酸序列属于冠状病毒科的病毒，特别是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-Cov-2)。
逆转录可以使用具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶进行，诸如HIV-1、M-MLV、AMV等。
具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶可以可逆地或不可逆地与适体偶联，适体在低于40℃的温度下抑制其活性。
等温扩增可以使用等温扩增方法进行，诸如：环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、转录介导扩增(TMA)、基于核酸测序的扩增(NASBA)等。
将收集的样品加入容器(2)，容器(2)含有用于逆转录和/或等温扩增以及用于实时鉴别扩增的试剂。
将容器(2)加入便携式装置(1)，便携式装置(1)将恒温加热容器(2)。
通过LAMP方法的等温扩增使用具有链置换活性的热稳定聚合酶DNA酶(诸如Bst酶等)进行。
具有链置换活性的耐热聚合酶DNA酶可以可逆地或不可逆地与适体偶联，适体在低于40℃的温度下抑制其活性。
具有链置换活性的热稳定聚合酶DNA酶也可具有逆转录酶活性，从而允许仅使用一种酶(诸如Bst酶等)进行逆转录和等温扩增。
逆转录扩增和/或等温扩增的反应混合物可由寡核苷酸引物、dNTP、具有链置换活性的热稳定聚合酶DNA酶和/或具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶、针对聚合酶DNA酶活性优化的缓冲液和用于实时辨别扩增片段的试剂的组合组成。
逆转录和/或等温扩增在37℃至70℃，优选65℃的温度下进行超过10分钟，优选30至60分钟的时间间隔。
扩增片段的实时鉴别可以使用一种或多种试剂以间接或直接的形式进行。
扩增片段的间接实时鉴别使用pH比色指示剂(诸如酚红等)或DNA嵌入荧光试剂(诸如SYBR绿等)。
扩增片段的直接实时鉴别是使用一个或多个寡核苷酸探针，其特定序列与相对保守的扩增片段的一个或更多区域互补。
寡核苷酸探针与荧光团(例如FAM、HEX、ROX或Cy5或类似物)和/或猝灭剂(例如DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或类似物)或两者的组合缀合。
寡核苷酸探针为RNA、DNA、LNA或PNA探针。
逆转录反应和/或等温扩增通过将从可能含有靶核酸的样品(诸如口腔拭子、鼻咽或鼻样品、血液、尿液、唾液、痰、粪便、环境或食物样品，或来自表面接触等)中提取和纯化的RNA或DNA添加到反应扩增混合物中或不提取和纯化这些样品的RNA或DNA的情况下直接添加这些样品到反应扩增混合物中而发生。
可以使用拭子、注射器、收集管或任何其他专为收集样品而设计的装置来收集待分析的样品。
该方法的特征在于由便携式装置(1)的分光光度传感器(7)检测的靶序列的存在和随后的逆转录和/或等温扩增导致比色或荧光强度的改变。
一般样品收集
在本发明中，可能含有SARS-CoV-2的病毒颗粒或暴露的病毒RNA本身的不同类型样品的收集可以以几种方式进行，这取决于样品的类型：
a)来自人或动物上呼吸道的样品，包括：
-来自鼻咽的分泌物，通过拭子收集并置于含有至多3mL病毒运输介质，或盐水溶液，或易于裂解病毒颗粒和/或保持病毒RNA完整的另一种溶液的管中。特别是，拭子必须平行于腭插入一个鼻孔中，直到感觉到轻微的阻力。将拭子放置几秒钟，以吸收分泌物。轻轻旋转取出，并在另一个鼻孔中重复收集。
-口咽分泌物，通过拭子收集并置于含有至多3mL病毒运输介质，或盐水溶液，或易于裂解病毒颗粒和/或保持病毒RNA完整的另一种溶液的管中。特别是，拭子必须插入口腔中并摩擦咽壁和口咽柱。
也可以将鼻咽分泌物的收集与口咽的收集相结合，由此在这种情况下，收集必须从口咽开始，然后按照前面的说明通过鼻咽。
-鼻咽抽吸物或鼻腔冲洗物，由抽吸物/鼻腔冲洗物样品的无菌容器收集。
b)来自人或动物下呼吸道的样品，包括：
-气管内抽吸物，由用于液体样品的无菌容器收集。
-支气管肺泡灌洗，由用于液体样品的无菌容器收集。
-咳痰，由用于液体样品的无菌容器收集。
c)人或动物粪便样品，由抹刀收集至用于粪便样品的无菌容器。
d)人或动物尿液样品，由用于尿液样品的无菌容器收集。
e)人或动物血液样品，由毛细管或注射器收集至无菌干燥管。
f)环境样品，包括雨水、河流或废水或土壤，通过适当的方法由无菌容器收集。
g)食物样品，包括食物及其容器，通过适当的方法由无菌容器收集。
h)表面样品，诸如来自接触表面或物体的样品，通过拭子收集并置于含有至多3mL病毒运输介质，或盐水溶液，或易于裂解病毒颗粒和/或保持病毒RNA完整的另一种溶液的管中。特别是，拭子必须擦拭表面，试图从待分析表面的良好部分收集样品。
在通过拭子收集样品的情况下，必须使用带塑料棒的合成纤维拭子，或不抑制逆转录反应和/或等温扩增或可能降解病毒RNA样品的任何其它拭子。
在所有情况下，样品可用于提取和纯化病毒RNA，使用传统的核酸提取和纯化方法或商用试剂盒。或者，可以将一部分样品置于含有缓冲液和一种或多种RNA酶抑制剂的水溶液中，由此可以在等温扩增过程中通过渗透、机械和/或温度裂解来裂解病毒颗粒以释放病毒RNA用于随后的分析。
逆转录和等温扩增
在本发明中，由逆转录产生的cDNA的逆转录和扩增反应仅在一步中进行。此外，以等温方式进行扩增以与逆转录反应相容。因此，可以使用不同的等温扩增技术：
·环介导等温扩增(LAMP)
·解旋酶依赖性扩增(HDA)
·滚环扩增(RCA)
·链置换扩增(SDA)
·多重置换扩增(MDA)
·重组酶聚合酶扩增(RPA)
·转录介导的扩增(TMA)
·基于核酸测序的扩增(NASBA)
进而，实时扩增的鉴别可以以两种方式进行：
-间接检测
在间接检测中，扩增是以非特异性方式进行的，无论是通过监测与靶模板扩增相关的变量(例如，反应的pH、浊度等的变化)，还是通过比色或嵌入荧光试剂到整个反应中产生的双链DNA上(当存在阳性模板时)。然而，这种间接方法是不可取的，因为它可能报告假阳性结果，假阳性结果可能在模板或甚至寡核苷酸引物二聚体非特异性扩增的情况下发生。
-直接检测
在直接检测中，扩增以特异性方式进行，使用特异性寡核苷酸探针，其在扩增区的区域中特异性杂交，产生与扩增DNA成比例的信号改变。在这些探针中，有三种方法可用于监测逆转录和/或等温扩增。即，
逆转录和/或等温扩增的目的是为了同时扩增和检测一个或多个区域，为此目的可采用多重方法。此外，在多重方法中，其中一个区域可用作样品的内部对照，例如，通过使用待测靶生物维持基因(例如人、动物、细菌、病毒等)，例如肌动蛋白基因、GAPDH或泛素。可替代地，或者如果待测样品不是来源于生物体(例如，表面或环境样品)，则掺入对照靶序列(例如，肌动蛋白基因、GAPDH或泛素)，或另一种合成靶，将其添加到收集的样品中，或直接添加到反应混合物中。
发明的详细描述
本发明涉及一种用于检测和鉴定疑似冠状病毒样品中的特定核酸序列的集成系统，其中存在由移动应用程序(9)控制的便携式装置(1)，移动应用程序(9)记录由便携式装置(1)获取的数据，分析该数据并将其存储在云端中的远程服务器(10)中。
另外，本发明还涉及一种用于检测和鉴定疑似含有冠状病毒的样品中的所述特定核酸序列的方法，其包括便携式装置(1)、移动应用程序(9)和云端中的远程服务器(10)，它们作为一个系统一起工作。
便携式装置
本发明包含一种便携式装置(1)，其是对该方法的补充，其目的是控制检测并记录数据，该数据允许建立用于确定最后结果的分析。
为此目的，该装置(1)包含以下组件中的一个或多个：
a)具有集成Wi-Fi和/或蓝牙的微控制器(MCU)(5)，例如，ESP32，其目的是控制不同的组件并管理由一些组件产生的所有信息，这些组件产生对测试有用的数据，即由温度传感器(6)和分光光度传感器(7)产生的数据，所有这些组件由固件管理。固件控制装置(1)的不同组件，特别是：
-其在检测过程中保持等温；
-其控制照明光源并记录检测过程中的光谱变化；
-其通过蓝牙或Wi-Fi与移动应用程序双向通信，或通过Wi-Fi与云端中的远程服务器通信。
b)一个或多个分光光度传感器(7)，其允许在UV、可见和/或红外光谱的不同波长中，优选以小于或等于40nm的分辨率，对光子的发射进行差分量化。它们捕获并分析UV、可见光和/或红外光谱的不同波长的光子，这些光子反映由试剂产生的信号，用于实时辨别扩增片段。在通过比色变化间接检测的情况下，检测是通过减去光子(通常来自白光)来进行的，这些光子是由照明系统在180°下从分光光度传感器产生的，并被反应容器中的样品吸收。
在间接检测或通过荧光直接检测的情况下，在使用来自分光光度传感器(7)的90°光源激发荧光团之后进行检测，并且随后通过分光光度传感器(7)检测由激发的荧光团产生的光子的发射。在这种情况下，借助于UV、可见和/或红外光谱的不同区域的单独读数并使用一个或多个激发源(90°的光源#1和#2)(3)，可以同时在反应容器(2)中的一个或更多荧光团的荧光中检测到差异。
这些传感器(7)可以是光伏、光电二极管、光敏电阻或光电晶体管类型，并且可以耦合到滤光器(例如带通滤光器)，以更好地限定光谱检测区。
由分光光度传感器(7)检测的所有光子通过电子装置与MCU(5)通信。
c)一个或多个光源(3)，其目的是通过吸收由用于实时辨别扩增片段的试剂发射的光，帮助分光光度传感器(7)读取比色或荧光变化。
这些光源(3)可以是白炽灯、发光二极管(LED)、激光器(受激辐射的光放大)或任何其他发射光子的光源，并且可以与滤光器(例如带通滤光器)耦合，以更好地限定发射的光谱区，发射具有与探针的荧光团的选择性激发相容的波长的光子，或者在宽的可见光谱中发射光子。
d)热源(8)，其目的是将反应容器(2)加热到DNA聚合酶工作的最佳温度。该源(8)可以由一个或多个电阻器、珀尔帖模块或能够达到100℃并且比室温高最少4℃的任何其他热源构成。
e)温度传感器(6)，其目的是测量由热源(8)产生的温度，以便在MCU(5)的帮助下，可以将反应容器(2)的加热“恒温”到DNA聚合酶工作的最佳温度，从而进一步确保不会无意中达到其失活温度。温度传感器(6)为热敏电阻型(NTC或PTC)、热电阻型(RTD)、热电偶型(例如PT100或PT1000)或基于半导体等，测量能力在0至100℃之间，分辨率在0.01至5℃之间。
f)电池(4)，其目的是以自主方式对便携式装置(1)充电并操作一段时间，这允许执行至少一次检测。
电池(4)通过DC充电进行充电，DC充电还可以替代地为装置(1)对电池(4)充电。
可充电电池(4)可以由离子铝、锂、钾或镁、碳、流动的(flow)(钒或锌)、铅酸或聚合物等组成。
便携式装置(1)由连接到云端中的远程服务器(10)的移动应用程序(9)控制，使得在便携式装置(1)、移动应用程序(9)和云端中的远程服务器(10)之间存在数据和命令的传输。可选地，便携式装置(1)也可以将其自身直接连接到云端中的远程服务器(10)以用于数据传输。
一旦使用者开始测试，通过移动应用程序(9)，将反应混合物在便携式装置(1)中在37℃至70℃的恒温下孵育30分钟，并根据所使用的等温扩增技术，该时间可以延长至90分钟，或甚至120分钟。
通过使用荧光嵌入试剂(例如SYBRTM绿)间接监测样品的扩增和/或使用用荧光团标记的特异性寡核苷酸探针(例如FAM、HEX、ROX或Cy5或类似物)直接监测样品的扩增，使用各自的光源(3)作为荧光团的激发源，并通过分光光度传感器(7)记录其在可见/红外UV光谱的不同波长(315至1400nm，至多40nm间隔)中的发射。或者，同一传感器(7)也可以监测反应混合物颜色的变化，作为间接确定是否发生扩增的形式。
使用移动应用程序(9)启动和控制整个过程，移动应用程序(9)在整个时间分析分光光度传感器(7)的数据以确定最终结果。
移动应用程序
本发明还包含移动应用程序(9)，其通过蓝牙或可选地通过Wi-Fi与便携式装置(1)连接。
用于控制便携式装置(1)的移动应用程序(9)与Android或iOS或移动设备的任何其它操作系统兼容。
移动应用程序(9)对便携式装置(1)生成的数据进行处理并将其传送到云端中的远程服务器(10)。
应用程序(9)允许通过使用移动设备的相机记录与包含反应混合物的试剂管相关联的条形码来进行检测的记录，以便能够记录它将处理的检测的标记。通过该标记，移动应用程序(9)与云端中的远程服务器(10)通信，以便收集测试的参数(时间、温度、待分析数据、分析截止时间等)，并将这些参数传送到便携式装置(1)以能够启动检测。
移动应用程序(9)还允许记录用户ID、样本ID，并为测试指定唯一ID(由云端中的远程服务器(10)指定ID)。可选地，应用程序(9)还记录测试的位置以允许流行病/大流行病的地理跟踪，同时保护用户的个人数据的匿名性。
一旦在便携式装置(1)中处理了检测，这将在检测过程中由分光光度传感器(7)收集的数据传送到应用程序(9)。该数据将由移动应用程序(9)分析，所用荧光团发射的各个波长中的荧光强度变化大于初始荧光信号的10％，并且其在小于1600秒的时间内发生(根据有问题的检测，该截止可能在700和3000之间变化)的样品，移动应用程序(9)将认为是阳性的。也可以使用一种以上标记有不同荧光团(例如FAM、HEX、ROX或Cy5或类似物)的特异性寡核苷酸探针以多重方式进行监测，其可以在不同波长(例如520nm、556nm、602nm、670nm等)下进行监测。
云端中的远程服务器(10)
本发明还包含云端中的远程服务器(10)，其以集中的方式存储和处理来自所有检测的数据以及可在便携式装置(1)上进行的每个检测所使用的参数(反应时间、反应温度、要记录的数据、要记录数据的间隔、用于结果分析的参数等)。服务器(10)还通过移动应用程序(9)为每个检测分配一个唯一的ID，将该ID与结果和其它信息(样本ID、测试位置、用户等)相关联。服务器(10)还可以包括人工智能算法，用于动态分析其中合并的所有数据，以及及时分析各个健康实体。对服务器(10)中的所有数据进行加密以维护所存储的并且在服务器与移动应用程序(9)和/或便携式装置(1)之间传输的所有数据的网络安全。
发明的详细描述
-样品的收集和处理
在本发明中，通常用拭子收集待分析的样品并置于含有至多3mL病毒运输介质，或盐水溶液，或能够裂解病毒颗粒和/或保持病毒RNA完整的另一种溶液的管中。接下来，将该水介质的一部分(1-40微升)添加到先前制备的反应混合物中并提供给最终使用者。或者，可以对收集的样品进行处理，以提取和纯化病毒RNA，使用核酸的传统提取和纯化方法或用于此目的的商业试剂盒，将纯化的核酸重悬浮于不含核糖核酸酶的蒸馏水(I型)中，随后将一部分用于分析这些纯化后的重悬浮核酸(1-40微升)。
-Lamp寡核苷酸引物
在本发明中，定义了一组寡核苷酸引物，用于通过LAMP方法从SARS-CoV-2相对保存的不同基因组区域进行逆转录和等温扩增。即，对于以下区域：
表1.与冠状病毒严重急性呼吸综合征2(SARS-CoV-2)基因组区域相关的RNA模板。
表2.用于冠状病毒严重急性呼吸综合征2(SARS-CoV-2)基因组区域逆转录和等温扩增的寡核苷酸引物。
-特异性寡核苷酸探针
在本发明中，定义了与荧光团内部缀合的一组寡核苷酸探针，其以其分离的形式自淬灭，并且其序列在位于通过LAMP扩增的片段中的SARS-CoV-2的不同基因组区域的特定保留区中杂交，由此它们通过根据区域包括作为直接或反向环的寡核苷酸引物而起作用。通过与互补区杂交，荧光团停止自淬灭，增加其荧光发射。即，这些是每个区域的探针：
表3.用于冠状病毒严重急性呼吸综合征2(SARS-CoV-2)基因组区域的逆转录和/或等温扩增的特异性鉴别探针。
OBS.：*与荧光团内部缀合的dT。
-Lamp反应
通过本发明的方法优化LAMP反应混合物用于检测和鉴定SARS-Cov-2的方法，其含有：1.6μM的各核苷酸引物FIP和BIP；0.2μM的各核苷酸引物F3和B3；0.4μM的各核苷酸引物LF或LB和各特异性寡核苷酸探针LB或LF，根据待分析区域；1.4mM的各dNTP；320U/ml BstDNA聚合酶；500U/mL逆转录酶；20mM Tris-HCl pH 8.8@25℃；8mM(NH4)2SO4；10mM MgSO4；50mM KCl；和0.1％
20。
表4.用于冠状病毒严重急性呼吸综合征2(SARS-CoV-2)基因组区域的逆转录和/或等温扩增的寡核苷酸引物组合。
表5.与荧光团缀合并替换其中一个寡核苷酸引物(在其用于逆转录和/或等温扩增的情况下)以用于实时鉴别冠状病毒严重急性呼吸综合征2(SARS-CoV-2)的基因组区域的逆转录和/或等温扩增的特异性寡核苷酸探针的组合。
考虑到样品体积为8μL，所用反应混合物的最终体积为20μL。然而，反应混合物的最终体积可以在5至100μL之间成比例地调节。任选地，为了避免检测过程中反应混合物的蒸发，加入20μL矿物油或液体蜡。为进行反应试验，使用0.2mL的PCR管作为反应容器，也可使用0.1mL至0.5mL的管。
将反应混合物在便携式装置(1)中在65℃的恒温下孵育30分钟。在该时间结束时，将来自分光光度传感器(7)的数据发送到移动应用程序(9)并进行分析。所用荧光团(FAM)发射的相应波长的荧光强度的变化比初始荧光信号高10％，并且在小于1600秒的时间内发生的样品被认为是阳性的。随后通过琼脂糖凝胶电泳(2％，在TAE1x中，6V/cm)和Sanger测序证实这些结果。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于检测和鉴定疑似冠状病毒样品中特定核酸序列的集成系统，其特征在于，所述特定核酸序列属于冠状病毒科的病毒，特别是严重急性呼吸综合征SARS-Cov-2物种，所述集成系统包含：
i)便携式装置(1)，其包含反应容器(2)、电池(4)、温度传感器(6)，其中所述便携式装置(1)还包含：
a)一或多个分光光度传感器(7)，其被配置为对315至1400nm之间的不同波长的光子的发射进行差分量化，优选地以小于或等于40nm的分辨率对315至1400nm之间的不同波长的光子的发射进行差分量化；
b)一或多个照明光源(3)，其与滤光器耦合；
c)一热源(8)，其由一个或多个电阻器、珀尔帖模块或能够达到至少100℃并且比室温高最少4℃的任何其他热源构成；
d)一具有集成Wi-Fi和/或蓝牙的微控制器(5)，其含有固件；
e)所述反应容器(2)含有疑似冠状病毒样品和用于实时鉴别扩增的逆转录和/或等温扩增试剂，所述试剂包含SEQ ID No.12至109中的一或多个；
(ii)移动应用程序(9)，其用于执行通过蓝牙和/或Wi-Fi传输的便携式装置(1)记录的和生成的信号；
(iii)云端的远程服务器(10)，其用于存储和处理由便携式装置(1)记录和传输的信号。
2.根据权利要求1所述的集成系统，其特征在于，所述便携式装置(1)的移动应用程序(9)与Android或iOS或移动设备的任何其它操作系统兼容。
3.根据前述权利要求所述的集成系统，其特征在于，所述样品来自上呼吸道或下呼吸道、鼻咽抽吸物或鼻腔冲洗物、粪便、唾液、人或动物尿液样品、环境样品、食物样品。
4.根据前述权利要求所述的集成系统，其特征在于，所述疑似冠状病毒样品是从可能含有靶核酸的样品中提取和纯化的RNA或DNA，或不提取和纯化RNA或DNA而直接添加这些相同样品，所述样品诸如口腔拭子、鼻咽或鼻样品、血液、尿液、唾液、痰、粪便、环境样品或食物，或来自接触表面等。
5.根据前述权利要求所述的集成系统，其特征在于，所述一或多个分光光度传感器(7)为光伏、光电二极管、光敏电阻或光电晶体管类型，并且可以与滤光器例如带通滤光器耦合。
6.根据前述权利要求所述的集成系统，其特征在于，所述一或多个照明光源(3)为白炽灯、发光二极管或激光器。
7.根据前述权利要求所述的集成系统，其特征在于，所述温度传感器(6)为热敏电阻型、热电阻型、热电偶型，或者基于半导体。
8.一种使用权利要求1-7中定义的集成系统，基于一或多个基因组区域的逆转录和/或等温扩增的反应，实时鉴别疑似冠状病毒样品中的扩增片段的方法，其特征在于，其包含以下步骤：
a)收集和处理待分析样品；
b)将收集的样品加入反应容器(2)，所述反应容器(2)含有用于逆转录和/或等温扩增反应的试剂的反应混合物，所述试剂包含SEQ ID No.12至109中的一或多个；
c)将含有待分析样品的反应容器(2)加入便携式装置(1)，然后恒温加热容器(2)，随后进行逆转录和/或等温扩增反应，记录便携式装置(1)中等温扩增的鉴别信号；
d)由便携式装置(1)的一或多个分光光度传感器(7)通过蓝牙或Wi-Fi将提及的记录信号传输到云端的远程服务器(10)和/或传输到移动应用程序(9；
e)分析便携式装置(1)在移动应用程序(9)中记录的信号以确定最终结果，阳性或阴性，其中阳性指示样品中作为靶标的核酸序列的存在；
f)分析步骤e)的结果，其中当荧光团发射的各个波长中的荧光强度变化大于初始荧光信号的10％，并且其在小于1600秒内发生时，最终结果是阳性的；
g)记录云端的远程服务器(10)中维护的最终结果，所述最终结果由移动应用程序(9)处理并被传输到云端的远程服务器(10)，或者由便携式装置(1)记录和生成的信号由移动应用程序(9)处理并被传输到云端的远程服务器(10)。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品来自上呼吸道或下呼吸道、鼻咽抽吸物或鼻腔冲洗物、粪便、唾液、人或动物尿液样品、环境样品、食物样品。
10.根据权利要求8-9所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应和/或等温扩增通过将从可能含有靶核酸的样品中提取和纯化的RNA或DNA样品添加到反应扩增混合物中或在不提取和纯化RNA或DNA的情况下将这些相同样品直接添加到反应扩增混合物中而进行，所述样品诸如口腔拭子、鼻咽或鼻样品、血液、尿液、唾液、痰、粪便、环境或食物样品，或来自接触表面等。
11.根据权利要求8-10所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应使用具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶进行，诸如HIV-1、M-MLV、AMV等。
12.根据权利要求8-11所述的方法，其特征在于，所述反应混合物是寡核苷酸引物、dNTP、具有链置换活性的热稳定聚合酶DNA酶和/或具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶、用于聚合酶DNA酶活性的缓冲液和用于实时鉴别扩增片段的试剂的组合。
13.根据权利要求8-12所述的方法，其特征在于，所述具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶可逆地与适体偶联，所述适体在低于40℃的温度下抑制其活性。
14.根据权利要求8-13所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸引物序列包含SEQ.IDNo.12至95中的一或多个。
15.根据权利要求8-14所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应和/或等温扩增在37-70℃的温度下进行至少10分钟至120分钟。
16.根据权利要求8-15所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应和/或等温扩增在65℃的优选温度下进行30分钟。
17.根据权利要求8-16所述的方法，其特征在于，所述扩增片段的实时鉴别以间接或直接的方式进行。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述DNA扩增片段的实时间接鉴别使用比色pH指示试剂，诸如酚红等，或嵌入DNA试剂，诸如SYBRTM绿，进行。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述DNA扩增片段的实时直接鉴别使用与荧光团，和/或猝灭剂，或两者的组合缀合的一或多种特异性寡核苷酸探针进行。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述荧光团为FAM、HEX、ROX或Cy5或类似物，所述猝灭剂为DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或类似物。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针属于SEQ.ID No.96至109.
22.根据权利要求8-21所述的方法，其特征在于，所述用于控制便携式装置(1)的移动应用程序(9)与Android或iOS或移动设备的任何其它操作系统兼容。
Claims (35)
1.一种用于检测和鉴定疑似冠状病毒样品中的特定核酸序列的便携式装置(1)，其包含反应容器(2)、电池(4)、温度传感器(6)，其特征在于其进一步包含：
a)一或多个分光光度传感器(7)；
b)一或多个照明光源(3)；
c)一热源(8)；
d)一具有集成Wi-Fi和/或蓝牙的微控制器(5)，其含有固件；
e)其中所述反应容器(2)包含疑似冠状病毒样品和用于实时鉴别扩增的逆转录和/或等温扩增试剂。
2.根据权利要求1所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述样品来自上呼吸道或下呼吸道、鼻咽抽吸物或鼻腔冲洗物、粪便、唾液、人或动物尿液样品、环境样品、食物样品。
3.根据前述权利要求所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述疑似冠状病毒样品是从可能含有靶核酸的样品中提取和纯化的RNA或DNA，或不提取和纯化RNA或DNA而直接添加这些相同样品，所述样品诸如口腔拭子、鼻咽或鼻样品、血液、尿液、唾液、痰、粪便、环境样品或食物，或来自接触表面等。
4.根据前述权利要求所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述用于实时鉴别扩增的逆转录和/或等温扩增试剂包含SEQ ID No.12至109中的一或多个。
5.根据前述权利要求所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述一或多个分光光度传感器(7)被配置为对315至1400nm之间的不同波长的光子的发射进行差分量化，优选地以小于或等于40nm的分辨率对315至1400nm之间的不同波长的光子的发射进行差分量化。
6.根据前述权利要求所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述一或多个分光光度传感器(7)为光伏、光电二极管、光敏电阻或光电晶体管类型，且可以与滤光器例如带通滤光器耦合。
7.根据前述权利要求所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述热源(8)由一或多个电阻器、珀尔帖模块或能够达到至少100℃并且比室温高最少4℃的任何其他热源构成。
8.根据前述权利要求所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述一个或多个照明光源(3)为白炽灯、发光二极管或激光器。
9.根据前述权利要求所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述一个或多个照明光源(3)与滤光器耦合。
10.根据前述权利要求所述的便携式装置(1)，其特征在于，所述温度传感器(6)为热敏电阻型、热电阻型、热电偶型，或者基于半导体。
11.一种移动应用程序(9)，其特征在于，其通过蓝牙或通过Wi-Fi与权利要求1-10中定义的便携式装置(1)连接。
12.一种云端的远程服务器(10)，其特征在于，其通过Wi-Fi与权利要求11中定义的移动应用程序(9)和/或权利要求1-10中定义的便携式装置(1)连接。
13.一种用于检测和鉴定疑似冠状病毒样品中的特定核酸序列的系统，其特征在于，其包含权利要求1-10中定义的便携式装置、权利要求11中定义的移动应用程序(9)和权利要求12中定义的云端的远程服务器(10)。
14.一种用于检测和鉴定核酸的特定序列的方法，其使用权利要求1-10中定义的便携式装置(1)、权利要求11中定义的移动应用程序(9)和权利要求12中定义的云端的远程服务器(10)，基于一或多个基因组区域的逆转录和/或等温扩增的反应，实时鉴别疑似冠状病毒样品中的扩增片段，
其特征在于，其包含以下步骤：
a)收集和处理待分析样品；
b)将收集的样品加入反应容器(2)，所述反应容器(2)含有用于逆转录和/或等温扩增反应的试剂的反应混合物；
c)将含有待分析样品的反应容器(2)加入便携式装置(1)，然后恒温加热容器(2)，随后进行逆转录和/或等温扩增反应，记录便携式装置(1)中等温扩增的鉴别信号；
d)由便携式装置(1)的一或多个分光光度传感器(7)通过蓝牙或Wi-Fi将提及的记录信号传输到云端中的远程服务器(10)；
e)分析便携式装置(1)在移动应用程序(9)中记录的信号以确定最终结果，阳性或阴性，其中阳性指示样品中作为靶标的核酸序列的存在；
f)记录云端的远程服务器(10)中维护的最终结果。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述样品来自上呼吸道或下呼吸道、鼻咽抽吸物或鼻腔冲洗物、粪便、唾液、人或动物尿液样品、环境样品、食物样品。
16.根据权利要求14-15所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应和/或等温扩增通过将从可能含有靶核酸的样品中提取和纯化的RNA或DNA样品添加到反应扩增混合物中或在不提取和纯化RNA或DNA的情况下将这些相同样品直接添加到反应扩增混合物中而进行，所述样品诸如口腔拭子、鼻咽或鼻样品、血液、尿液、唾液、痰、粪便、环境或食物样品，或来自接触表面等。
17.根据权利要求14-16所述的方法，其特征在于，待测特定核酸序列为源自病毒的脱氧核糖核酸或核糖核酸的序列。
18.根据权利要求14-17所述的方法，其特征在于，所述病毒选自：腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、冠状病毒、小核糖核酸病毒、披盖病毒、正粘病毒、弹状病毒、逆转录病毒、嗜肝DNA病毒等。
19.根据权利要求14-18所述的方法，其特征在于，所述核酸序列属于冠状病毒科的病毒，特别是严重急性呼吸综合征SARS-Cov-2的物种。
20.根据权利要求14-19所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应使用具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶进行，诸如HIV-1、M-MLV、AMV等。
21.根据权利要求14-20所述的方法，其特征在于，所述反应混合物是寡核苷酸引物、dNTP、具有链置换活性的热稳定聚合酶DNA酶和/或具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶、用于聚合酶DNA酶活性的缓冲液和用于实时鉴别扩增片段的试剂的组合。
22.根据权利要求14-21所述的方法，其特征在于，所述具有逆转录酶活性的聚合酶DNA酶可逆地与适体偶联，所述适体在低于40℃的温度下抑制其活性。
23.根据权利要求14-22所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸引物序列包含SEQ.IDNo.12至95中的一或多个。
24.根据权利要求14-23所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应和/或等温扩增在37-70℃的温度下进行至少10分钟至120分钟。
25.根据权利要求14-24所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应和/或等温扩增在65℃的优选温度下进行30分钟。
26.根据权利要求14-25所述的方法，其特征在于，所述扩增片段的实时鉴别以间接或直接的方式进行。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述DNA扩增片段的实时间接鉴别使用比色pH指示试剂，诸如酚红等，或嵌入DNA试剂，诸如SYBRTM绿，进行。
28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述DNA扩增片段的实时直接鉴别使用与荧光团，和/或猝灭剂，或两者的组合缀合的一或多种特异性寡核苷酸探针进行。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述荧光团为FAM、HEX、ROX或Cy5或类似物，所述猝灭剂为DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或类似物。
30.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针属于SEQ.ID No.96至109。
31.根据权利要求14-30所述的方法，其特征在于，所述便携式装置(1)的一或多个分光光度传感器(7)的记录信号通过蓝牙和/或Wi-Fi传输到移动应用程序(9)。
32.根据权利要求14-31所述的方法，其特征在于，所述用于控制便携式装置(1)的移动应用程序(9)与Android或iOS或移动设备的任何其它操作系统兼容。
33.根据权利要求14-32所述的方法，其特征在于，所述记录在便携式装置(1)中的信号在云端的远程服务器(10)中存储和处理。
34.根据权利要求14-33所述的方法，其特征在于，所述由便携式装置(1)记录和生成的信号由移动应用程序(9)处理并传输到云端的远程服务器(10)。
35.根据权利要求14-34所述的方法，其特征在于，荧光团发射的各个波长中的荧光强度变化大于初始荧光信号的10％，并且其在小于1600秒内发生时，所述最终结果是阳性的。
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