ES2290803T3

ES2290803T3 - Pigmento magnetico.

Info

Publication number: ES2290803T3
Application number: ES05004214T
Authority: ES
Inventors: Jorg Kleiber; Thomas Walter; Herbert Harttig; Martin Menning; Christoph Lesniak; Michael Riedling; Helmut K. Schmidt
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-06-08
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: EP1577389A3; NO975772L; EP1281714B1; ES2247236T3; EP1577389B1; EP0837871B1; EP1281714A1; HK1051048A1; US6870047B2; EP1577389B2; DK1281714T3; DE19520398A1; NO330520B1; DE19520398B4; CA2605671A1; NZ311648A; CN1891833A; CA2223821C; ATE301665T1; DE19537985A1

Abstract

Procedimiento para la reacción enzimática de ácidos nucleicos, en el que los ácidos nucleicos de una muestra, que contiene los ácidos nucleicos en un líquido, se aíslan por adsorción en forma nativa sobre partículas magnéticas de superficie de vidrio y a continuación se utilizan como sustrato de una reacción enzimática.

Description

Pigmento magnético.

Es objeto de la presente invención un procedimiento de reacción enzimática de ácidos nucleicos, en el que los ácidos nucleicos de una muestra, que contiene los ácidos nucleicos en un líquido, se aíslan por adsorción en forma nativa sobre partículas magnéticas de superficie de vidrio y a continuación se utilizan como sustrato de una reacción enzimática.

Muchos materiales biológicos, en especial los ácidos nucleicos, plantean exigencias especiales sobre todo en lo que respecta a su aislamiento del entorno natural. Por un lado están presentes a menudo en concentraciones muy bajas y por otro lado se hallan a menudo rodeados de muchas otras sustancias, sólidas o disueltas, que dificultan tanto su aislamiento como su determinación.

En los últimos tiempos no han faltado intentos ni propuestas de procedimientos y materiales para aislar ácidos nucleicos de su entorno natural. En Proc. Natl. Acad. USA 76, 615-619 (1979) se describe la fijación de ácidos nucleicos de geles de agarosa en presencia de yoduro sódico en vidrio flint molido.

En Anal. Biochem. 121, 382-387 (1982) se describe la purificación de DNA de plásmido de bacterias con vidrio en polvo en presencia de perclorato sódico.

En el documento DE-A-37 34 442 se describe el aislamiento de DNA de fagos M13 monohebra en filtros de fibras de vidrio por precipitación de las partículas de fago mediante ácido acético y lisis de las partículas de fago con perclorato. Los ácidos nucleicos fijados sobre el filtro de fibras de vidrio se lavan con un tampón metanólico y se eluyen en tampón Tris/EDTA.

En Anal. Biochem. 175, 196-201 (1988) se describe un procedimiento similar para la purificación de DNA de fagos lambda.

En el documento WO 95/04140 se describe un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos purificados de organismos gram-positivos de una muestra biológica. La muestra biológica se mezcla con una lisozima, una sustancia caotrópica y una fase sólida, p.ej. partículas de sílice. Los ácidos nucleicos, que se fijan sobre la fase sólida, se separan posteriormente del resto de la muestra. A continuación se purifican los complejos de partículas de sílice-ácido nucleico con soluciones tampón, se precipitan los ácidos nucleicos, se eluyen y se amplifican.

Los procedimientos mencionados del estado de la técnica tienen en común la fijación selectiva de ácidos nucleicos sobre superficies de vidrio en soluciones salinas caotrópicas, con lo cual se separa el ácido nucleico de impurezas como puedan ser la agarosa, las proteínas o fragmentos celulares. Para separar las partículas de vidrio de las impurezas según el estado de la técnica se aplica ya sea la centrifugación de las partículas, ya sea la succión de líquidos a través de filtros de fibras de vidrio. En cualquier caso es una etapa limitadora que impide en gran manera procesar números elevados de muestras.

En Anal. Biochem. 201, 166-169 (1992) o en el documento PCT GB 91/00212 se describe el uso de partículas magnéticas para inmovilizar ácidos nucleicos después de la precipitación por adición de sal y etanol. En este caso tiene lugar una aglutinación de los ácidos nucleicos, con inclusión de las partículas magnéticas. El material aglutinado se separa de los disolventes iniciales por aplicación de un campo magnético y por lavado. Después de una operación de lavado se disuelven los ácidos nucleicos en un tampón Tris. Sin embargo, este procedimiento tiene el inconveniente de que la precipitación no es selectiva para los ácidos nucleicos, sino que en se aglutinan simultáneamente una gran cantidad de sustancias sólidas y disueltas. Por lo tanto, con este procedimiento no se pueden eliminar de forma suficiente los inhibidores, eventualmente presentes, de determinadas reacciones enzimáticas.

En el documento US-A-4 233 169 se describe un vidrio poroso que lleva incorporadas partículas magnéticas.

En el mercado existe actualmente un vidrio poroso de tipo magnético, que contiene partículas magnéticas dentro de una estructura o matriz porosa, formada por partículas y su superficie exterior está recubierta con una capa que contiene estreptavidina. Este producto puede utilizarse para el aislamiento de materiales biológicos, por ejemplo proteínas o ácidos nucleicos, en el supuesto de que estos se hayan modificado en una laboriosa etapa previa de preparación, de tal manera que estén unidos con la biotina mediante un enlace covalente.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento sencillo e idóneo para el diagnóstico rutinario, destinado a aislar ácidos nucleicos.

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Los expertos entienden por partículas aquellos materiales sólidos que tienen un diámetro pequeño. Algunas veces, estas partículas se denominan también pigmentos. En el sentido de la presente invención son especialmente idóneas aquellas partículas que tienen un tamaño de grano medio inferior a 100 \mum. Son preferidas en especial las que tienen un tamaño de grano medio comprendido entre 10 y 60 \mum. La distribución de tamaños de partículas es con preferencia relativamente homogénea, en especial prácticamente no existen partículas inferiores a 10 \mum ni superiores a
60 \mum.

Se denominan magnéticos aquellos materiales que pueden atraerse con un imán, es decir, los materiales ferromagnéticos o los superparamagnéticos. Se entiende también por materiales magnéticos aquellos que se denominan materiales magnéticos blandos, p.ej. las ferritas. Son especialmente preferidos en el sentido de la invención los materiales ferromagnéticos, en especial cuando todavía no se han premagnetizado. En este contexto, se entiende por premagnetización la puesta en contacto con un imán, con lo cual se aumenta la remanencia. Son especialmente preferidos los materiales ferromagnéticos tales como p.ej. la magnetita (Fe_{3}O_{4}) o el Fe_{2}O_{3}.

Se entiende por superficie exterior de una partícula la superficie coherente y continua desde la cual pueden trazarse perpendiculares en dirección al entorno de la partícula, que no llegan a cortar la partícula propiamente dicha.

Se entiende por poro una cavidad vaciada en la superficie exterior de la partícula, en la que la superficie penetra en la superficie hasta el punto que una perpendicular trazada de forma ideal en la cavidad de la superficie en dirección al entorno próximo de la partícula corta dicha partícula por lo menos 1 vez. Además, los poros penetran en la partícula hasta una profundidad mayor que un radio de poro.

Se entiende por vidrio en el sentido de la presente invención un material amorfo provisto de silicio. El vidrio puede contener otros materiales, p.ej.

B_{2}O_{3}: (0-30%),

Al_{2}O_{3}: (0-20%),

CaO: (0-20%),

BaO: (0-10%),

K_{2}O: (0-20%),

Na_{2}O: (0-20%),

MgO: (0-18%),

Pb_{2}O_{3}: (0-15%).

En menor cantidad, del 0 al 5%, pueden estar presentes además un gran número de otros óxidos, p.ej. Mn_{2}O_{3}, TiO_{2}, As_{2}O_{3}, Fe_{2}O_{3}, CuO, CoO, etc. Han dado resultados especialmente buenos los superficies que tienen una composición de vidrio de borosilicato, de vidrio flint o de sílice. Desde el punto de vista de rendimiento en ácidos nucleicos, los vidrios de borosilicato especialmente adecuados tienen un contenido en óxido de boro de más del 25%; se ha reconocido como especialmente valioso un vidrio de composición SiO_{2}/B_{2}O_{3} = 70/30. En el sentido de la invención es idóneo el uso de los vidrios obtenidos por el proceso llamado sol-gel y posterior secado y compactación de la capa formada. Este proceso en sus líneas generales ya es conocido y se ha descrito p.ej. en C.J. Brinker, G.W. Scherer "Sol Gel science - The physics and chemistry of Sol Gel Processing", Academic Press Inc. 1990 y "Sol-Gel Optics, Processing and Applications" de Lisa C. Klein, Ed. Kluwer Academic Publishers 1994, página 450 y sig. así como en DE-A-1 941 191, DE-A-3 719 339, DE-A-4 117 041 y DE-A-4 217 432. Sin embargo, tal proceso no se ha descrito hasta el presente para partículas magnéticas. No era de esperar que con ello puedan obtenerse partículas magnéticas que posean propiedades muy sorprendentes en el aislamiento de ácidos nucleicos. En el proceso sol-gel se depositan alcóxidos de los componentes que forman la estructura, p.ej. SiO_{2}, B_{2}O_{3}, Al_{2}O_{3}, TiO_{2}, ZrO_{2}, GeO_{2}, junto con óxidos y sales de otros componentes, p.ej. en solución alcohólica y se hidrolizan. En la ecuación se representa la obtención de un vidrio de silicato de sodioboroaluminio.

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Con la adición de agua se pone en marcha el proceso de hidrólisis de los componentes iniciales. La reacción transcurre de forma relativamente rápida, porque los iones alcalinos actúan catalíticamente sobre la velocidad de hidrólisis del éster del ácido silícico. Una vez finalizada la formación del gel, este puede secarse y compactarse mediante un proceso térmico para obtener un vidrio.

La proporción ponderal entre sol y pigmento tienen una gran influencia en el rendimiento del pigmento magnético. Los límites derivan de que la porción de pigmento ha de ser pequeña para que la masa formada pueda bombearse o proyectarse por atomización. Si la porción de pigmento es demasiado pequeña, entonces la porción de finos, p.ej. de material no magnético, resulta demasiado grande y molesta. Las proporciones ponderales idóneas, teniendo en cuenta el rendimiento de pigmento, se sitúan entre 10 y 25 g de pigmento por cada 100 ml de sol.

Para obtener un polvo se proyecta la suspensión con preferencia a través de una boquilla atomizadora y el aerosol se seca en su recorrido de caída. La boquilla está con preferencia calentada, con el fin de acelerar el secado de la suspensión. En función de la geometría de la boquilla, la temperatura de la misma se sitúa con preferencia entre 120 y 200ºC. Se puede lograr un compromiso mediante una velocidad suficiente de evaporación, pero conviene evitar las salpicaduras.

En lo referente al rendimiento, la temperatura de compactación debería elegirse lo más alta posible. Pero si es demasiado alta, las partículas se apelmazan entre sí, formándose aglomerados que tienen que separarse por tamizado. El tratamiento posterior en el aire, cuando las temperaturas son demasiado altas, conduce a una pérdida de propiedades magnéticas, por lo cual deberán evitarse las temperaturas demasiado altas.

Se entiende por una superficie fundamentalmente sin poros aquella superficie que está sembrada con menos del 5%, con preferencia con menos del 2%, con preferencia especial con menos del 0,1% de poros de la definición dada anteriormente. Si existen poros, estos deberán tener con preferencia un diámetro inferior a 10, con preferencia especial de 1 nm.

En el sentido de la invención pueden utilizarse también partículas que contienen un núcleo de mica recubierta con TiO_{2} y partículas de magnetita inmovilizadas sobre el mismo, pero el material mixto resultante está envuelto por la capa de vidrio. Tanto el núcleo como las partículas de magnetita son cristalinos y no porosos. Las zonas de la superficie de la mica, que no están ocupadas por las partículas de magnetita, está recubiertas por una capa de vidrio más gruesa que la existente sobre las puntas de las partículas de magnetita, de modo que resulta una superficie de vidrio fundamentalmente no porosa.

La no porosidad de las partículas magnéticas se refiere solamente a la superficie externa, pero no al interior de las partículas, de modo de las partículas pueden tener un interior poroso, en el supuesto de que la superficie está envuelta por un vidrio fundamentalmente no poroso o por una superficie de vidrio que tiene poros de diámetro inferior a 10 nm.

De modo sorprendente, el procedimiento de la invención es especialmente ventajoso para aislar ácido nucleicos de muestras. En especial los ácidos nucleicos, que son largos, no sufren destrucción alguna o solamente parcial, cuando se inmovilizan sobre las partículas magnéticas. El material del núcleo es además de origen natural y, por ello, inocuo desde el punto de vista ecológico. La fabricación de las partículas es, por otro lado, muy poco costosa y económicamente favorable.

Es preferido el uso de partículas ferromagnéticas con superficie de vidrio. En el estado de la técnica se han descrito partículas superparamagnéticas. Ahora se ha constatado que las partículas ferromagnéticas, cuando están recubiertas por una superficie de vidrio, presentan ventajas notables en el aislamiento de ácidos nucleicos. Mientras las partículas ferromagnéticas no se hallan expuestas a un campo magnético, sedimentan exclusivamente por acción de la fuerza de la gravedad. Para reconstruir de forma rápida y sencilla la suspensión basta con agitarlas. El fenómeno de la sedimentación sin intervención de un campo magnético transcurre con preferencia con mayor lentitud que la inmovilización de ácidos nucleicos en su superficie. Las partículas ferromagnéticas pueden recogerse de modo sencillo con un imán sobre una zona determinada del líquido de la muestra, con el fin de separar el líquido de las partículas y, de este modo, de los ácidos nucleicos inmovilizados.

La superficie de vidrio de las partículas ferromagnéticas puede estar exenta de poros o bien tener poros. Por las razones mencionadas anteriormente es preferido que la superficie exterior, incluso en el caso de las partículas ferromagnéticas, esté fundamentalmente libre de poros o que presente poros de diámetro inferior a 10 nm. Las partículas ferromagnéticas tienen con preferencia un tamaño de grano comprendido entre 10 y 60 \mum, con preferencia especial entre 20 y 50 \mum. Se utilizan con preferencia especial las partículas en las que los poros eventualmente existentes en la superficie tienen un diámetro inferior a 10, con preferencia especial de 1 nm. Un ejemplo de partícula ferromagnética es el material mixto, ya mencionado anteriormente, de partículas de mica y magnetita, envueltas con una capa de vidrio.

En una forma preferida de ejecución, el procedimiento de la invención consta de los pasos siguientes:

- poner en contacto una muestra, que contiene ácidos nucleicos en un líquido, con partículas magnéticas o con partículas ferromagnéticas en condiciones en las que los ácidos nucleicos se fijen sobre la superficie de las partículas y

- separar los ácidos nucleicos del líquido.

Se entiende por materiales biológicos a los ácidos nucleicos, p.ej. el DNA o el RNA.

En el sentido de la invención se entiende por muestras por ejemplo las muestras clínicas, tales como la sangre, el suero, el líquido de enjuague bucal, la orina, el líquido cerebral, el esputo, las heces, las muestras extraídas por punción y las muestras de médula ósea. La muestra puede proceder también del ámbito de la analítica medioambiental, de la analítica alimentaria o de la investigación de biología molecular, p.ej. de cultivos bacterianos, de lisados de fagos y de productos de procesos de amplificación, p.ej. de la PCR.

Las partículas magnéticas descritas tienen un núcleo interior sobre el que se coloca una superficie exterior de vidrio. El núcleo puede ser un material mixto, pero también puede ser un núcleo simple de hierro. El núcleo puede estar constituido por una estructura cristalina, cerámica o vítrea, en la que se aloja el óxido de hierro.

Con el procedimiento descrito pueden aislarse ácidos nucleicos nativos o modificados. Se entiende por ácidos nucleicos nativos aquellos cuya estructura no se ha alterado de modo irreversible con respecto a los ácidos nucleicos de origen natural. Sin embargo, esto no excluye la modificación de otros componentes de la muestra. Puede estar modificado por ejemplo en medio que envuelve a las células, pero no los ácidos nucleicos como tales. Los ácidos nucleicos deberán estar en forma nativa, es decir, no desnaturalizada, corta ni modificada por inserción de grupos reactivos. Por lo tanto, el término ácidos nucleicos nativos no abarca en particular a los ácidos nucleicos biotinilados. Son ejemplos de ácidos nucleicos nativos los DNA de fagos o los ácidos nucleicos celulares de la sangre.

Los ácidos nucleicos modificados abarcan aquellos materiales que no existen en la naturaleza, p.ej. ácidos nucleicos que se han modificado por inserción de grupos reactivos, detectables o susceptibles de inmovilización, p.ej. los ácidos nucleicos biotinilados.

En casos determinados, la muestra puede someterse al procedimiento de aislamiento de la invención sin tratamiento previo. Pero en muchos casos, la muestra tendrá que disgregarse mediante un método idóneo para que libere los ácidos nucleicos que contiene. Los expertos ya conocen los métodos de disgregación adecuados de las muestras, que pueden ser de índole química, enzimática o física. También es posible la combinación de estos métodos. Cabe mencionar, por ejemplo, la lisis por ultrasonidos, alta presión o por cizallamiento, por álcalis, detergentes o soluciones salinas caotrópicas, o por acción de proteinasas o de lipasas. En lo referente al procedimiento de disgregación para obtener ácidos nucleicos se remite en especial a Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y. y a Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, 1987, J. Wiley and Sons, N.Y.

Aparte de los ácidos nucleicos a aislar, la muestra puede contener en el líquido otros componentes, p.ej. fragmentos celulares, proteínas, sales y otros compuestos que no interesa aislar. Esta muestra, que con preferencia contiene los ácidos nucleicos en forma nativa, se pone en contacto con las partículas en unas condiciones, en las que los ácidos nucleicos se fijan sobre la superficie de dichas partículas. Las condiciones en principio son conocidas. Se basan en el tipo de enlace con el que los ácidos nucleicos se fijan sobre la superficie. En el procedimiento de la presente invención se fijan directamente los ácidos nucleicos en forma nativa sobre la superficie de vidrio. Por ello se puede prescindir de modificar los ácidos nucleicos. La fijación de ácidos nucleicos nativos sobre partículas de vidrio puede realizarse por métodos similares a los ya conocidos por el estado de la técnica. La fijación se efectúa con preferencia en presencia de sales caotrópicas, situándose la concentración de estas sales entre 2 y 8 moles/litro, con preferencia entre 4 y 6 moles/litro. Son ejemplos de sales caotrópicas el yodito sódico, el perclorato sódico, el tiocianato de guanidinio, el isotiocianato de guanidinio o el clorhidrato de guanidinio, pero no se limitan a estos compuestos.

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Para poner la muestra en contacto con las partículas, se mezcla aquella con estas y se incuban durante un tiempo suficiente para que se genere el enlace o fijación. El experto ya conoce el período de incubación normalmente por el tratamiento con partículas no magnéticas, que se puede optimizar realizando una determinación de la cantidad de ácidos nucleicos inmovilizados sobre la superficie en diversos intervalos de tiempo. Para ello pueden ser convenientes períodos de incubación comprendidos entre 10 segundos y 30 minutos.

Según el tamaño y la índole de las partículas magnéticas, durante el mismo período de incubación puede tener lugar una separación de las partículas del líquido o bien la suspensión puede mantenerse durante un período de tiempo considerable. Si el tamaño de grano de las partículas es muy pequeño y dichas partículas son paramagnéticas, la suspensión se mantendrá durante un largo período de tiempo. Si el tamaño de grano de las partículas es grande, entonces durante la misma incubación tiene lugar una separación lenta de las partículas del líquido. En especial cuando las partículas son ferromagnéticas, se forman agregados. para el caso preferido de que las partículas ferromagnéticas no se hayan magnetizado previamente, se asegura una separación en condiciones especialmente suaves.

La inmovilización tiene lugar con preferencia sin la precipitación que resulta de reducir la solubilidad de los ácidos nucleicos inmovilizados. En su lugar, la inmovilización puede basarse en interacciones bioespecíficas (moléculas capturadoras) o en la adsorción. Esto evita en gran manera la inclusión inespecífica de impurezas.

Después de la incubación se realiza separación de los ácidos nucleicos fijados del líquido. Esto se logra en general por separación de los ácidos nucleicos fijados sobre las partículas magnéticas aplicando un campo magnético. Por ejemplo, las partículas magnéticas pueden atraerse hacia la pared del vaso o recipiente en el que se ha haya realizado la incubación. Después puede desecharse el líquido con los componentes de la muestra que no se hayan fijado sobre las partículas magnéticas. Esta eliminación dependerá del tipo de recipiente, en el que se haya realizado la incubación. Las operaciones adecuadas son extracción del líquido con pipeta o por succión.

A continuación, si se desea, pueden purificarse las partículas magnéticas una o varias veces con una solución de lavado. La solución de lavado se elige de tal manera que a ser posible no implique el desprendimiento de los ácidos nucleicos fijados sobre la superficie de las partículas, pero que elimine de la forma más completa posible las impurezas que no interesa aislar. Esta operación se lavado se realiza con preferencia por incubación de la solución de lavado con las partículas, realizándose con preferencia una resuspensión de las partículas, p.ej. por agitación o por aplicación de un campo magnético que no es idéntico con el campo magnético aplicado en primer lugar. La solución de lavado con las impurezas se desecha de la misma manera que la muestra en la operación ya mencionada anteriormente para la fijación de los ácidos nucleicos.

Después de la última operación de lavado puede realizarse un breve secado de las partículas magnéticas con vacío o por evaporación del líquido, aunque también es posible un tratamiento previo con acetona.

Los ácidos nucleicos purificados de este modo, si se desea, pueden separarse de las partículas magnéticas. Esta operación dependerá del tipo de fijación de los ácidos nucleicos sobre las partículas magnéticas. En el caso de los ácidos nucleicos nativos y de las partículas magnéticas recubiertas de vidrio, los ácidos nucleicos pueden separarse de las partículas de la invención mediante un tampón de elución de bajo contenido en sal. Tales tampones son conocidos por el documento DE-3 724 442 y por Analytical Biochemistry 175, 196-201 (1988). Se utilizan como tampones de elución con bajo contenido en sal en particular los tampones que contienen menos de 0,2 moles/litro. En una forma especialmente preferida de ejecución, el tampón de elución es un tampón Tris. En otra forma especialmente preferida, el tampón de elución es agua desmineralizada.

En otra forma de ejecución, el proceso descrito de purificación y aislamiento puede realizarse después de una separación inmunomagnética de células (p.ej. partículas víricas o células procarióticas o eucarióticas) de un líquido corporal o de un tejido. Para ello se incuba p.ej. con agitación la muestra con las partículas magnéticas, sobre las que se halla inmovilizado un anticuerpo contra un antígeno de las células. Tales partículas pueden ser las partículas de la invención o partículas comerciales (p.ej. MACS Microbeads de la empresa Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, RFA). Después de aplicar un campo magnético se efectúan una o varias operaciones de lavado con una solución salina de lavado. Se obtienen partículas, sobre las que están fijadas las células deseadas. Finalmente se resuspenden las células fijadas en un tampón salino. En una forma preferida de ejecución, este tampón salino es una solución salina caotrópica, de tal manera que puedan desprenderse de las células los ácidos nucleicos contenidos en ellas.

Mediante la combinación del aislamiento de células descrito anteriormente con el aislamiento de ácidos nucleicos, también descrito, con preferencia en la forma nativa de estos, sobre las partículas magnéticas de la invención se consigue un procedimiento especialmente ventajoso de aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras que contienen células. Son ventajas de esta forma de ejecución la sencillez (método de un solo tubo), la alta sensibilidad (muy importante en microbiología médica y oncología) y la fácil automatización.

Los ácidos nucleicos aislados como consecuencia del procedimiento de la invención pueden utilizarse seguidamente del modo que se crea conveniente. Por ejemplo, pueden utilizarse como sustrato de diversas reacciones enzimáticas, p.ej. la secuenciación, el marcado radiactivo o no radiactivo, la amplificación de una o de varias secuencias que contienen, la transcripción, la hibridación con ácidos nucleicos sonda marcados, la traducción o la ligación. Una ventaja del procedimiento de la invención consiste en que es muy sencillo separar los ácidos nucleicos del líquido. En el estado de la técnica, para separar las partículas de las impurezas se realiza una centrifugación o bien, en el caso de la fijación del material biológico sobre el filtro de fibras de vidrio, se succiona el líquido a través de este filtro. En tal caso, se trata de una operación que limita e impide procesar grandes lotes de muestras.

Con el procedimiento de la invención es posible una separación más efectiva de los ácidos nucleicos y las impurezas. Según la invención se pueden eliminar en mayor medida sobre todo los inhibidores de determinadas reacciones enzimáticas. En rendimiento en ácidos nucleicos es relativamente alto. No se observa el fraccionamiento de ácidos nucleicos largos. Se utilizan con preferencia partículas que pueden magnetizarse con mayor rapidez.

En la figura 1 se representa esquemáticamente el aislamiento de ácidos nucleicos de una muestra que contiene células.

En la figura 2 se representa la separación de ácidos nucleicos, aislados según la invención en un gel de agarosa.

En la figura 3 se representa la separación de los productos de reacción después del aislamiento de la invención y la amplificación PCR.

En la figura 4 se representa un gel con los resultados del ejemplo 4.

En la figura 1 se representa esquemáticamente el aislamiento de ácidos nucleicos de una muestra que contiene células. La muestra, que contiene células, se trata de forma específica, de tal manera que las células, en las que se pretende detectar los ácidos nucleicos, están presentes en forma adecuada. En el caso de muestras, tomadas por ejemplo de líquidos corporales, esto significa la adición de reactivos, p.ej. para aumentar la fluidez de muestras viscosas, p.ej. muestras de saliva. A la muestra tratada de este modo se le añaden en un recipiente anticuerpos fijados sobre una fase sólida, con preferencia sobre una perla (bead), dichos anticuerpos reconocen las células y se fijan sobre ellas. Como reactivos idóneos para los anticuerpos han dado buenos resultados por ejemplo antígenos situados en la superficie de las células. La especificidad del anticuerpo puede basarse en la especificidad del problema analítico a resolver. Cuando la fase sólida es la pared del recipiente, las células se fijan directamente sobre dicha pared. Cuando la fase sólida es una perla, entonces esta se separa del líquido mediante un proceso idóneo de separación. Tal separación puede realizarse por ejemplo por filtración. En el caso de perlas magnéticas se puede efectuar la separación mediante la aplicación de un campo magnético sobre la pared exterior del recipiente. Las células separadas se lavan con un líquido para eliminar las impurezas, que podrían interferir en la detección, junto con el medio que envuelve a las células. Se utilizan con preferencia aquellas condiciones en las que las células no se sueltan de la fase sólida ni resultan destruidas. A continuación tiene lugar la destrucción de las células, la llamada lisis. Una posibilidad consiste en el tratamiento de las células con sales caotrópicas. Otra posibilidad consiste en la acción de proteinasas y detergentes.

En la forma preferida de ejecución, las partículas magnéticas se añaden a la mezcla de la lisis. Después de un período adecuado de acción, que puede optimizarse mediante la carga de ácidos nucleicos sobre la superficie, se separan las partículas del líquido circundante, que contiene otros componentes celulares que no interesa detectar. Tal separación se efectúa de nuevo con preferencia mediante la aplicación de un campo magnético, aproximando un imán a la pared exterior del recipiente.

Para eliminar las impurezas que puedan quedar eventualmente adheridas se lava con preferencia con un líquido que se elige de tal manera que no suelte de la superficie de vidrio los ácidos nucleicos que se pretende determinar. Para separar los ácidos nucleicos de la superficie de vidrio se añade un tampón llamado de elución, que posee propiedades de reactivo que permiten separar los ácidos nucleicos de la superficie de vidrio. Tales propiedades son en especial condiciones de bajo contenido de sal. En función del tratamiento ulterior que se quiera dar a los ácidos nucleicos, el líquido se separa de las partículas y se somete al tratamiento ulterior. Es preferido realizar esta separación por aplicación de un campo magnético, de modo que las partículas queden separadas.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención con mayor detalle.

Ejemplo 1 Fabricación de las partículas magnéticas

Se emplean 6 soles distintos. La fabricación de los soles se efectúa con arreglo a los esquemas siguientes.

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Sol 1 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 7:3)

La síntesis se efectúa en un matraz de 250 ml de fondo redondo con agitación continua.

: 86,6 ml de ortosilicato de tetraetilo

: + 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro

: + 14,1 ml de HCl 0,15 M

Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después se añaden por goteo

: + 37,8 ml de borato de trimetilo.

A continuación se mantiene el sol a 50ºC durante 2 horas. Seguidamente se realiza la adición de

: + 14,1 ml de HCl 0,15 M.

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Sol 2 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 4:1)

: 100,5 ml de ortosilicato de tetraetilo

: + 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro

: + 16,3 ml de HCl 0,15 M.

Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después se añaden por goteo + 25,6 ml de borato de trimetilo.

: + 16,3 ml de HCl 0,15 M.

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Sol 3 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 85:15)

: 107,8 ml de ortosilicato de tetraetilo

: + 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro

: + 17,5 ml de HCl 0,15 M.

Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después se añaden por goteo + 19,4 ml de borato de trimetilo.

A continuación se mantiene el sol a 50ºC durante 2 horas. Seguidamente se realiza la adición de + 17,5 ml de HCl 0,15 M.

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Sol 4 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 4:1; un 2% molar de P_{2}O_{5})

: 100,5 ml de ortosilicato de tetraetilo

: + 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro

: + 16,3 ml de HCl 0,15 M.

: + 25,6 ml de borato de trimetilo

: + 16,3 ml de HCl 0,15 M

: + 1,63 g de P_{2}O_{5}.

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Sol 5 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 4:1; un % molar de Al_{2}O_{3})

: 100,5 ml de ortosilicato de tetraetilo

: + 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro

: + 16,3 ml de HCl 0,15 M.

: + 25,6 ml de borato de trimetilo.

: + 16,3 ml de HCl 0,15 M

: + 3,06 g de AlCl_{3}.

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Sol 6 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 4:1; un 1% molar de ZrO_{2})

: 100,5 ml de ortosilicato de tetraetilo

: + 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro

: + 16,3 ml de HCl 0,15 M.

: + 25,6 ml de borato de trimetilo

: + 5,15 ml de propilato de circonio (IV), solución al 70% en peso en 1-propanol.

: + 16,3 ml de HCl 0,15 M.

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Pasadas 2 horas a 50ºC, en cada caso a 150 ml de los distintos soles se les incorpora con agitación 22,5 g de Iriodin 600 (mica negra) y después se recubren con un secador de atomización (Büchi 190, Mini Spray Dryer). La temperatura de la boquilla del secador de atomización es de 134ºC.

El polvo obtenido en el proceso de secado de atomización se somete a continuación a un tratamiento térmico en atmósfera de nitrógeno (90 l/h). La velocidad de calentamiento es de 1ºK/min y el tiempo de permanencia a la temperatura de compactación es de 2 horas. En el caso del recubrimiento efectuado con el sol 1, esta temperatura es de 750ºC, en el recubrimiento con el sol 2 es de 860ºC, en los demás recubrimientos es de 800ºC. Después del proceso de sinterización se apaga el horno y se enfría el polvo a temperatura ambiente. Los aglomerados que se hayan formado de modo eventual se separan mediante un tamiz de 50 \mum.

Ejemplo 2 Fabricación de partículas magnéticas recubiertas con vidrio GMP1, GMP2, GMP3 y GMP4

Las partículas GMP1, GMP2, GMP3 y GMP4 son pigmentos de los distintos lotes de fabricación, que se obtienen a partir del sol 1 del ejemplo 1 en un proceso según el ejemplo 1 en las condiciones siguientes:

2

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Ejemplo 3 Preparación de muestras PCR de sangre humana total con partículas magnéticas recubiertas de vidrio Aislamiento del ácido nucleico

De tres lotes de partículas magnéticas recubiertas de vidrio (GMP2-4) se depositan en cada caso 10 mg en reactores Eppendorf. Las pesadas exactas se indican en la tabla 1, se efectúan determinaciones por triplicado.

En cada caso por 200 \mul de sangre total descongelada se pipetean 40 \mul de proteinasa K (20 mg/ml, fabricada a partir de liofilizado) y se mezclan de inmediato. A continuación se añaden 200 \mul de tampón de fijación (6 M de guanidina-HCl, 10 mM de Tris-HCl, 10 mM de urea, 30% de Triton X-100, pH 4,4), se mezclan y se incuban a 70ºC durante 10 minutos. Se añaden 200 \mul de isopropanol, se mezclan durante 10 segundos en mezcladora Vortex, se incuba la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos y se vuelve a mezclar durante 10 segundos como antes. La separación con el imán se efectúa por lo menos durante 30 segundos en el separador de partículas magnéticas de Boehringer Mannheim (nº ident. = 1 641 794). Se retira el líquido sobrenadante y se analiza del modo descrito posteriormente.

Las partículas magnéticas se mezclan en cada caso con 500 \mul de tampón de lavado (20 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 (25ºC), 80% de etanol) durante 10 segundos, se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto, se mezclan durante 10 segundos y se atraen hacia la pared del reactor con un separador de partículas magnéticas. Se retira el líquido sobrenadante y se desecha. Se repite el proceso de lavado hasta que el líquido sobrenadante del lavado sea incoloro (en total 4 lavados). A continuación se mezclan los ácidos nucleicos 3 veces con 200 \mul cada vez de tampón de elución (10 mM de Tris-HCl, pH 8,5) precalentado a 70ºC durante 10 segundos, se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos, se mezclan durante 10 minutos y se eluyen.

Purificación del sobrenadante

Después de la 1ª fijación sobre las partículas magnéticas recubiertas de vidrio se comprueba el contenido de ácidos nucleicos que tiene el líquido sobrenadante: se introduce este líquido en un tubo-filtro (Boehringer Mannheim, Id.- Nr. 1744003, p.ej. el contenido en un kit "High Pure" de PCR-Product-Purification) y se centrifuga en una centrífuga Eppendorf de sobremesa a 8000 rpm durante 1 minuto. Se desecha el líquido que atraviesa el filtro y se lava el tubo-filtro 2 veces con 500 \mul de tampón de lavado (la centrifugación se realiza del modo recién indicado). Se seca brevemente el tubo-filtro, se centrifuga y después se eluye 2 veces con 200 \mul de 1 tampón de elución precalentado a 70ºC mediante una nueva centrifugación.

Análisis de los líquidos eluidos y del sobrenadante de la muestra

A 50 \mul de los eluidos o bien de los sobrenadantes purificados mediante el tubo-filtro se les añaden 10 \mul de tampón de muestra y de ellos se separan 45 \mul por electroforesis a 120 V durante 90 minutos a través de gel de agarosa del 0,8%.

Se determinan espectroscópicamente diversas diluciones de los eluidos o de los sobrenadantes purificados entre 260 y 280 nm en un aparato Uvikon 710 (Kontron).

Dos partes alícuotas de 5 \mul de los eluidos se someten a una determinación doble con el Expand^{TM} Long Template PCR (Boehringer Mannheim, nº ident. = 1681834) con cebadores específicos del gen tPA humano (longitud esperada del producto: 15 kb).

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4

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Se deposita la mezcla I en un tubo PCR de pared delgada, se le añaden 5 \mul de eluido y se añade la mezcla II. Se mezcla la partida brevemente y se recubre con 30 \mul de aceite mineral. Se amplifican las partidas en un Thermocycler 9600 de Perkin-Elmer con el programa siguiente:

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5

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Los 50 \mul de partidas PCR se tratan con 10 \mul de tampón de muestra y de ellos se separan 45 \mul por electroforesis a 120 V durante 90 minutos en un gel de agarosa del 0,8%.

Resultados TABLA 1 Rendimiento en ácidos nucleicos con partículas magnéticas recubiertas de vidrio a partir de 200 \mul de sangre

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7

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Los primeros líquidos eluidos tienen todavía un color ligeramente amarillo y en algunos casos están contaminados con finas partículas magnéticas.

El análisis de los eluidos en gel de agarosa (figura 2) presenta una buena reproducibilidad del rendimiento. Las partículas magnéticas GMP/2-4 no presentan diferencias importantes. En los eluidos 1 (arriba) y 2 (abajo) existe aproximadamente la misma concentración de ácidos nucleicos (estimada a partir del gel). El eluido 3 presenta una concentración baja en ácidos nucleicos. En los sobrenadantes se observa también una concentración baja en ácidos nucleicos.

La Expand^{TM} PCR proporciona con todas las pruebas, salvo unos pocos casos aberrantes (tabla 2), productos de amplificación siempre buenos y específicos. Con las perlas de vidrio (glasbeads) magnéticas se aislaron ácidos nucleicos a partir de muestras de sangre humana, que en una PCR (polymerase chain reaction) permitieron obtener amplificados específicos.

TABLA 2 Resultados con la Expand^{TM} PCR

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En la figura 3 se presenta un gel con los productos de reacción después de una amplificación PCR. El MWM III es un marcador de peso molecular (eluido 1, arriba; eluido 2, abajo).

Ejemplo 4 Fijación de DNA de longitud estándar sobre partículas magnéticas recubiertas de vidrio 1. Preparación de las partículas magnéticas recubiertas con vidrio

Del lote de partículas magnéticas recubiertas con vidrio GMP4 se depositan 12 mg en un reactor Eppendorf.

2. Lisis y fijación

En un recipiente Eppendorf de 1,5 ml con 12 mg de partículas magnéticas recubiertas de vidrio se mezclan durante un tiempo de 2 a 10 segundos 900 \mul de tampón de lisis (4,6 M de GuSCN, 45 mM de Tris, 20 mM de EDTA, pH 7,3) y 100 \mul de muestra de DNA, en la que se ha utilizado como modelo un DNA de longitud estándar III de Boehringer Mannheim (nº de catálogo: 528552), hasta obtener una suspensión homogénea. Se incuba la solución a temperatura ambiente durante 20 min, efectuando un mezclado cada 5 min.

La separación magnética se lleva a cabo por lo menos durante 15 segundos en un separador de partículas magnéticas. Se retira el sobrenadante con pipeta.

3. Lavado y secado

Se lavan las partículas magnéticas recubiertas de vidrio dos veces con tampón de lavado (5,2 M de GuSCN, 50 mM de Tris, pH 6,5), dos veces con etanol del 70% preenfriado y una vez con acetona, para ello se aparta el campo magnético, se añaden con pipeta 800 \mul de solución, se mezcla durante 2 segundos, se incuba a T.A. durante 1 min, se aplica el campo magnético y se retira finalmente el sobrenadante con pipeta.

Una vez eliminada la acetona se secan las partículas a 56ºC durante 10 min en un bloque calefactor con la tapa abierta.

4. Elución del DNA

Se eluye el DNA con 4 x 50 \mul de tampón de elución (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0), para ello se incuba a 56ºC durante 10 min agitando varias veces y finalmente se transfiere el sobrenadante que contiene el DNA a un nuevo recipiente Eppendorf.

5. Análisis de los eluidos

Se trata una quinta parte del volumen del eluido con tampón de muestra y se separa el DNA con un gel de agarosa del 1% con una tensión de 90 V. Para determinar la recuperación (recovery) se aplica una serie de diluciones del DNA de longitud estándar III sobre el mismo gel, que contiene las cantidades de DNA que se esperan en las muestras.

La evaluación cuantitativa se efectúa por escaneo de una fotografía Polaroid del gel de agarosa. Para ello se emplea como calibrador la serie de diluciones del estándar.

El rendimiento en DNA con partículas magnéticas recubiertas de vidrio se recoge en la tabla 1.

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TABLA 1 Rendimiento en DNA de longitud estándar III con partículas magnéticas recubiertas de vidrio

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El gel de agarosa, que se emplea como base de la evaluación cuantitativa, se representa en la figura 4. Es un gel de agarosa coloreado con bromuro de etidio al 1%. Las pistas de 1 a 10 corresponden a una serie de diluciones del DNA de longitud estándar III. 1: 1 \mug de DNA, 2: 200 ng de DNA, 3: 175 ng de DNA, 4: 150 ng de DNA, 5: 125 ng de DNA, 6: 100 ng de DNA, 7: 75 ng de DNA, 8: 50 ng de DNA, 9: 25 ng de DNA, 10: 10 ng de DNA.

Las pistas 11 y 12 corresponden al DNA eluido de las partículas magnéticas recubiertas de vidrio utilizando 200 ng de DNA de longitud estándar.

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<110> Roche Diagnostics GmbH

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<120> Pigmento magnético

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<130> 28921PEP-WO_WWHC

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<140>

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<141>

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<150> DE1952098.4

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<151> 1995-06-08

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<150> DE19537985.3

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<151> 1995-10-12

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<150> EP96921935.1

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<151> 1996-06-06

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<160> 2

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<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligodesoxirribonucleótido

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

actgtgcttc ttgacccatg gcagaagcgc cttc

\hfill

34

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<210> 2

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligodesoxirribonucleótido

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccttcactgt ctgcctaact ccttcgtgtg ttcc

\hfill

34

Claims

1. Procedimiento para la reacción enzimática de ácidos nucleicos, en el que los ácidos nucleicos de una muestra, que contiene los ácidos nucleicos en un líquido, se aíslan por adsorción en forma nativa sobre partículas magnéticas de superficie de vidrio y a continuación se utilizan como sustrato de una reacción enzimática.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que consta de los pasos:

(a) la adsorción de los ácidos nucleicos de una muestra, que contiene los ácidos nucleicos en un líquido, sobre partículas magnéticas de superficie de vidrio en condiciones en las que puede realizarse la fijación de los ácidos nucleicos en forma nativa directamente sobre dicha superficie,

(b) la separación de los ácidos nucleicos fijados del líquido posterior purificación con una solución de lavado,

(c) eventualmente el secado,

(d) la elución con un tampón de elución y

(e) el uso de los ácidos nucleicos eluidos como sustrato en una reacción enzimática.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los ácidos nucleicos son el DNA o el RNA.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque con el aislamiento se eliminan inhibidores de las reacciones enzimáticas.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque con el aislamiento no tiene lugar ningún fraccionamiento de los ácidos nucleicos largos.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque las partículas magnéticas tienen un tamaño medio de grano inferior a 100 \mum.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizado porque las partículas magnéticas tienen un núcleo interior, p.ej. de un material mixto o un núcleo de hierro, sobre el cual se deposita una superficie exterior de vidrio.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el núcleo tiene una estructura cristalina, cerámica o vítrea, en la cual se aloja el óxido de hierro.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 ú 8, caracterizado porque el núcleo es de magnetita (Fe_{3}O_{4}) o de Fe_{2}O_{3}.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 9, caracterizado porque las partículas magnéticas son ferromagnéticas.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 10, caracterizado porque el aislamiento de los ácidos nucleicos tiene lugar en presencia de sales caotrópicas.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque la concentración de sales caotrópicas se sitúa en 2-8 moles/l, con preferencia en 4-6 moles/l.

13. Procedimiento según la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque las sales caotrópicas se eligen entre yoduro sódico, perclorato sódico, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio y clorhidrato de guani-
dinio.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 13, caracterizado porque se mezcla la muestra con las partículas magnéticas y se incuba durante un tiempo suficiente para la fijación, comprendido con preferencia entre 10 segundos y 30 minutos.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la separación de los ácidos nucleicos del líquido después de la incubación se realiza mediante un campo magnético.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 15, caracterizado porque las partículas magnéticas se purifican una o varias veces con una solución de lavado.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque después del último paso de lavado se efectúa un paso de secado, eventualmente con un tratamiento previo con acetona.

18. Procedimiento según la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque los ácidos nucleicos purificados se eluyen de las partículas magnéticas, con preferencia con el tampón de elución con un bajo contenido de sal, con preferencia especial con un contenido de sal inferior a 0,2 moles/l.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el tampón de elución contiene Tris o es agua desmineralizada.

20. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 19, caracterizado porque como reacción enzimática se realiza una secuenciación, un marcado radiactivo o no radiactivo, una amplificación de una o varias secuencias, una transcripción, una hibridación con ácidos nucleicos sonda marcados, una traducción o una ligación.

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 20, caracterizado porque se realiza en forma de procedimiento de un solo tubo.

22. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 21, caracterizado porque se realiza de forma automatizada.

23. Uso de ácidos nucleicos como sustrato en una reacción enzimática, caracterizado porque los ácidos nucleicos se han aislado en forma nativa de una muestra por adsorción sobre partículas magnéticas de superficie de vidrio.

24. Uso según la reivindicación 23, caracterizado porque los ácidos nucleicos se han transferido de una solución de alta concentración de sal a una solución de baja concentración de sal.

25. Uso según la reivindicación 23 y 24, caracterizado porque los ácidos nucleicos se han concentrado.