ES2247236T3 - Pigmento magnetico. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para aislar ácidos nucleicos mediante - la puesta en contacto de una muestra, que contiene los ácidos nucleicos en un líquido, con partículas magnéticas que tienen una superficie de material amorfo que contiene silicio, en presencia de sales caotrópicas, en unas condiciones en las que los ácidos nucleicos en forma nativa puedan fijarse directamente sobre la superficie y - la separación de los ácidos nucleicos fijados del líquido.
Description
Pigmento magnético.
Es objeto de la presente invención un
procedimiento de purificación de ácidos nucleicos empleando
partículas con una superficie de material amorfo que contiene
silicio en presencia de sales caotrópicas.
Muchos materiales biológicos, en especial los
ácidos nucleicos, plantean exigencias especiales sobre todo en lo
que respecta a su aislamiento del entorno natural. Por un lado están
presentes a menudo en concentraciones muy bajas y por otro lado se
hallan a menudo rodeados de muchas otras sustancias, sólidas o
disueltas, que dificultan tanto su aislamiento como su
determinación.
En los últimos tiempos no han faltado intentos ni
propuestas de procedimientos y materiales para aislar ácidos
nucleicos de su entorno natural. En Proc. Natl. Acad. USA 76,
615-619 (1979) se describe la fijación de ácidos
nucleicos de geles de agarosa en presencia de yoduro sódico en
vidrio flint molido.
En Anal. Biochem. 121,
382-387 (1982) se describe la purificación de DNA de
plásmido de bacterias con vidrio en polvo en presencia de perclorato
sódico.
En el documento
DE-A-37 34 442 se describe el
aislamiento de DNA de fagos M13 monohebra en filtros de fibras de
vidrio por precipitación de las partículas de fago mediante ácido
acético y lisis de las partículas de fago con perclorato. Los ácidos
nucleicos fijados sobre el filtro de fibras de vidrio se lavan con
un tampón metanólico y se eluyen en tampón Tris/EDTA.
En Anal. Biochem. 175,
196-201 (1988) se describe un procedimiento similar
para la purificación de DNA de fagos lambda.
Los procedimientos mencionados del estado de la
técnica tienen en común la fijación selectiva de ácidos nucleicos
sobre superficies de vidrio en soluciones salinas caotrópicas, con
lo cual se separa el ácido nucleico de impurezas como puedan ser la
agarosa, las proteínas o fragmentos celulares. Para separar las
partículas de vidrio de las impurezas según el estado de la técnica
se aplica ya sea la centrifugación de las partículas, ya sea la
succión de líquidos a través de filtros de fibras de vidrio. En
cualquier caso es una etapa limitadora que impide en gran manera
procesar números elevados de muestras.
En Anal. Biochem. 201,
166-169 (1992) o en el documento PCT GB 91/00212 se
describe el uso de partículas magnéticas para inmovilizar ácidos
nucleicos después de la precipitación por adición de sal y etanol.
En este caso tiene lugar una aglutinación de los ácidos nucleicos,
con inclusión de las partículas magnéticas. El material aglutinado
se separa de los disolventes iniciales por aplicación de un campo
magnético y por lavado. Después de una operación de lavado se
disuelven los ácidos nucleicos en un tampón Tris. Sin embargo, este
procedimiento tiene el inconveniente de que la precipitación no es
selectiva para los ácidos nucleicos, sino que en se aglutinan
simultáneamente una gran cantidad de sustancias sólidas y disueltas.
Por lo tanto, con este procedimiento no se pueden eliminar de forma
suficiente los inhibidores, eventualmente presentes, de determinadas
reacciones enzimáticas.
En el documento
US-A-4 233 169 se describe un vidrio
poroso que lleva incorporadas partículas magnéticas.
En el mercado existe actualmente un vidrio poroso
de tipo magnético, que contiene partículas magnéticas dentro de una
estructura o matriz porosa, formada por partículas y su superficie
exterior está recubierta con una capa que contiene estreptavidina.
Este producto puede utilizarse para el aislamiento de materiales
biológicos, por ejemplo proteínas o ácidos nucleicos, en el supuesto
de que estos se hayan modificado en una laboriosa etapa previa de
preparación, de tal manera que estén unidos con la biotina mediante
un enlace covalente.
El objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un procedimiento sencillo e idóneo para el diagnóstico
rutinario, destinado a aislar ácidos nucleicos.
Es objeto de la invención el aislamiento de ácido
nucleicos mediante el uso de las partículas magnéticas provistas de
una superficie exterior de vidrio, en presencia de sales
caotrópicas.
Los expertos entienden por partículas aquellos
materiales sólidos que tienen un diámetro pequeño. Algunas veces,
estas partículas se denominan también pigmentos. En el sentido de la
presente invención son especialmente idóneas aquellas partículas que
tienen un tamaño de grano medio inferior a 100 \mum. Son
preferidas en especial las que tienen un tamaño de grano medio
comprendido entre 10 y 60 \mum. La distribución de tamaños de
partículas es con preferencia relativamente homogénea, en especial
prácticamente no existen partículas inferiores a 10 \mum ni
superiores a
60 \mum.
60 \mum.
Se denominan magnéticos aquellos materiales que
pueden atraerse con un imán, es decir, los materiales
ferromagnéticos o los superparamagnéticos. Se entiende también por
materiales magnéticos aquellos que se denominan materiales
magnéticos blandos, p.ej. las ferritas. Son especialmente preferidos
en el sentido de la invención los materiales ferromagnéticos, en
especial cuando todavía no se han premagnetizado. En este contexto,
se entiende por premagnetización la puesta en contacto con un imán,
con lo cual se aumenta la remanencia. Son especialmente preferidos
los materiales ferromagnéticos tales como p.ej. la magnetita
(Fe_{3}O_{4}) o el Fe_{2}O_{3}.
Se entiende por superficie exterior de una
partícula la superficie coherente y continua desde la cual pueden
trazarse perpendiculares en dirección al entorno de la partícula,
que no llegan a cortar la partícula propiamente dicha.
Se entiende por poro una cavidad vaciada en la
superficie exterior de la partícula, en la que la superficie penetra
en la superficie hasta el punto que una perpendicular trazada de
forma ideal en la cavidad de la superficie en dirección al entorno
próximo de la partícula corta dicha partícula por lo menos 1 vez.
Además, los poros penetran en la partícula hasta una profundidad
mayor que un radio de poro.
Se entiende por vidrio en el sentido de la
presente invención un material amorfo provisto de silicio. El vidrio
puede contener otros materiales, p.ej.
- B_{2}O_{3}
- (0-30%),
- Al_{2}O_{3}
- (0-20%),
- CaO
- (0-20%),
- BaO
- (0-10%),
- K_{2}O
- (0-20%),
- Na_{2}O
- (0-20%),
- MgO
- (0-18%),
- Pb_{2}O_{3}
- (0-15%).
En menor cantidad, del 0 al 5%, pueden estar
presentes además un gran número de otros óxidos, p.ej.
Mn_{2}O_{3}, TiO_{2}, As_{2}O_{3}, Fe_{2}O_{3}, CuO,
CoO, etc. Han dado resultados especialmente buenos los superficies
que tienen una composición de vidrio de borosilicato, de vidrio
flint o de sílice. Desde el punto de vista de rendimiento en ácidos
nucleicos, los vidrios de borosilicato especialmente adecuados
tienen un contenido en óxido de boro de más del 25%; se ha
reconocido como especialmente valioso un vidrio de composición
SiO_{2}/B_{2}O_{3} 70/30. En el sentido de la invención son
especialmente idóneos los vidrios obtenidos por el proceso llamado
sol-gel y posterior secado y compactación de la capa
formada. Este proceso en sus líneas generales ya es conocido y se ha
descrito p.ej. en C.J. Brinker, G.W. Scherer "Sol Gel science -
The physics and chemistry of Sol Gel Processing", Academic Press
Inc. 1990 y "Sol-Gel Optics, Processing and
Applications" de Lisa C. Klein, Ed. Kluwer Academic Publishers
1994, página 450 y sig. así como en
DE-A-1 941 191,
DE-A-3 719 339,
DE-A-4 117 041 y
DE-A-4 217 432. Sin embargo, tal
proceso no se ha descrito hasta el presente para partículas
magnéticas. No era de esperar que con ello puedan obtenerse
partículas magnéticas que poseen propiedades muy sorprendentes en el
aislamiento de ácidos nucleicos. En el proceso
sol-gel se depositan alcóxidos de los componentes
que forman la estructura, p.ej. SiO_{2}, B_{2}O_{3},
Al_{2}O_{3}, TiO_{2}, ZrO_{2}, GeO_{2}, junto con óxidos y
sales de otros componentes, p.ej. en solución alcohólica y se
hidrolizan. En la ecuación se representa la obtención de un vidrio
de silicato de sodioboroaluminio.
Con la adición de agua se pone en marcha el
proceso de hidrólisis de los componentes iniciales. La reacción
transcurre de forma relativamente rápida, porque los iones alcalinos
actúan catalíticamente sobre la velocidad de hidrólisis del éster
del ácido silícico. Una vez finalizada la formación del gel, este
puede secarse y compactarse mediante un proceso térmico para obtener
un vidrio.
La proporción ponderal entre sol y pigmento
tienen una gran influencia en el rendimiento del pigmento magnético.
Los límites derivan de que la porción de pigmento ha de ser pequeña
para que la masa formada pueda bombearse o proyectarse por
atomización. Si la porción de pigmento es demasiado pequeña,
entonces la porción de finos, p.ej. de material no magnético,
resulta demasiado grande y molesta. Las proporciones ponderales
idóneas, teniendo en cuenta el rendimiento de pigmento, se sitúan
entre 10 y 25 g de pigmento por cada 100 ml de sol.
Para obtener un polvo se proyecta la suspensión
con preferencia a través de una boquilla atomizadora y el aerosol se
seca en su recorrido de caída. La boquilla está con preferencia
calentada, con el fin de acelerar el secado de la suspensión. En
función de la geometría de la boquilla, la temperatura de la misma
se sitúa con preferencia entre 120 y 200ºC. Se puede lograr un
compromiso mediante una velocidad suficiente de evaporación, pero
conviene evitar las salpicaduras.
En lo referente al rendimiento, la temperatura de
compactación debería elegirse lo más alta posible. Pero si es
demasiado alta, las partículas se apelmazan entre sí, formándose
aglomerados que tienen que separarse por tamizado. El tratamiento
posterior en el aire, cuando las temperaturas son demasiado altas,
conduce a una pérdida de propiedades magnéticas, por lo cual deberán
evitarse las temperaturas demasiado altas.
Para el procedimiento de la invención pueden
utilizarse partículas magnéticas con una superficie exterior de
vidrio, esencialmente exenta de poros (ver pág. 4, renglones
18-21).
Se entiende por una superficie fundamentalmente
sin poros aquella superficie que está sembrada con menos del 5%, con
preferencia con menos del 2%, con preferencia especial con menos del
0,1% de poros de la definición dada anteriormente. Si existen poros,
estos deberán tener con preferencia un diámetro inferior a 10, con
preferencia especial de 1 nm.
En el sentido de la invención pueden utilizarse
también partículas que contienen un núcleo de mica recubierta con
TiO_{2} y partículas de magnetita inmovilizadas sobre el mismo,
pero el material mixto resultante está envuelto por la capa de
vidrio. Tanto el núcleo como las partículas de magnetita son
cristalinos y no porosos. Las zonas de la superficie de la mica, que
no están ocupadas por las partículas de magnetita, está recubiertas
por una capa de vidrio más gruesa que la existente sobre las puntas
de las partículas de magnetita, de modo que resulta una superficie
de vidrio fundamentalmente no porosa.
La no porosidad de las partículas magnéticas se
refiere solamente a la superficie externa, pero no al interior de
las partículas, de modo de las partículas pueden tener un interior
poroso, en el supuesto de que la superficie está envuelta por un
vidrio fundamentalmente no poroso o por una superficie de vidrio que
tiene poros de diámetro inferior a 10 nm.
De modo sorprendente, el procedimiento de la
invención es especialmente ventajoso para aislar ácido nucleicos de
muestras. En especial los ácidos nucleicos, que son largos, no
sufren destrucción alguna o solamente parcial, cuando se inmovilizan
sobre las partículas magnéticas. El material del núcleo es además de
origen natural y, por ello, inocuo desde el punto de vista
ecológico. La fabricación de las partículas es, por otro lado, muy
poco costosa y económicamente favorable.
Es preferido el uso de partículas ferromagnéticas
con superficie de vidrio. En el estado de la técnica se han descrito
partículas superparamagnéticas. Ahora se ha constatado que las
partículas ferromagnéticas, cuando están recubiertas por una
superficie de vidrio, presentan ventajas notables en el aislamiento
de ácidos nucleicos. Mientras las partículas ferromagnéticas no se
hallan expuestas a un campo magnético, sedimentan exclusivamente por
acción de la fuerza de la gravedad. Para reconstruir de forma rápida
y sencilla la suspensión basta con agitarlas. El fenómeno de la
sedimentación sin intervención de un campo magnético transcurre con
preferencia con mayor lentitud que la inmovilización de ácidos
nucleicos en su superficie. Las partículas ferromagnéticas pueden
recogerse de modo sencillo con un imán sobre una zona determinada
del líquido de la muestra, con el fin de separar el líquido de las
partículas y, de este modo, de los ácidos nucleicos
inmovilizado.
La superficie de vidrio de las partículas
ferromagnéticas puede estar exenta de poros o bien tener poros. Por
las razones mencionadas anteriormente es preferido que la superficie
exterior, incluso en el caso de las partículas ferromagnéticas, esté
fundamentalmente libre de poros o que presente poros de diámetro
inferior a 10 nm. Las partículas ferromagnéticas tienen con
preferencia un tamaño de grano comprendido entre 10 y 60 \mum, con
preferencia especial entre 20 y 50 \mum. Se utilizan con
preferencia especial las partículas en las que los poros
eventualmente existentes en la superficie tienen un diámetro
inferior a 10, con preferencia especial de 1 nm. Un ejemplo de
partícula ferromagnética es el material mixto, ya mencionado
anteriormente, de partículas de mica y magnetita, envueltas con una
capa de vidrio.
Es también objeto de la invención un
procedimiento para aislar ácidos nucleicos por la puesta en contacto
de una muestra, que contiene los ácidos nucleicos, p.ej. DNA o
RNA.
En el sentido de la invención se entiende por
muestras por ejemplo las muestras clínicas, tales como la sangre, el
suero, el líquido de enjuague bucal, la orina, el líquido cerebral,
el esputo, las heces, las muestras extraídas por punción y las
muestras de médula ósea. La muestra puede proceder también del
ámbito de la analítica medioambiental, de la analítica alimentaria o
de la investigación de biología molecular, p.ej. de cultivos
bacterianos, de lisados de fagos y de productos de procesos de
amplificación, p.ej. la PCR (= polymerase chain reaction).
Según la invención se utilizan partículas
magnéticas tienen un núcleo interior sobre el que se aplica la
superficie exterior de vidrio. El núcleo puede ser un material
mixto, pero también puede ser un núcleo simple de hierro. El núcleo
puede estar constituido por una estructura cristalina, cerámica o
vítrea, en la que se aloja el óxido de hierro.
Con el procedimiento descrito pueden aislarse
ácidos nucleicos. Se entiende por ácidos nucleicos nativos aquellos
cuya estructura no se ha alterado de modo irreversible con respecto
a los ácidos nucleicos de origen natural. Sin embargo, esto no
excluye la modificación de otros componentes de la muestra. Si
quieren aislarse ácidos nucleicos, entonces estos podrán estar en la
forma nativa, es decir no desnaturalizada, o en forma cortada o
modificada por inserción de grupos reactivos. Por lo tanto, el
término ácidos nucleicos nativos no abarca en particular a los
ácidos nucleicos biotinilados. Son ejemplos de ácidos nucleicos
nativos los DNA de fagos o los ácidos nucleicos celulares de la
sangre.
Los materiales biológicos modificados abarcan
aquellos materiales que no existen en la naturaleza, p.ej. ácidos
nucleicos que se han modificado por inserción de grupos reactivos,
detectables o susceptibles de inmovilización, p.ej. los ácidos
nucleicos biotinilados.
En casos determinados, la muestra puede someterse
al procedimiento de aislamiento de la invención sin tratamiento
previo. Pero en muchos casos, la muestra tendrá que disgregarse
mediante un método idóneo para que libere los ácidos nucleicos que
contiene. Los expertos ya conocen los métodos de disgregación
adecuados de las muestras, que pueden ser de índole química,
enzimática o física. También es posible la combinación de estos
métodos. Cabe mencionar, por ejemplo, la lisis por ultrasonidos,
alta presión o por cizallamiento, por álcalis, detergentes o
soluciones salinas caotrópicas, o por acción de proteinasas o de
lipasas. En lo referente al procedimiento de disgregación para
obtener ácidos nucleicos se remite en especial a Sambrook y col.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y. y a Ausubel y
col., Current Protocols in Molecular Biology, 1987, J. Wiley and
Sons, N.Y.
Aparte de los ácidos nucleicos a aislar, la
muestra puede contener en el líquido otros componentes, p.ej.
fragmentos celulares, proteínas, sales y otros compuestos que no
interesa aislar. Esta muestra, que con preferencia contiene los
ácidos nucleicos en forma nativa, se pone en contacto con las
partículas en unas condiciones, en las que los ácidos nucleicos se
fijan sobre la superficie de dichas partículas. Las condiciones en
principio son conocidas. Se basan en el tipo de enlace con el que
los ácidos nucleicos se fijan sobre la superficie. En el
procedimiento de la presente invención se fijan directamente los
ácidos nucleicos en forma nativa sobre la superficie de vidrio. Por
ello se puede prescindir de modificar los ácidos nucleicos. La
fijación de ácidos nucleicos nativos sobre partículas de vidrio
puede realizarse por métodos similares a los ya conocidos por el
estado de la técnica. La fijación se efectúa con preferencia en
presencia de sales caotrópicas, situándose la concentración de estas
sales entre 2 y 8 moles/litro, con preferencia entre 4 y 6
moles/litro. Son ejemplos de sales caotrópicas el yodito sódico, el
perclorato sódico, el tiocianato de guanidinio o el clorhidrato de
guanidinio, pero no se limitan a estos compuestos.
Para poner la muestra en contacto con las
partículas, se mezcla aquella con estas y se incuban durante un
tiempo suficiente para que se genere el enlace o fijación. El
experto ya conoce el período de incubación normalmente por el
tratamiento con partículas no magnéticas, que se puede optimizar
realizando una determinación de la cantidad de ácidos nucleicos
inmovilizados sobre la superficie en diversos intervalos de tiempo.
Para ello pueden ser convenientes períodos de incubación
comprendidos entre 10 segundos y 30 minutos.
Según el tamaño y la índole de las partículas
magnéticas, durante el mismo período de incubación puede tener lugar
una separación de las partículas del líquido o bien la suspensión
puede mantenerse durante un período de tiempo considerable. Si el
tamaño de grano de las partículas es muy pequeño y dichas partículas
son paramagnéticas, la suspensión se mantendrá durante un largo
período de tiempo. Si el tamaño de grano de las partículas es
grande, entonces durante la misma incubación tiene lugar una
separación lenta de las partículas del líquido. En especial cuando
las partículas son ferromagnéticas, se forman agregados. para el
caso preferido de que las partículas ferromagnéticas no se hayan
magnetizado previamente, se asegura una separación en condiciones
especialmente suaves.
La inmovilización tiene lugar con preferencia sin
la precipitación que resulta de reducir la solubilidad de los ácidos
nucleicos inmovilizados. Es mejor realizar la inmovilización por
adsorción. Esto evita en gran manera la inclusión inespecífica de
impurezas.
Después de la incubación se realiza separación de
los ácidos nucleicos fijados del líquido. Esto se logra en general
por separación de los ácidos nucleicos fijados sobre las partículas
magnéticas aplicando un campo magnético. Por ejemplo, las partículas
magnéticas pueden atraerse hacia la pared del vaso o recipiente en
el que se ha haya realizado la incubación. Después puede desecharse
el líquido con los componentes de la muestra que no se hayan fijado
sobre las partículas magnéticas. Esta eliminación dependerá del tipo
de recipiente, en el que se haya realizado la incubación. Las
operaciones adecuadas son extracción del líquido con pipeta o por
succión.
A continuación, si se desea, pueden purificarse
las partículas magnéticas una o varias veces con una solución de
lavado. La solución de lavado se elige de tal manera que a ser
posible no implique el desprendimiento de los ácidos nucleicos
fijados sobre la superficie de las partículas, pero que elimine de
la forma más completa posible las impurezas que no interesa aislar.
Esta operación se lavado se realiza con preferencia por incubación
de la solución de lavado con las partículas, realizándose con
preferencia una resuspensión de las partículas, p.ej. por agitación
o por aplicación de un campo magnético que no es idéntico con el
campo magnético aplicado en primer lugar. La solución de lavado con
las impurezas se desecha de la misma manera que la muestra en la
operación ya mencionada anteriormente para la fijación de los ácidos
nucleicos.
Después de la última operación de lavado puede
realizarse un breve secado de las partículas magnéticas con vacío o
por evaporación del líquido, aunque también es posible un
tratamiento previo con acetona.
Los ácidos nucleicos purificados de este modo, si
se desea, pueden separarse de las partículas magnéticas. Esta
operación dependerá del tipo de fijación de los ácidos nucleicos
sobre las partículas magnéticas. En el caso de los ácidos nucleicos
nativos y de las partículas magnéticas recubiertas de vidrio, los
ácidos nucleicos pueden separarse de las partículas de la invención
mediante un tampón de elución de bajo contenido en sal. Tales
tampones son conocidos por el documento DE-3 724 442
y por Analytical Biochemistry 175, 196-201
(1988). Se utilizan como tampones de elución con bajo contenido en
sal en particular los tampones que contienen menos de 0,2
moles/litro. En una forma especialmente preferida de ejecución, el
tampón de elución es un tampón Tris. En otra forma especialmente
preferida, el tampón de elución es agua desmineralizada.
En otra forma de ejecución, el proceso descrito
de purificación y aislamiento puede realizarse después de una
separación inmunomagnética de células (p.ej. partículas víricas o
células procarióticas o eucarióticas) de un líquido corporal o de un
tejido. Para ello se incuba p.ej. con agitación la muestra con las
partículas magnéticas, sobre las que se halla inmovilizado un
anticuerpo contra un antígeno de las células. Tales partículas
pueden ser las partículas de la invención o partículas comerciales
(p.ej. MACS Microbeads de la empresa Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch
Gladbach, RFA). Después de aplicar un campo magnético se efectúan
una o varias operaciones de lavado con una solución salina de
lavado. Se obtienen partículas, sobre las que están fijadas las
células deseadas. Finalmente se resuspenden las células fijadas en
un tampón salino. En una forma preferida de ejecución, este tampón
salino es una solución salina caotrópica, de tal manera que puedan
desprenderse de las células los ácidos nucleicos contenidos en
ellas.
Mediante la combinación del aislamiento de
células descrito anteriormente con el aislamiento de ácidos
nucleicos, también descrito, con preferencia en la forma nativa de
estos, sobre las partículas magnéticas de la invención se consigue
un procedimiento especialmente ventajoso de aislamiento de ácidos
nucleicos a partir de muestras que contienen células. Son ventajas
de esta forma de ejecución la sencillez (método de un solo tubo), la
alta sensibilidad (muy importante en microbiología y oncología
médicas) y la fácil automatización.
Los ácidos nucleicos aislados como consecuencia
del procedimiento de la invención pueden utilizarse seguidamente del
modo que se crea conveniente. Por ejemplo, pueden utilizarse como
sustrato de diversas reacciones enzimáticas, p.ej. la secuenciación,
el marcado radiactivo o no radiactivo, la amplificación de una o de
varias secuencias que contienen, la transcripción, la hibridación
con ácidos nucleicos sonda marcados, la traducción o la ligación.
Una ventaja del procedimiento de la invención consiste en que es muy
sencillo separar los ácidos nucleicos del líquido. En el estado de
la técnica, para separar las partículas de las impurezas se realiza
una centrifugación o bien, en el caso de la fijación del material
biológico sobre el filtro de fibras de vidrio, se succiona el
líquido a través de este filtro. En tal caso, se trata de una
operación que limita e impide procesar grandes lotes de
muestras.
Con el procedimiento de la invención es posible
una separación más efectiva de los ácidos nucleicos y las impurezas.
Según la invención se pueden eliminar en mayor medida sobre todo los
inhibidores de determinadas reacciones enzimáticas. En rendimiento
en ácidos nucleicos es relativamente alto. No se observa el
fraccionamiento de ácidos nucleicos largos. Se utilizan con
preferencia partículas que pueden magnetizarse con mayor
rapidez.
En la figura 1 se representa esquemáticamente el
aislamiento de ácidos nucleicos de una muestra que contiene
células.
En la figura 2 se representa la separación de
ácidos nucleicos, aislados según la invención en un gel de
agarosa.
En la figura 3 se representa la separación de los
productos de reacción después del aislamiento de la invención y la
amplificación PCR.
En la figura 4 se representa un gel con los
resultados del ejemplo 4.
En la figura 1 se representa esquemáticamente el
aislamiento de ácidos nucleicos de una muestra que contiene células.
La muestra (specimen), que contiene células, se trata de forma
específica, de tal manera que las células, en las que se pretende
detectar los ácidos nucleicos, están presentes en forma adecuada. En
el caso de muestras, tomadas por ejemplo de líquidos corporales,
esto significa la adición de reactivos, p.ej. para aumentar la
fluidez de muestras viscosas, p.ej. muestras de saliva. A la muestra
tratada de este modo se le añaden en un recipiente anticuerpos
fijados sobre una fase sólida, con preferencia sobre una perla
(bead), dichos anticuerpos reconocen las células y se fijan sobre
ellas. Como reactivos idóneos para los anticuerpos han dado buenos
resultados por ejemplo antígenos situados en la superficie de las
células. La especificidad del anticuerpo puede basarse en la
especificidad del problema analítico a resolver. Cuando la fase
sólida es la pared del recipiente, las células se fijan directamente
sobre dicha pared. Cuando la fase sólida es una perla, entonces esta
se separa del líquido mediante un proceso idóneo de separación. Tal
separación puede realizarse por ejemplo por filtración. En el caso
de perlas magnéticas se puede efectuar la separación mediante la
aplicación de un campo magnético sobre la pared exterior del
recipiente. Las células separadas se lavan con un líquido para
eliminar las impurezas, que podrían interferir en la detección,
junto con el medio que envuelve a las células. Se utilizan con
preferencia aquellas condiciones en las que las células no se
sueltan de la fase sólida ni resultan destruidas. A continuación
tiene lugar la destrucción de las células, la llamada lisis. Una
posibilidad consiste en el tratamiento de las células con sales
caotrópicas. Otra posibilidad consiste en la acción de proteinasas y
detergentes.
En la forma preferida de ejecución, las
partículas magnéticas se añaden a la mezcla de la lisis. Después de
un período adecuado de acción, que puede optimizarse mediante la
carga de ácidos nucleicos sobre la superficie, se separan las
partículas del líquido circundante, que contiene otros componentes
celulares que no interesa detectar. Tal separación se efectúa de
nuevo con preferencia mediante la aplicación de un campo magnético,
aproximando un imán a la pared exterior del recipiente.
Para eliminar las impurezas que puedan quedar
eventualmente adheridas se lava con preferencia con un líquido que
se elige de tal manera que no suelte de la superficie de vidrio los
ácidos nucleicos que se pretende determinar. Para separar los ácidos
nucleicos de la superficie de vidrio se añade un tampón llamado de
elución, que posee propiedades de reactivo que permiten separar los
ácidos nucleicos de la superficie de vidrio. Tales propiedades son
en especial condiciones de bajo contenido de sal. En función del
tratamiento ulterior que se quiera dar a los ácidos nucleicos, el
líquido se separa de las partículas y se somete al tratamiento
ulterior. Es preferido realizar esta separación por aplicación de un
campo magnético, de modo que las partículas queden separadas.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención con
mayor detalle.
Se emplean 6 soles distintos. La fabricación de
los soles se efectúa con arreglo a los esquemas siguientes.
Sol 1 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 7:3)
La síntesis se efectúa en un matraz de 250 ml de
fondo redondo con agitación continua.
86,6 ml de ortosilicato de tetraetilo
+ 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro
+ 14,1 ml de HCl 0,15 M
Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a
temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después
se añaden por goteo
+ 37,8 ml de borato de trimetilo.
A continuación se mantiene el sol a 50ºC durante
2 horas. Seguidamente se realiza la adición de
+ 14,1 ml de HCl 0,15 M.
Sol 2 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 4:1)
La síntesis se efectúa en un matraz de 250 ml de
fondo redondo con agitación continua.
100,5 ml de ortosilicato de tetraetilo
+ 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro
+ 16,3 ml de HCl 0,15 M.
Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a
temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después
se añaden por goteo + 25,6 ml de borato de trimetilo.
A continuación se mantiene el sol a 50ºC durante
2 horas. Seguidamente se realiza la adición de
+ 16,3 ml de HCl 0,15 M.
Sol 3 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 85:15)
La síntesis se efectúa en un matraz de 250 ml de
fondo redondo con agitación continua.
107,8 ml de ortosilicato de tetraetilo
+ 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro
+ 17,5 ml de HCl 0,15 M.
Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a
temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después
se añaden por goteo + 19,4 ml de borato de trimetilo.
A continuación se mantiene el sol a 50ºC durante
2 horas. Seguidamente se realiza la adición de + 17,5 ml de HCl 0,15
M.
Sol 4 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 4:1; un 2%
molar de P_{2}O_{5})
La síntesis se efectúa en un matraz de 250 ml de
fondo redondo con agitación continua.
100,5 ml de ortosilicato de tetraetilo
+ 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro
+ 16,3 ml de HCl 0,15 M.
Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a
temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después
se añaden por goteo
+ 25,6 ml de borato de trimetilo
A continuación se mantiene el sol a 50ºC durante
2 horas. Seguidamente se realiza la adición de
+ 16,3 ml de HCl 0,15 M
+ 1,63 g de P_{2}O_{5}.
Sol 5 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 4:1; un % molar
de Al_{2}O_{3})
La síntesis se efectúa en un matraz de 250 ml de
fondo redondo con agitación continua.
100,5 ml de ortosilicato de tetraetilo
+ 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro
+ 16,3 ml de HCl 0,15 M.
Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a
temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después
se añaden por goteo
+ 25,6 ml de borato de trimetilo.
A continuación se mantiene el sol a 50ºC durante
2 horas. Seguidamente se realiza la adición de
+ 16,3 ml de HCl 0,15 M
+ 3,06 g de AlCl_{3}.
Sol 6 (SiO_{2}:B_{2}O_{3} = 4:1; un % molar
de ZrO_{2})
La síntesis se efectúa en un matraz de 250 ml de
fondo redondo con agitación continua.
100,5 ml de ortosilicato de tetraetilo
+ 7 ml de etanol no desnaturalizado anhidro
+ 16,3 ml de HCl 0,15 M.
Se forma una mezcla de dos fases, que se agita a
temperatura ambiente hasta que se convierte en monofásica. Después
se añaden por goteo
+ 25,6 ml de borato de trimetilo
+ 5,15 ml de propilato de circonio (IV), solución
al 70% en peso en 1-propanol.
A continuación se mantiene el sol a 50ºC durante
2 horas. Seguidamente se realiza la adición de
+ 16,3 ml de HCl 0,15 M.
Pasadas 2 horas a 50ºC, en cada caso a 150 ml de
los distintos soles se les incorpora con agitación 22,5 g de Iriodin
600 (mica negra) y después se recubren con un secador de atomización
(Büchi 190, Mini Spray Dryer). La temperatura de la boquilla del
secador de atomización es de 134ºC.
El polvo obtenido en el proceso de secado de
atomización se somete a continuación a un tratamiento térmico en
atmósfera de nitrógeno (90 l/h). La velocidad de calentamiento es de
1ºK/min y el tiempo de permanencia a la temperatura de compactación
es de 2 horas. En el caso del recubrimiento efectuado con el sol 1,
esta temperatura es de 750ºC, en el recubrimiento con el sol 2 es de
860ºC, en los demás recubrimientos es de 800ºC. Después del proceso
de sinterización se apaga el horno y se enfría el polvo a
temperatura ambiente. Los aglomerados que se hayan formado de modo
eventual se separan mediante un tamiz de 50 \mum.
Las partículas GMP1, GMP2, GMP3 y GMP4 son
pigmentos de los distintos lotes de fabricación, que se obtienen a
partir del sol 1 del ejemplo 1 en un proceso según el ejemplo 1 en
las condiciones siguientes:
| Parámetro | GMP1 | GMP2 | GMP3 | GMP4 |
| Envejecimiento del sol (h) (30ºC) | 36 | 36 | 36 | 36 |
| Porción pigmentaria del sol (g/100 ml) | 5 | 15 | 8 | 20 |
| Caudal de aire de la boquilla (%) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Presión del aire (bar) | 6 | 6 | 6 | 3 |
| Temperatura de boquilla (ºC) | 135 | 120 | 130 | 143 |
| Temperatura de compactación (ºC) | 534 | 534 | 534 | 615 |
| Tratamiento final con O_{2} (1 hora) | (300ºC) | (300ºC) | (300ºC) | (400ºC) |
| Rendimiento en pigmento | bajo | alto | medio | alto |
| Rendimiento en DNA | bajo | alto | alto | alto |
De tres lotes de partículas magnéticas
recubiertas de vidrio (GMP2-4) se depositan en cada
caso 10 mg en reactores Eppendorf. Las pesadas exactas se indican en
la tabla 1, se efectúan determinaciones por triplicado.
En cada caso por 200 \mul de sangre total
descongelada se pipetean 40 \mul de proteinasa K (20 mg/ml,
fabricada a partir de liofilizado) y se mezclan de inmediato. A
continuación se añaden 200 \mul de tampón de fijación (6 M de
guanidina-HCl, 10 mM de Tris-HCl, 10
mM de urea, 30% de Triton X-100, pH 4,4), se mezclan
y se incuban a 70ºC durante 10 minutos. Se añaden 200 \mul de
isopropanol, se mezclan durante 10 segundos en mezcladora Vortex, se
incuba la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos y se
vuelve a mezclar durante 10 segundos como antes. La separación con
el imán se efectúa por lo menos durante 30 segundos en el separador
de partículas magnéticas de Boehringer Mannheim (Id.-Nr. 1 641 794).
Se retira el líquido sobrenadante y se analiza del modo descrito
posteriormente.
Las partículas magnéticas se mezclan en cada caso
con 500 \mul de tampón de lavado (20 mM de NaCl, 10 mM de
Tris-HCl, pH 7,5 (25ºC), 80% de etanol) durante 10
segundos, se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto, se
mezclan durante 10 segundos y se atraen hacia la pared del reactor
con un separador de partículas magnéticas. Se retira el líquido
sobrenadante y se desecha. Se repite el proceso de lavado hasta que
el líquido sobrenadante del lavado sea incoloro (en total 4
lavados). A continuación se mezclan los ácidos nucleicos 3 veces con
200 \mul cada vez de tampón de elución (10 mM de
Tris-HCl, pH 8,5) precalentado a 70ºC durante 10
segundos, se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos, se
mezclan durante 10 minutos y se eluyen.
Después de la 1ª fijación sobre las partículas
magnéticas recubiertas de vidrio se comprueba el contenido de ácidos
nucleicos que tiene el líquido sobrenadante: se introduce este
líquido en un tubo-filtro (Boehringer Mannheim, Id.-
Nr. 1744003, p.ej. el contenido en un kit "High Pure" de
PCR-Product-Purification) y se
centrifuga en una centrífuga Eppendorf de sobremesa a 8000 rpm
durante 1 minuto. Se desecha el líquido que atraviesa el filtro y se
lava el tubo-filtro 2 veces con 500 \mul de tampón
de lavado (la centrifugación se realiza del modo recién indicado).
Se seca brevemente el tubo-filtro, se centrifuga y
después se eluye 2 veces con 200 \mul de 1 tampón de elución
precalentado a 70ºC mediante una nueva centrifugación.
A 50 \mul de los eluidos o bien de los
sobrenadantes purificados mediante el tubo-filtro se
les añaden 10 \mul de tampón de muestra y de ellos se separan 45
\mul por electroforesis a 120 V durante 90 minutos a través de gel
de agarosa del 0,8%.
Se determinan espectroscópicamente diversas
diluciones de los eluidos o de los sobrenadantes purificados entre
260 y 280 nm en un aparato Uvikon 710 (Kontron).
Dos partes alícuotas de 5 \mul de los eluidos
se someten a una determinación doble con el Expand™ Long Template
PCR (Boehringer Mannheim, Id.-Nr. 1681834) con cebadores específicos
del gen tPA humano (longitud esperada del producto: 15 kb).
| Mezcla I | por partida | Mezcla II | por partida |
| dTNP, en cada caso 100 mM | 1 \mul | tampón Expand™, 10 x | 5 \mul |
| cebador 1, 200 ng/\mul | 1 \mul | polimerasa Expand™ | 0,75 \mul |
| cebador 2, 225 ng/\mul | 1 \mul | H_{2}O bidestilada | 19,25 \mul |
| H_{2}O bidestilada | 17 \mul | ||
| 20 \mul | 25 \mul |
Se deposita la mezcla I en un tubo PCR de pared
delgada, se le añaden 5 \mul de eluido y se añade la mezcla II. Se
mezcla la partida brevemente y se recubre con 30 \mul de aceite
mineral. Se amplifican las partidas en un Thermocycler 9600 de
Perkin-Elmer con el programa siguiente:
| 2 minutos | 92ºC | |
| 10 segundos | 92ºC | |
| 30 segundos | 65ºC | 10 ciclos |
| 12 minutos | 68ºC | |
| 10 segundos | 92ºC | |
| 30 segundos | 65ºC | 20 ciclos |
| 12 minutos + | 68ºC | |
| 20 segundos por ciclo | ||
| 7 minutos | 68ºC | |
| y después | 7ºC |
Los 50 \mul de partidas PCR se tratan con 10
\mul de tampón de muestra y de ellos se separan 45 \mul por
electroforesis a 120 V durante 90 minutos en un gel de agarosa del
0,8%.
\vskip1.000000\baselineskip
| Líquido sobrenadante 1:8 | ||||||
| 260 nm | 280 nm | Rendimiento | 260/280 | |||
| GMP/2 | 12 mg | 1 | 0,021 | 0,013 | 1,7 \mug | 1,6 |
| 10 mg | 2 | 0,045 | 0,035 | 3,7 \mug | 1,3 | |
| 9 mg | 3 | 0,036 | 0,027 | 2,9 \mug | 1,3 | |
| GMP/3 | 10 mg | 1 | 0,050 | 0,042 | 4,0 \mug | 1,2 |
| 10 mg | 2 | 0,033 | 0,022 | 2,6 \mug | 1,5 | |
| 10 mg | 3 | 0,042 | 0,030 | 3,4 \mug | 1,4 | |
| GMP/4 | 10 mg | 1 | 0,065 | 0,056 | 0,7 \mug | 1,2 |
| 11 mg | 2 | 0,071 | 0,142 | 2,4 \mug | 0,5 | |
| 10 mg | 3 | 0,066 | 0,051 | 1,7 \mug | 1,3 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| 1er. líquido eluido 1:8 | ||||||
| 260 nm | 280 nm | Rendimiento | 260/280 | |||
| GMP/2 | 12 mg | 1 | 0,171 | 0,164 | 13,7 \mug | 1,0 |
| 10 mg | 2 | 0,137 | 0,138 | 11,0 \mug | 1,0 | |
| 9 mg | 3 | 0,153 | 0,164 | 12,2 \mug | 0,9 | |
| GMP/3 | 10 mg | 1 | 0,245 | 0,246 | 19,6 \mug | 0,9 |
| 10 mg | 2 | 0,397 | 0,398 | 31,8 \mug | 1,0 | |
| 10 mg | 3 | 0,278 | 0,282 | 22,2 \mug | 0,9 | |
| GMP/4 | 10 mg | 1 | 0,135 | 0,142 | 11,0 \mug | 1,0 |
| 11 mg | 2 | 0,140 | 0,142 | 11,2 \mug | 1,0 | |
| 10 mg | 3 | 0,130 | 0,130 | 10,4 \mug | 1,0 |
| 2º líquido eluido 1:8 | |||||
| 260 nm | 280 nm | Rendimiento | 260/280 | ||
| GMP/2 | 1 | 0,099 | 0,101 | 7,9 \mug | 1,0 |
| 2 | 0,078 | 0,076 | 6,2 \mug | 1,0 | |
| 3 | 0,103 | 0,112 | 8,2 \mug | 0,9 | |
| GMP/3 | 1 | 0,147 | 0,147 | 11,8 \mug | 1,0 |
| 2 | 0,256 | 0,252 | 20,5 \mug | 1,0 | |
| 3 | 0,147 | 0,143 | 11,8 \mug | 1,0 | |
| GMP/4 | 1 | 0,106 | 0,108 | 8,5 \mug | 1,0 |
| 2 | 0,111 | 0,114 | 8,9 \mug | 1,0 | |
| 3 | 0,135 | 0,141 | 10,8 \mug | 1,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| 3er líquido eluido 1:4 | ||||||
| 260 nm | 280 nm | Rendimiento | 260/280 | \sum líquidos eluidos | ||
| GMP/2 | 1 | 0,057 | 0,062 | 2,3 \mug | 0,9 | 23,9 \mug |
| 2 | 0,041 | 0,049 | 1,6 \mug | 0,8 | 18,8 \mug | |
| 3 | falta | |||||
| GMP/3 | 1 | 0,084 | 0,098 | 3,4 \mug | 0,9 | 34,8 \mug |
| 2 | 0,042 | 0,043 | 1,7 \mug | 1,0 | 54,0 \mug | |
| 3 | 0,073 | 0,093 | 2,9 \mug | 0,8 | 36,9 \mug | |
| GMP/4 | 1 | 0,083 | 0,098 | 3,3 \mug | 0,8 | 22,8 \mug |
| 2 | 0,054 | 0,063 | 2,2 \mug | 0,9 | 22,3 \mug | |
| 3 | 0,077 | 0,095 | 3,1 \mug | 0,8 | 24,3 \mug |
Los primeros líquidos eluidos tienen todavía un
color ligeramente amarillo y en algunos casos están contaminados con
finas partículas magnéticas.
El análisis de los eluidos en gel de agarosa
(figura 2) presenta una buena reproducibilidad del rendimiento. Las
partículas magnéticas GMP/2-4 no presentan
diferencias importantes. En los eluidos 1 (arriba) y 2 (abajo)
existe aproximadamente la misma concentración de ácidos nucleicos
(estimada a partir del gel). El eluido 3 presenta una concentración
baja en ácidos nucleicos. En los sobrenadantes se observa también
una concentración baja en ácidos nucleicos.
La Expand™ PCR proporciona con todas las pruebas,
salvo unos pocos casos aberrantes (tabla 2), productos de
amplificación siempre buenos y específicos. Con las perlas de vidrio
(glasbeads) magnéticas se aislaron ácidos nucleicos a partir de
muestras de sangre humana, que en una PCR (polymerase chain
reaction) permitieron obtener amplificados específicos.
| gen tPA humano de 15 kb obtenido con Expand™ PCR | |||||
| 1er líquido eluido | 2º líquido eluido | ||||
| GMP/2 | 1 | falta | + | + | |
| 2 | + | + | + | + | |
| 3 | + | + | falta | ||
| GMP/3 | 1 | + | + | + | + |
| 2 | (+) | + | + | + | |
| 3 | - | (+) | + | + | |
| GMP/4 | 1 | + | + | + | + |
| 2 | + | + | + | (+)* | |
| 3 | + | + | falta | ||
| K, DNA de control BM | |||||
| * 3er líquido eluido |
En la figura 3 se presenta un gel con los
productos de reacción después de una amplificación PCR. El MWM III
es un marcador de peso molecular (eluido 1, arriba; eluido 2,
abajo).
Del lote de partículas magnéticas recubiertas con
vidrio GMP4 se depositan 12 mg en un reactor Eppendorf.
En un recipiente Eppendorf de 1,5 ml con 12 mg de
partículas magnéticas recubiertas de vidrio se mezclan durante un
tiempo de 2 a 10 segundos 900 \mul de tampón de lisis (4,6 M de
GuSCN, 45 mM de Tris, 20 mM de EDTA, pH 7,3) y 100 \mul de muestra
de DNA, en la que se ha utilizado como modelo un DNA de longitud
estándar III de Boehringer Mannheim (nº de catálogo: 528552), hasta
obtener una suspensión homogénea. Se incuba la solución a
temperatura ambiente durante 20 min, efectuando un mezclado cada 5
min.
La separación magnética se lleva a cabo por lo
menos durante 15 segundos en un separador de partículas magnéticas.
Se retira el sobrenadante con pipeta.
Se lavan las partículas magnéticas recubiertas de
vidrio dos veces con tampón de lavado (5,2 M de GuSCN, 50 mM de
Tris, pH 6,5), dos veces con etanol del 70% preenfriado y una vez
con acetona, para ello se aparta el campo magnético, se añaden con
pipeta 800 \mul de solución, se mezcla durante 2 segundos, se
incuba a T.A. durante 1 min, se aplica el campo magnético y se
retira finalmente el sobrenadante con pipeta.
Una vez eliminada la acetona se secan las
partículas a 56ºC durante 10 min en un bloque calefactor con la tapa
abierta.
Se eluye el DNA con 4 x 50 \mul de tampón de
elución (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0),
para ello se incuba a 56ºC durante 10 min agitando varias veces y
finalmente se transfiere el sobrenadante que contiene el DNA a un
nuevo recipiente Eppendorf.
Se trata una quinta parte del volumen del eluido
con tampón de muestra y se separa el DNA con un gel de agarosa del
1% con una tensión de 90 V. Para determinar la recuperación
(recovery) se aplica una serie de diluciones del DNA de longitud
estándar III sobre el mismo gel, que contiene las cantidades de DNA
que se esperan en las muestras.
La evaluación cuantitativa se efectúa por escaneo
de una fotografía Polaroid del gel de agarosa. Para ello se emplea
como calibrador la serie de diluciones del estándar.
El rendimiento en DNA con partículas magnéticas
recubiertas de vidrio se recoge en la tabla 1.
El gel de agarosa, que se emplea como base de la
evaluación cuantitativa, se representa en la figura 4. Es un gel de
agarosa coloreado con bromuro de etidio al 1%. Las pistas de 1 a 10
corresponden a una serie de diluciones del DNA de longitud estándar
III. 1: 1 \mug de DNA, 2: 200 ng de DNA, 3: 175 ng de DNA, 4: 150
ng de DNA, 5: 125 ng de DNA, 6: 100 ng de DNA, 7: 75 ng de DNA, 8:
50 ng de DNA, 9: 25 ng de DNA, 10: 10 ng de DNA.
Las pistas 11 y 12 corresponden al DNA eluido de
las partículas magnéticas recubiertas de vidrio utilizando 200 ng de
DNA de longitud estándar.
<110> Roche Diagnostics GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Pigmento Magnético
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 18242 EP1
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE19520398.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1995-06-08
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 19537985.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1995-19-12
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial
\hskip1cmOligodesoxirribonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgtgcttc ttgacccatg gacagaagcgc cttc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial
\hskip1cmOligodesoxirribonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttcactgt ctgcctaact ccttcgtgtg ttcc
\hfill
Claims (26)
1. Procedimiento para aislar ácidos nucleicos
mediante
- la puesta en contacto de una muestra, que
contiene los ácidos nucleicos en un líquido, con partículas
magnéticas que tienen una superficie de material amorfo que contiene
silicio, en presencia de sales caotrópicas, en unas condiciones en
las que los ácidos nucleicos en forma nativa puedan fijarse
directamente sobre la superficie y
- la separación de los ácidos nucleicos fijados
del líquido.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracerizado porque las partículas presentan un tamaño medio de
grano inferior a 100 \mum.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque las partículas tienen un núcleo interior
de un material magnético, sobre dicho núcleo se coloca o deposita
una superficie exterior.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el material magnético es magnetita
(Fe_{3}O_{4}) o Fe_{2}O_{3}.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque las
partículas magnéticas presentan una superficie de vidrio.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque la superficie
de las partículas magnéticas contiene eventualmente materiales
adicionales.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque los materiales adicionales se eligen
entre:
- B_{2}O_{3}
- (0-30%),
- Al_{2}O_{3}
- (0-20%),
- CaO
- (0-20%),
- BaO
- (0-10%),
- K_{2}O
- (0-20%),
- Na_{2}O
- (0-20%),
- MgO
- (0-18%),
- Pb_{2}O_{3}
- (0-15%).
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque se analiza
una muestra clínica, una muestra procedente del ámbito de la
analítica medioambiental, de la analítica alimentaria o de la
investigación de la biología molecular.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque se analiza una muestra elegida entre
sangre, suero, líquido de enjuague bucal, orina, líquido cerebral,
esputo, heces, líquidos extraídos mediante punciones y muestras de
médula ósea.
10. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque se analiza una muestra de cultivos
bacterianos, de lisados de fagos o de productos de procesos de
amplificación.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 10, caracterizado porque se aísla un
DNA.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 10, caracterizado porque se aísla un
RNA.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 12, caracterizado porque se utiliza
la muestra sin tratamiento previo.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 12, caracterizado porque se disgrega
la muestra por un método adecuado y se liberan los ácidos nucleicos
contenidos en ella.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 14, caracterizado porque la
concentración de las sales caotrópicas se sitúa entre 2 y 8 moles/l,
con preferencia entre 4 y 6 moles/l.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 15, caracterizado porque las sales
caotrópicas se eligen entre yoduro sódico, perclorato sódico,
tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio y clorhidrato
de guanidinio.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 16, caracterizado porque se incuba la
muestra con las partículas durante un período de 10 segundos a 30
minutos.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 17, caracterizado porque la
separación se consigue separando los ácidos nucleicos fijados sobre
las partículas magnéticas mediante la aplicación de un campo
magnético.
19. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 18, caracterizado porque se purifican
las partículas magnéticas una o varias veces con una solución de
lavado.
20. Procedimiento según la reivindicación 19,
caracterizado porque la etapa de lavado comprende una
incubación de la solución de lavado con las partículas, realizándose
una resuspensión de las partículas.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque la resuspensión se efectúa aplicando un
campo magnético no idéntico al primer campo magnético.
22. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 19 a 21, caracterizado porque después de
la última etapa de lavado tiene lugar una etapa de secado.
23. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 22, caracterizado porque los ácidos
nucleicos purificados se separan o apartan de las partículas
magnéticas.
24. Procedimiento según la reivindicación 23,
caracterizado porque se utiliza un tampón de elución con un
contenido de sal inferior a 0,2 moles/l.
25. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 24, caracterizado porque se realiza
en un procedimiento de tubo único (single-tube).
26. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 25, caracterizado porque se realiza
de forma automatizada.
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