MXPA00003007A - Metodo universal de preparacion de muestras el cual puede ser automatizado - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para preparar muestras biológicas para una detección subsiguiente de una substancia que se va a analizar, especialmente de unácido nucléico, en la muestra. La invención también se refiere a la preparación de juegos o conjuntos de reactivos, a dispositivos novedosos para la preparación de la muestras y a menos pigmentos magnéticos. Se proporciona un sistema de control que ahorra energía y que incluye un circuito (20 conmutador de potencia) conmutador de potencia , un circuito (40 detector de corriente) detector de corriente y un circuito (60 de control) de control. El circuito (20 conmutador de potencia) de conmutación de potencia y el circuito (40 detector de corriente) detector de corriente producen voltajes diferentes y señales de corriente medida, respectivamente. El circuito (60 de control) de control transmite una señal de control en respuesta a un incremento en la demanda de corriente por la carga (200).

Description

MÉTODO UNIVERSAL DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS EL CUAL PUEDE SER AUTOMATIZADO Campo de la Invención La invención se refiere a un proceso para preparar muestras biológicas para la detección subsiguiente de una substancia que se va a analizar, en particular un ácido nucleico, en esta muestra. Además se proveen juegos de reactivos y dispositivos novedosos para la preparación de la muestra y nuevos pigmentos magnéticos.

Antecedentes de la Invención La preparación de lá muestra frecuentemente tiene que satisfacer requerimientos especiales en un método para la detección de una substancia que se va a analizar en una muestra biológica. Por una parte, la substancia que se va a analizar está presente frecuentemente a una concentración muy baja y, por otra parte, existen frecuentemente muchas otras substancias en la muestra las cuales pueden interferir con el aislamiento o determinación de la substancia que se va a Ref.033129 analizar. La Patente WO 96/41811 describe un proceso para el aislamiento de una substancia que se va a analizar, especialmente un ácido nucleico, a partir de una muestra biológica en donde la muestra que contiene la substancia que se va a analizar en un liquido se pone en contacto con las partículas magnéticas que tienen una superficie de vidrio externa la cual está esencialmente libre de poros o tiene poros con un diámetro de < 10 nm, bajo las condiciones de tal modo que la substancia que se va a analizar se una a la superficie de la partícula y la substancia que se va a analizar unida se separe del liquido de la muestra. El proceso descrito en WO 96/46811 es muy adecuado para la purificación de un substancia que se va a analizar desde una muestra biológica. Sin embargo, el mismo no puede ser aplicado fácilmente a una preparación de la muestra automatizada. Boom et al. (J. Clin. Microbiol. 28 (1990), 495-503) también describe un protocolo para la purificación de los ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica utilizando partículas de óxido de silicio fraccionadas de acuerdo con el tamaño. Sin embargo, esta proceso es complicado y no puede ser adecuado para la automatización y además existe un riesgo de que existan remanentes.

En un método descrito en EP-A-0 757 106 para la extracción de los ácidos nucleicos, una muestra es usada, los ácidos nucleicos presentes en la muestra son unidos a las partículas metálicas superparamagnéticas, estas son removidas del recipiente de la muestra con una pipeta y separadas asi de los otros componentes de la muestra. Una desventaja de este método es que pueden ocurrir pérdidas debido a la necesidad de tener que remover el substancia que se va a analizar de la muestra con una pipeta. Además existe un riesgo de que existan remanentes y de contaminación debido al uso de varios recipientes de reacción. Por consiguiente el objeto de la presente invención fue el de proporcionar un nuevo proceso de preparación de muestras en el cual las desventajas del estado de la técnica sean eliminadas al menos parcialmente. En particular debe ser posible automatizar el nuevo proceso y tener un perfil de temperatura que sea tan simple como sea posible. Este objeto es logrado por un proceso para el aislamiento de una substancia que se va a analizar a partir de una muestra biológica que comprende los pasos de: (a) Usar la muestra en un recipiente de reacción, (b) agregar una matriz de absorción sólida, (c) incubar bajo condiciones tales que la substancia que se va a analizar se una a la matriz de adsorción, (d) remover los componentes de la muestra no unidos del recipiente de reacción, (e) incubar bajo condiciones tales que la substancia que se va a analizar sea eluida de la matriz de adsorción y (f) separar el eluido de la matriz de adsorción.

Un aspecto adicional de la presente invención es un proceso para el aislamiento de una substancia que se va a analizar a partir de una muestra biológica, que comprende los pasos de: (a) usar la muestra en un recipiente de reacción, (b) agregar una matriz de absorción sólida, (c) incubar bajo condiciones tales que la substancia que se va a analizar se una a la matriz de adsorción, (d) separar los componentes de la muestra no unidos de la matriz de adsorción, (e) incubar bajo condiciones tales que la substancia que se va a analizar sea eluida de la matriz de adsorción y (f) separar el eluido de la matriz de adsorción en donde al menos los pasos (c) y (d) se llevan a cabo esencialmente a la misma temperatura. El proceso de acuerdo con la invención está basado en la unión selectiva de las substancias que se van a analizar a una matriz de adsorción sólida en la presencia de una solución amortiguadora para la lisis de la muestra en la cual la substancia que se va a analizar que es preferentemente un ácido nucleico tal como el ADN por ejemplo el ADN cromosónico, el ADN cromosómico fragmentado, el ADN del plásmido, el ADN viral, etc., o el ARN por ejemplo el ARNm, ARNt, ARNr o el ARN viral, etc., sea separado de las impurezas de la muestra tales como los desechos de las proteínas o las células. La muestra puede ser cualquier muestra biológica por ejemplo un fluido corporal tal como la sangre, el plasma, la orina, etc., una muestra del tejido, una muestra de células cultivadas o semejantes. La matriz de adsorción utilizada en el proceso de acuerdo con la invención es capaz de asegurar la unión substancialmente selectiva de la substancia que se va a analizar bajo las condiciones de la reacción. Una matriz de adsorción particulada es utilizada preferentemente, la cual contiene preferiblemente una superficie de vidrio. Las partículas de vidrio magnéticas son preferidas particularmente, especialmente las partículas magnéticas descritas en WO 96/41811 con una superficie de vidrio externa la cual está esencialmente libre de poros o tiene poros con un diámetro de menos de 10 nm. Las partículas ferro agnéticas son preferidas particularmente, las cuales tienen un tamaño de partícula entre 10 y 60 µm. Tales partículas pueden contener por ejemplo un núcleo hecho de miera y partículas magnéticas inmovilizadas sobre la misma, el cual está encerrado por una capa de vidrio. En vista de que en la patente WO 96/41811 las partículas magnéticas son colocadas en los recipientes de reacción individuales en una forma sólida, por ejemplo como tabletas o un polvo, las partículas magnéticas son utilizadas preferentemente de acuerdo con la invención en la forma de una suspensión. Las suspensiones alcohólicas que tienen una concentración de aproximadamente 5 hasta 20 mg/ml han probado que van a ser adecuadas particularmente. Se encontró sorprendentemente que, a pesar de la alta densidad especifica de las partículas de vidrio magnéticas, la suspensión puede ser extraida muy reproduciblemente de un recipiente de almacenamiento lo cual hace que el proceso sea automatizado. Aunque las partículas de vidrio descritas en WO 96/41811 deron buenos resultados en el proceso de acuerdo con la invención, se obtienen resultados particularmente buenos con las partículas de vidrio cuya fase de vidrio contiene los siguientes óxidos metálicos: Si02, B203, óxidos de metal alcalino por ejemplo K20 y/o Na20 y opcionalmente A1203 y un óxido de metal alcalinotérreo por ejemplo CaO. Los contenidos de estos óxidos metálicos son preferentemente como sigue: 50 hasta 95 % en mol de Si02, 0.2 a 30 % en mol de B203, 0 hasta 10 % en mol de A1203, 0 hasta 20 % en mol de óxido de metal alcalinotérreo y 0.2 hasta 20 % en mol de óxido de metal alcalino en donde los porcentajes están basados cada uno en el peso total de la fase de vidrio. Una fase de vidrio la cual contiene Si02, B203, K20, A1203 y CaO ha probado que va a ser particularmente adecuada para el aislamiento del ARN. Una fase de vidrio la cual contiene Si02, B203 y Na20 ha probado que va a ser particularmente adecuada para el aislamiento del ADN. En el proceso de acuerdo con la invención, la matriz de adsorción es agregada preferentemente en una cantidad la cual corresponde a la cantidad mínima requerida para unir cuantitativamente la substancia que se va a analizar presente en la muestra, en particular un ácido nucleico, o la cantidad es algo más grande, preferentemente cuando mucho del 50% y particularmente de manera preferente cuando mucho del 20 % arriba de esta cantidad. La cantidad esperada del ácido nucleico en varios tipos de las muestras puede ser determinada - si no se conoce ya - previamente por técnicas comunes, por ejemplo extracción con fenol/cloroformo y la medición subsiguiente de la densidad óptica.

El paso (a) del proceso de acuerdo con la invención comprende Usar la muestra en un recipiente de reacción. Esta lisis usualmente se lleva a cabo Usando las células presentes en la muestra bajo condiciones de desnaturalización por ejemplo agregando una proteasa y una solución amortiguadora desnaturalizante. La proteinasa K, la pronasa, la elastasa y/o la lisozima son utilizadas preferentemente como la proteinasa. El uso de la proteinasa K es preferido particularmente. La digestión de la proteasa se lleva a cabo en una solución amortiguadora desnaturalizante la cual contiene un compuesto caotrópico por ejemplo urea o derivados de urea, preferentemente una sal caotrópica, -particularmente de manera preferente una sal de guanidinio tal como el clorhidrato de guanidinio (especialmente para el aislamiento del ADN) o el tiocianato de guanidinio (especialmente para el aislamiento del ARN) o un perclorato o yoduro. Las concentraciones en el intervalo de 1 a 3 moles/1 son preferidas para las sales de guanidinio. En contraste con el método descrito en WO 96/41811 para la preparación de la muestra, la matriz de adsorción sólida es agregada solamente después de la lisis de la muestra. Este procedimiento conduce a una unión no especifica significativamente inferior de los componentes de la muestra indeseables, por ejemplo, proteinas, a la matriz de adsorción. De acuerdo con el paso (c) la substancia que se va a analizar es unida selectivamente a la matriz de adsorción por incubación en la solución amortiguadora para la lisis preferentemente bajo condiciones caotrópicas . El paso (d) del proceso de acuerdo con la invención comprende la separación de los componentes de la muestra no unidos de la matriz de adsorción. Para este propósito los componentes de la muestra no unidos son removidos preferentemente del recipiente de la reacción. Esto se puede lograr agregando y removiendo una solución amortiguadora de lavado, opcionalmente varias veces, la cual contiene preferentemente una cantidad de al menos 50 % (v/v) y particularmente de manera preferente de al menos 60 % (v/v) de un solvente que es miscible con el agua tal como el etanol, propanol y acetona. Los pasos (c), (d) y/o (e) del proceso de acuerdo con la invención se llevan a cabo preferentemente mientras que se mezcla continuamente o a intervalos es decir fases de mezclado alternativas con fases en las cuales el recipiente de la reacción está en reposo) sin agregar medios externos. Este mezclado se lleva a cabo preferentemente haciendo girar el recipiente de la reacción alrededor de su eje longitudinal mientras que se invierte la dirección de rotación varias veces. El recipiente de mezclado es girado de manera preferentemente exactamente alrededor de su eje longitudinal y el cambio en la dirección de rotación se lleva a cabo de tal manera que la deflexión del menisco del liquido permanezca abajo de un valor de corte predeterminado. Tales procesos de mezclado se describen en WO 91/15768 y EP-A-0 435 481. La duración de los pasos (c) y/o (e) es preferentemente de 20 minutos cuando mucho y comprende un mezclado continuo o un mezclado in intervalos de ciclos cortos, preferentemente en ciclos cortos preferentemente de dos minutos como máximo. Se obtienen resultados particularmente buenos por el mezclado en intervalos en un ciclo de un minuto que comprende 20 segundos de mezclado y 40 segundos de reposo. Cuando las partículas magnéticas son utilizadas como una matriz de adsorción es posible agregar líquidos al recipiente de la reacción o aspirar los líquidos desde el recipiente de la reacción mientras que se mezcla continuamente, y los partículas son mantenidas en el recipiente de la reacción durante el proceso de aspiración. Este procedimiento de mezclado permite que el proceso de acuerdo con la invención sea ajustado flexiblemente para adecuarse a varios tipos de la muestra. Además se asegura que exista siempre una distribución homogénea de las partículas magnéticas en la fase líquida. El paso (e) del proceso de conformidad con la invención comprende la elución de la substancia que se va a analizar desde la matriz de adsorción. Un amortiguador con contenido bajo de sales que está esencialmente libre de solventes orgánicos puede ser utilizado para esto como se sabe de la técnica previa. Sin embargo, se encontró sorprendentemente que la solución amortiguadora de elución puede contener reactivos adicionales tales como enzimas por ejemplo las enzimas utilizadas para manipular los ácidos nucleicos tales como las ARNasas, DNasas, endonucleasas de restricción, ligasas, transferasas terminales y/o polimerasas. Si la substancia que se va a analizar es por ejemplo un ADN, es posible agregar una RNasa libre de ADNasa durante la elución para reducir el contenido del ARN indeseable. Por otra parte si la substancia que se va a analizar es el ARN, es posible agregar una DNasa libre de RNasa durante la elución. Otras enzimas tales como las endonucleasas de restricción, etc., pueden ser agregadas de una manera análoga. Si el ácido nucleico es sometido a una amplificación subsiguiente, una mezcla maestra de amplificación del ácido nucleico la cual contiene la solución amortiguadora de amplificación, los nucleótidos, los cebadores, la polimerasa y las sales amortiguadoras también puede ser agregada durante la elución. El paso (f) del proceso de acuerdo con la invención comprende separar el eluido de la matriz de adsorción. Esta separación se puede llevar a cabo de la manera usual por ejemplo por sedimentación, pero preferentemente por separación magnética. Las substancias que se van a analizar aisladas por el proceso de conformidad con la invención pueden ser procesadas subsiguientemente de una manera conocida adicionalmente por ejemplo en el caso de los ácidos nucleicos por amplificación y detección subsiguiente, o detección sin amplificación o secuenciamiento previo. Para este propósito varias substancias que se van a analizar pueden ser determinadas en alícuotas del eluido, por ejemplo varios virus tales como VIH, VCH y VBH. Una característica importante del proceso de acuerdo con la invención es que muchos u opcionalmente aún todos los pasos pueden ser llevados a cabo a esencialmente la misma temperatura, es decir dentro de un intervalo de temperatura de + 2.5 °C. Esta temperatura está preferentemente en el intervalo de temperatura ambiente a 70 °C, particularmente de manera preferente desde la temperatura ambiente hasta 40 °C, aún más preferentemente a temperatura ambiente es decir casi 18 hasta 32 °C. En una modalidad preferida del proceso de acuerdo con la invención al menos los pasos (c) de adsorción y (d) de lavado se llevan a cabo a esta temperatura. Otros pasos, en particular los pasos (a) de lisis y/o (e) de elución son preferentemente llevados a cabo particularmente a esta temperatura. La preparación de la muestra completa puede ser llevada por ejemplo a una temperatura uniforme para la determinación del VIH en las muestras de sangre. Opcionalmente un paso de tratamiento posterior adicional a una temperatura elevada se puede llevar a cabo después del paso (f) del proceso de acuerdo con la invención el cual mejora los rendimientos de amplificación para ciertas substancias que se van a analizar. Puede ser necesario para otras substancias que se van a analizar, llevar a cabo el pretratamiento y/o la elución a una temperatura elevada. En este caso la temperatura elevada está preferentemente en el intervalo de más de 40 °C hasta 95 °C por ejemplo casi 70 °C. El proceso de acuerdo con la invención es llevado a cabo preferentemente en un dispositivo automatizado. Los ejemplos de tales dispositivos se describen en lo siguiente. También es preferible que en el proceso de acuerdo con la invención para la preparación de la muestra al menos los pasos (a) a (e) se lleven a cabo en un solo recipiente de reacción único, es decir que no exista transferencia hacia otro recipiente de la reacción. Esto simplifica considerablemente el proceso y también conduce a la reducción del riesgo de contaminación . Todavía una materia objeto adicional de la invención es un conjunto de reactivos el cual es especialmente adecuado para llevar a cabo el proceso descrito anteriormente que comprende: a) una proteasa, b) una solución amortiguadora para la lisis de la muestra, c) una solución amortiguadora para lavado, d) una solución amortiguadora de elución y e) una suspensión de partículas de vidrio magnéticas.

Una materia objeto todavía adicional de la invención es un conjunto de reactivos para aislar el ADN que comprende partículas de vidrio magnéticas cuya fase de vidrio contiene Si02, B203 y Na20 y un conjunto de reactivos para aislar el ARN que comprende las partículas de vidrio magnéticas cuya fase de vidrio contiene Si02, B203, A1203, CaO y Ka20.

Finalmente otra materia objeto de la presente invención es un dispositivo para aislar una substancia que se va a analizar de una muestra biológica que comprende: un dispositivo para la preparación de la muestra (1), un dispositivo de retención para los reactivos (2), un primer dispositivo de retención para recipientes de reacción para la preparación de la muestra (3) el cual está equipado para una temperatura de operación < 70 °C, en particular < 40 °C, un segundo dispositivo de retención para los recipientes de la reacción (4a, 4b, 4c), el cual contiene opcionalmente un medio de enfriamiento y/o calentamiento, y un dispositivo de herramienta robótica (5) .

El dispositivo de acuerdo con la invención está diseñado preferentemente de tal modo que un recipiente de reacción único sea utilizado para llevar a cabo los 4 pasos principales de la preparación de la muestra, es decir la lisis de una muestra, la adsorción de la muestra que se va a analizar libera por ejemplo un ácido nucleico a una matriz de adsorción sólida, por ejemplo partículas de vidrio magnéticas, lavado de la matriz de adsorción y elución de la substancia que se va a analizar de la matriz de adsorción. El dispositivo está diseñado de tal modo que el primer dispositivo de retención para los recipientes de reacción para la preparación de la muestra, se utilice al menos para la adsorción de la substancia que se va a analizar para la matriz de adsorción sólida y para el lavado de la matriz de adsorción. En una modalidad preferida el primer dispositivo de retención también es utilizado para la lisis de la muestra y/o para la elución de la substancia que se va a analizar de la matriz de adsorción. Los recipientes de la reacción para la preparación de la muestra tienen un volumen preferentemente de al menos 1 mi por ejemplo 1-5 mi. El segundo dispositivo de retención está diseñado para que los recipientes de la reacción almacenen y/o procesen adicionalmente la substancia que se va a analizar por ejemplo los recipientes de PCR los cuales usualmente tienen una forma diferente que los recipientes de la reacción utilizados para la preparación de la muestra. Los recipientes de la reacción para el almacenamiento y/o procesamiento adicional tienen un volumen preferentemente de hasta 500 µl, por ejemplo 50-200 µl. Además, el segundo dispositivo de retención puede contener recipientes para los reactivos los cuales se requiere que procesen la muestra que contiene la substancia que se va a analizar por ejemplo un mezcla maestra de PCR. El dispositivo de acuerdo con la invención puede ser diseñado de tal modo que uno o varios pasos de la preparación de la muestra y/o un paso de tratamiento posterior pueda ser llevado a cabo a una temperatura elevada en el segundo dispositivo de retención. Para este propósito el segundo dispositivo de retención puede ser diseñado para retener los recipientes de la reacción durante al menos un paso de tratamiento el cual se selecciona de la lisis de la muestra, la elución de la muestra de la matriz de adsorción y el paso de tratamiento posterior después de la elución. El primer dispositivo de retención contiene preferentemente un medio para 'la separación magnética. Además, es preferible que el primer dispositivo de retención contenga medios para mezclar los recipientes de la reacción en particular haciéndolos girar alrededor de su eje longitudinal. Tales medios pueden ser provistos opcionalmente para el segundo dispositivo de retención. La herramienta robótica comprende generalmente dispositivos de pipeteo automáticos y opcionalmente medios para transportar los recipientes de la reacción por ejemplo entre los primero y segundos dispositivos de retención. Además una unidad de abertura y cierre de la tapa puede ser integrada. Las modalidades especiales de los dispositivos de la invención son mostradas en detalle en lo siguiente. En la modalidad mostrada en la Figura 1, el dispositivo de preparación de la muestra (1) contiene un dispositivo de retención para los reactivos (2), un dispositivo de retención para los recipientes de la reacción para la preparación de la muestra (3) con las funciones de mezclado y separación magnéticas las cuales proveen una temperatura preferentemente de < 40 °C y particularmente de manera preferible la temperatura ambiente. El dispositivo contiene adicionalmente una estación de retención para los recipientes de la reacción adicionales (4a) por ejemplo para los recipientes de PCR los cuales tienen una temperatura de 4 °C a temperatura ambiente. El dispositivo contiene adicionalmente dispositivos automatizados para pipetear y manipular los recipientes de la reacción (5) los cuales hacen posible el movimiento en una dirección X, Y y Z. En esta modalidad del dispositivo de acuerdo con la invención los cuatro pasos principales de la preparación de la muestra, es decir, la lisis, la adsorción, el lavado y la elución se llevan a cabo en un recipiente de reacción único en el primer dispositivo de retención. Los eluidos son almacenados y los reactivos adicionales por ejemplo la mezcla maestra para PCR son agregados en el segundo dispositivo de retención. Para el procesamiento adicional por ejemplo para una PCR subsiguiente, los recipientes son transferidos a un dispositivo apropiado por ejemplo una máquina termorecicladora (no mostrada) . En la modalidad mostrada en la Figura 2, el dispositivo contiene un segundo dispositivo de retención (4b) el cual está diseñado para retener a los recipientes de la reacción para procesamiento adicional, por ejemplo los recipientes de PCR y está equipado para fijarse a una temperatura de 4 °C (enfriando la mezcla maestra de PCR) a 95 °C para calentar el eluido después de la elución de la matriz de adsorción. Un contracalentamiento de la tapa es preferido para prevenir la condensación sobre la tapa de los recipientes de PCR. La modalidad del dispositivo de conformidad con la invención mostrada en la Figura 3 es provista con un segundo dispositivo de retención para los recipientes de la reacción (4c) el cual está diseñado para retener a los recipientes de PCR y a los recipientes para la preparación de la muestra. En este segundo dispositivo de retención, el calentamiento por ejemplo a 4 °C y el calentamiento por ejemplo a 95 °C es posible para • calentar el lisado y/o el eluido. También en este caso un contracalentamiento de la tapa es provisto para prevenir la condensación sobre la tapa de los recipientes de la reacción. .En una modalidad adicional de la presente invención (no mostrada) el primer dispositivo de retención está diseñado para fijarse a una temperatura en el intervalo de < 70 °C. El segundo dispositivo de retención - como se muestra en la Figura 3 - es adecuado para el enfriamiento y calentamiento de los recipientes de preparación de la muestra y de procesamiento de la muestra. Los dispositivos de acuerdo con la invención pueden ser utilizados en un proceso como se describió anteriormente . La presente solicitud es elucidada adicionalmente con más detalle por las Figuras y ejemplos . La Figura 1 muestra una representación esquemática de una primera modalidad del dispositivo de acuerdo con la invención, la Figura 2 muestra una representación esquemática de una segunda modalidad del dispositivo de conformidad con la invención, la Figura 3 muestra una representación esquemática de una tercera modalidad del dispositivo de acuerdo con la invención, la Figura 4 muestra el resultado de una detección de clamidia por PCR utilizando la preparación de la muestra manual y semiautomática, la Figura 5 muestra el resultado de una detección de la clamidia por PCR utilizando una preparación de la muestra semiautomática y varios perfiles de temperatura durante la preparación de la muestra, la Figura 6 muestra el resultado de una detección de VIH por PCR utilizando una preparación de la muestra manual (protocolo estándar) y una preparación de la muestra semiautomática a temperatura ambiente.

Ejemplos 1. Preparación de las partículas de vidrio magnéticas Dos diferentes soles son utilizados. Los soles fueron preparados como sigue: Sol 1 : ( SiQ2 : B203 : Na20 40 : 8 : 2 ) Los alcoholatos de los óxidos fueron agitados conjuntamente en las relaciones molares anteriores análogamente al procedimiento en los ejemplos 1 y 2 de W096/41811 para formar una fase homogénea. Sin embargo, una desviación fue que no se utilizó HCl. Subsiguientemente 30 g de Mica Negra iriodin 600 (Merk) en 100 mi del sol se agitó dentro de la fase homogénea.

Sol 2: (SiQ2 : B203: K20:A1202 ; CaO=76:15:5:2:2) Los alcoholatos de los óxidos fueron agitados conjuntamente en las relaciones molares anteriores análogamente al procedimiento eh los ejemplos 1 y 2 de W096/41811 para formar una fase homogénea. Sin embargo, una desviación fue que no se utilizó HCl. Subsiguientemente se agitaron en la fase homogénea 30 g de Mica Negra iriodin 600 (Merk) en 100 mi. Los soles fueron sometidos subsiguientemente a un proceso de secado por rociado. El polvo obtenido por el secado por rociado se sometió a una separación de los materiales finos por sedimentación, un tratamiento por temperatura bajo una atmósfera de nitrógeno (velocidad de flujo volumétrica de 60 1/h a una velocidad de calentamiento de 1 K/min y se mantuvo durante una hora a una temperatura de compactación en el intervalo de 600 a 700 °C. Subsiguientemente el horno se enfrió a 300 °C y se limpió con un chorro de oxigeno durante 1 h a esta temperatura. Después de enfriamiento a temperatura ambiente las partículas de vidrio magnéticas fueron removidas y tamizadas a través de un tamiz de 50 µm para separar el material burdo o tosco. Las partículas de vidrio magnéticas obtenidas del sol 1 son particularmente adecuadas para el aislamiento del ADN. Las partículas de vidrio obtenidas del sol 2 son adecuadas particularmente para el aislamiento del ARN. 2. Protocolo estándar para la preparación de la muestra para el aislamiento de los ácidos nucleicos por ejemplo el ADN El siguiente protocolo estándar es adecuado para el aislamiento de los ácidos nucleicos de las muestras biológicas tales como la sangre entera o las células cultivadas. Los ácidos nucleicos obtenidos de esta manera pueden ser utilizados directamente después de la elución para una amplificación por PCR, una segmentación de restricción o un manchado de Southern. El juego o conjunto de la reacción contiene: 1. una solución amortiguadora de unión (4.7 mol/1 de clorhidrato de guanidinio, 10 mmol/l de urea, 10 mmol/1 de Tris HCl, 20 % de Triton®X-100, pH 5.7 2. proteinasa K liofilizada (disuelta en H20 a una concentración de 20 mg/ml) 3. solución amortiguadora de lavado (56 % (v/v) etanol, 20 mmol/1 NaCl, 10 mmoles/1 Tris HCl, pH 7.5) 4. solución amortiguadora de elución (10 mmol/1 Tris pH 8.5) 5. partículas de vidrio magnéticas (MPG) a) tabletas que contienen 'cada una 7.5 mg de las partículas de vidrio o b) una suspensión al 15 % de las partículas de vidrio en etanol Los componentes del juego o conjunto son estables y pueden ser almacenados a la temperatura ambiente. Después de la disolución de la proteinasa K en agua, la solución debe ser dividida en alícuotas y almacenada a -20 °C. La solución congelada es estable durante 12 meses.

Protocolo estándar 1. 200 µl de la muestra son agregados a un recipiente de la reacción de 2 mi y se mezclan con 200 µl de la solución amortiguadora de unión y 40 µl de la solución de la proteinasa K. La misma se incuba subsiguientemente durante 10 minutos. La incubación es llevada a cabo preferentemente a temperatura ambiente. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias la temperatura de la incubación también puede ser incrementada hasta 70 °C. 2. Después de la incubación 'se agregan 200 µl de isopropanol y un tableta de MGP (o alternativamente 200 µl de suspensión de MGP) y se incuba durante 5 minutos a la temperatura ambiente. 3. El recipiente de la reacción es colocado en un separador de partículas magnéticas (Boehringer Mannheim, Cat. No. 1 641 794) y separadas durante aproximadamente 1 minuto. 4. El sobrenadante es desechado y los recipientes de la reacción son removidos del separador de MP.

. Después de la adición de 500 µl de la solución amortiguadora de lavado, los contenidos del recipiente de la reacción son mezclados y colocados nuevamente en el separador de MP durante aproximadamente 1 minuto. 6. El sobrenadante es desechado. El paso 5 es repetido tres veces. Después del último proceso de lavado la solución amortiguadora restante es removida completamente . 7. Para la elución se agregan 100 µl de la solución amortiguadora de elución la cual es precalentada opcionalmente a 70 °C. Luego 'la misma es mezclada e incubada durante 5 minutos a temperatura ambiente. La muestra es colocada en el separador de MP y el sobrenadante es transferido hacia un recipiente de la reacción limpio.

, Los ácidos nucleicos por ejemplo el ADN obtenido de esta manera son obtenidos y pueden ser procesados además directamente de manera subsiguiente o almacenados a 4 °C.

El protocolo anterior también puede ser utilizado correspondientemente para placas de microtitulación por ejemplo placas de microtitulación muy profundas (por ejemplo Ritter, J. J. Bioanalytic) . 3. Detección de tracoma os de clamidia por PCR 3.1 Protocolo estándar manual para la preparación de la muestra 200 µl de una muestra de orina y 240 µl de solución de proteinasa K/amortiguador de unión (5:1) se colocan por medio de una pipeta en un recipiente de reacción de 2 mi, se someten a un mezclado con un movimiento giratorio y se incuban durante 10 minutos a 70 °C. Luego la mezcla se enfría durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se agregan 200 µl de solución de MPG isopropanólica a la muestra por medio de una pipeta. Inmediatamente después de esto es mezclada por agitación con un movimiento giratorio. . La muestra es incubada entonces durante 15 minutos en un mezclador por ejemplo Thermomixer 5436 (Eppenford) . Los MGPs son concentrados por la transferencia de la muestra a un separador magnético. Después de un minuto el sobrenadante es removido completamente por medio de una pipeta. Se agregan 0.5 mi de la solución amortiguadora de lavado a los MGPs por medio de una pipeta. La muestra es sometida a mezclado con un movimiento giratorio y luego se transfieren al separador magnético. El sobrenadante es removido por pipeta después de 1 minuto. El procedimiento de lavado es repetido durante una dos veces adicionales. 200 mi de la solución amortiguadora de elución se agregan al MGP. La muestra es incubada durante 10 minutos a 70 °C en un termomezclador a 1400 rpm. El agua condensada es colectada centrifugando brevemente. La muestra es transferida al separador magnético y después de 1 minuto se remueven 180 µl del eluido. El eluido es colocado por medio de pipeta en un nuevo recipiente de reacción y almacenado a 4 °C (durante un periodo de almacenamiento de < 24 h) o a -20 °C (durante un periodo de almacenamiento más prologando) . 50 µl del eluido son utilizados para la PCR: La evaluación es por electroquimioluminiscencia. 3.2 Protocolo para un proceso semiautomatizado En lugar del mezclado con un movimiento giratorio descrito en 3.1 y calentamiento sobre un termobloque, un proceso semiautomatizado es llevado a cabo en el cual el mezclado y el calentamiento se llevan a cabo sobre un módulo de mezclado y calentamiento. La Figura 4 muestra una comparación de la determinación de la clamidia (muestra: 100 anticuerpos elementales por 100 mi de orina; determinación seis veces) entre el protocolo estándar manual (agitación de manera giratoria) y el proceso semiautomatizado (MTM) . Se puede observar que la sensibilidad no es alterada por la automatización. 3.3 Protocolo semiautomatizado a temperatura ambiente La preparación de la muestra se lleva a cabo como se describió en la sección 3.2. Sin embargo, la lisis y la elución se lleva a cabo a temperatura ambiente. 3.4 Protocolo de preparación de las muestras semiautomatizado a temperatura ambiente con tratamiento posterior subsiguiente del eluido La preparación de la muestra se lleva a cabo como se describió en la sección 3.3. Después de la elución se lleva a cabo una incubación durante 10 minutos a 70 °C. La Figura 5 muestra una comparación de la determinación de la clamidia (muestras: SWE1, o anticuerpos elementales de clamidia (EAB) por mi de orina, SWE2 : 10 EAB, SWE3 : 100 EAB y SWE 4: 1000 EAB cada uno por mi de orina) entre los protocolos de preparación de la muestra descritos en las secciones 3.2, 3.3 y 3.4. Se puede observar que el protocolo estándar es más sensible comparado con una preparación de la muestra a temperatura ambiente (protocolo MTM a TA) para la determinación de la clamidia. Sin embargo, los resultados de la preparación de la muestra a temperatura ambiente y tratamiento posterior subsiguiente del eluido (protocolo MTM a TA con tratamiento posterior) muestra que este efecto puede ser compensado ampliamente. Por lo tanto es sorprendente que un paso de temperatura no es necesario durante la preparación de la muestra per se.

Este descubrimiento permite que el proceso de preparación de la muestra sea amplificado considerablemente puesto que los pasos de la lisis, adsorción, lavado y elución pueden ser llevados a cabo a temperaturas de < 40 °C lo cual simplifica una automatización puesto que una regulación de la temperatura y contracalentamiento de la tapa ya no es necesario. 4. Detección del ARN-VTH por PCR 4.1 Protocolo estándar manual para la preparación de la muestra El plasma congelado es licuado durante 5 minutos a 37 °C y enfriado sobre hielo durante el procesamiento adicional. 50 µl de una solución de proteinasa K (25 mg/ml) es colocado por medio de pipeta en un recipiente de reacción Darstedt de 1.5 mi. Se agregan 250 µl de la muestra a ésta y se mezclan en un mezclador de remolino.

Luego se agregan 300 µl de solución amortiguadora para la lisis y nuevamente se mezclan con un movimiento giratorio.

La solución se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente sobre un mezclador de Eppendorf a 13,000 rpm. Luego 300 µl de una suspensión de MGP (6 mg/ml de MGP en isopropanol) son agregados, se mezcla con un movimiento giratorio y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente con mezclado continuo. Los MGPs son separados sobre un separador magnético y el sobrenadante es removido completamente. Se agregan 750 µl de la solución amortiguadora para lavado a los MGPs . Los MGPs se vuelven a suspender y se separan como se describió previamente. Se repite el procedimiento de lavado cuatro veces y la solución para el lavado es removida cuidadosamente al final. Luego son agregados 100 µl de la solución amortiguadora para la elución y los MGPs se vuelven a suspender. Después de 15 minutos de incubación a 80 °C sobre un termomezclador Eppendorf (13,000 rpm), se transfieren 90 µl del eluido hacia un nuevo recipiente de la reacción. Se utilizan 40 µl del eluido para la determinación del VIH subsiguiente por PCR a TA. 4.2 Protocolo estándar semiautomatizado para la preparación de la muestra La preparación de la muestra se llevó a cabo como se describió en la sección 4.1 excepto que el mezclado y el calentamiento se llevan a cabo sobre un módulo de mezclado y calentamiento. 4.3 Protocolo semiautomatizado a temperatura ambiente La preparación de la muestra se lleva a cabo esencialmente como se describió en la sección 4.2 excepto que todos los pasos se llevan - a cabo a temperatura ambiente. El periodo de incubación para la lisis, la adsorción y la elución es en cada caso de 15 minutos. Se puede observar en la Figura 6 que la automatización y la preparación de las muestras a temperatura ambiente (protocolo MTM a TA) no alteran la sensibilidad comparado con el protocolo estándar con la preparación de la muestra manual (manual) . Se obtienen resultados reproducibles para muestras de plasma negativas, poco positivas, moderadamente positivas y altamente positivas.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (38)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para el aislamiento de una substancia que se va a analizar del ácido nucleico, a partir de una muestra biológica, el proceso está caracterizado porque comprende los pasos de: (a) usar la muestra en un recipiente de reacción, (b) agregar una matriz de adsorción sólida (c) incubar bajo condiciones tales que la substancia que se va a analizar se una a la matriz de adsorción, (d) remover los componentes de la muestra no unidos del recipiente de la reacción, (e) incubar bajo condiciones tales que la substancia que se va a analizar sea eluida de la matriz de adsorción y (f) separar el eluido de la matriz de adsorción en donde al menos los pasos (a) a (e) se llevan a cabo esencialmente a la misma temperatura la cual está en el intervalo desde la temperatura ambiente hasta 40 °C.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: el paso (a) comprende agregar una proteasa y una solución amortiguadora desnaturalizante.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque: la proteinasa K es utilizada como la proteasa.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque: una solución amortiguadora desnaturalizante es utilizada, la cual contiene una sal de guanidinio, en particular clorhidrato de guanidinio y/o tiocianato de guanidinio.

5. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones previas, caracterizado porque: las partículas de vidrio magnéticas son utilizadas como la matriz de adsorción sólida.

6. El proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque: las partículas de vidrio magnéticas son agregadas en la forma de una suspensión.

7. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado porque: se utilizan partículas de vidrio cuya fase de vidrio contiene Si02, B203 y Na20 o Si02, B203, A1203, CaO y K20.

8. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones previas, caracterizado porque: la cantidad de la matriz de la adsorción agregada es cuando mucho 50 % mayor que la cantidad que es requerida para unir cuantitativamente la substancia que se va a analizar presente en la muestra.

9. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones previas, caracterizado porque: un mezclado continuo o intermitente sin agregar dispositivos externos es llevado a cabo al menos durante los pasos (c), (d) y/o (e) .

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque: el mezclado es logrado haciendo girar el recipiente de la reacción alrededor de su eje longitudinal .

• 11. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque: el período máximo para llevar a cabo los pasos (c) y/o (e) es de 20 minutos en cada caso.

12. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones previas, caracterizado porque: el paso (d) comprende agregar y aspirar una solución amortiguadora de lavado el cual es repetido opcionalmente varias veces.

13. El proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque: una solución amortiguadora es utilizada con un contenido de al menos 50 % (v/v) de un solvente orgánico que es miscible con el agua.

14. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones previas, caracterizado porque: se agregan reactivos adicionales tales como enzimas en el paso (e) .

15. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones previas, caracterizado porque: una solución amortiguadora con un contenido bajo de la sal es utilizada para la elución en el paso (e).

16. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque: una mezcla maestra para la amplificación del ácido nucleico es agregada para la elución en el paso (e) .

17. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque: la temperatura está en e-1 intervalo desde 18 °C hasta 32 °C.

18. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones previas, caracterizado porque: un paso de tratamiento posterior a una temperatura elevada es llevado a cabo después del paso (f) .

19. El proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque: la temperatura elevada está en el intervalo desde más de 40 °C hasta 95 °C.

20. Un proceso para el aislamiento de una substancia que se va a analizar del ácido nucleico, a partir de una muestra biológica, caracterizado porque comprende los pasos de : (a) Usar la muestra en un recipiente de reacción, (b) agregar una matriz de adsorción sólida c) incubar bajo condiciones tales que la substancia que se va a analizar se una a la matriz de adsorción, (d) separar los componentes de la muestra no unidos, de la matriz de adsorción, (e) incubar bajo condiciones tales que la substancia que se va a analizar sea eluida desde la matriz de adsorción y (f) separar el eluido 'de la matriz de adsorción en donde al menos los pasos (a) a (e) se llevan a cabo esencialmente a la misma temperatura la cual está en el intervalo desde la temperatura ambiente hasta 40 °C.

21. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones previas, caracterizado porque: el proceso se lleva a cabo en un dispositivo automatizado.

22. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 o 21, caracterizado porque: los pasos (a) a (e) son llevados a cabo en un recipiente de reacción único.

23. Un juego o conjunto de reactivos para aislar una substancia que se va a analizar del ácido nucleico, en particular para llevar a cabo el proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque comprende: (a) una proteasa, (b) una solución amortiguadora para la lisis de la muestra, (c) una solución amortiguadora de lavado, (d) una solución amortiguadora de elución y (e) una suspensión de ' partículas de vidrio magnéticas.

24. Un juego o conjunto de reactivos para el aislamiento del ADN, caracterizado porque comprende las partículas de vidrio magnéticas cuya fase vitrea contiene Si02, B203 y Na20.

25. Un juego o conjunto de reactivos para el aislamiento del ARN, caracterizado porque comprende las partículas de vidrio magnéticas cuya fase de vidrio contiene Si02, B203, A1203, CaO y K20.

26. Un dispositivo para el aislamiento de una substancia que se va a analizar del ácido nucleico, a partir de una muestra biológica, caracterizado porque comprende : un dispositivo para la preparación de la muestra, - un dispositivo de retención para los reactivos, un primer dispositivo de retención para los recipientes de reacción, para la preparación de la muestra, el cual está equipado para una temperatura operativa de < 70 °C, en particular <40 °C, - un segundo dispositivo de retención para los recipientes de la reacción, el cual contiene opcionalmente un medio de enfriamiento y/o calentamiento, y un dispositivo de herramienta robótica.

27. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque: un recipiente de reacción único es utilizado para Usar una muestra, para adsorber una substancia que se va a analizar en un una matriz de adsorción sólida, para lavar la matriz de adsorción y para eluir la substancia que se va a analizar desde la matriz de adsorción.

28. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 26 o 27, caracterizado porque: el primer dispositivo de retención es utilizado para retener los recipientes de la reacción para la preparación de la muestra y al menos para la adsorción de la substancia que se va a analizar a una matriz de adsorción sólida, y para lavar la matriz de adsorción.

29. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque: el primer dispositivo de retención es utilizado adicionalmente para retener los recipientes de la reacción para la preparación de 'la muestra, para Usar la muestra y/o para eluir la substancia que se va a analizar desde la matriz de adsorción.

30. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizado porque: el segundo dispositivo de retención para retener los recipientes de la reacción es utilizado para almacenar y/o procesar adicionalmente la substancia que se va a analizar.

31. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 26 a 30, caracterizado porque: el segundo dispositivo de retención para retener los recipientes para los reactivos es utilizado para procesar la muestra adicionalmente.

32. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 26 a 31, caracterizado porque: el segundo dispositivo de retención para la retención de los recipientes de la reacción es utilizado para al menos un paso de tratamiento a una temperatura elevada la cual es seleccionada de la lisis de la muestra, la elución de la muestra desde la matriz de adsorción y un paso de tratamiento posterior después de la elución.

33. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 26 a 32, caracterizado porque: el primer dispositivo de retención contiene los medios para la separación magnética.

34. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 26 a 33, caracterizado porque: el primer dispositivo de retención contiene los medios para mezclar los recipientes de la reacción para la rotación alrededor de su eje longitudinal.

35. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 26 a 34, caracterizado porque: la herramienta robótica comprende dispositivos de pipeteo automáticos y opcionalmente medios para abrir y cerrar los recipientes de la reacción.

36. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 26 a 35, caracterizado porque: la herramienta robótica. comprende medios para transportar los recipientes de la reacción entre los primero y segundo dispositivos de retención.

37. Las partículas de vidrio magnéticas, caracterizadas porque comprenden un núcleo magnético y un recubrimiento de vidrio que contiene Si02, B203, un óxido de metal alcalino y opcionalmente A1203 y un óxido de metal alcalinotérreo.

38. Las partículas de vidrio de conformidad con la reivindicación 37, caracterizadas porque: el recubrimiento de vidrio contiene Si02, B203 y Na20 o Si02, B203, A1203, K20 y CaO . 10 15 20 25 MÉTODO UNIVERSAL DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS EL CUAL PUEDE SER AUTOMATIZADO RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un métod para preparar muestras biológicas para una detecció subsiguiente de una substancia que se va a analizar especialmente de un ácido nucleico, en la muestra. L invención también se refiere a la preparación de juegos conjuntos de reactivos, a dispositivos novedosos para l preparación de la muestras y a nuevos pigmento magnéticos .