JPH02289596A - 核酸の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は核酸を含有する出発材料から核酸を単ためのテ
ストキットに係る．より特定的には、本発明は全血、血
清、パフィーコート《血液の炎症性痴皮又は白血球フラ
クション）、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織、
細胞培養物等のような、核酸を含有する生物材料から核
酸を単離するための方法及びキットに係る．上記生物材
料から単離された核酸は、サンプルを採取した生物に内
在する核酸及び外来性（ウイルス、真菌、細菌又は寄生
虫に由来する）核酸も含有し得る。

全血、血清、尿又は糞便のような複雑な出発材料から核
酸（Ｎ＾）を単離する既知の方法は通常、タンパク質分
解酵素の存在下で生物材料を洗剤により溶解させた後、
有機溶剤（例えばフェノール及び／又はクロロホルム）
で数回抽出し、エタノール沈降させ、核酸を透析するこ
とにより実施される．例えば臨床材゛料から（二重鎖）
ＤＮＡを単離するこれらの既知の方法は多大な労力と時
間を必要とする．このような出発材科からＮ＾を精製す
るためには比較的多数の段階が必要とされるので、数個
の臨床サンプルを同時に処理する場合、サンプル間にＮ
＾が伝播される危険が大きい．核酸増幅法、例えば最も
感受性の高いポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＢ　，Ｓａｉｋ
ｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０．　１９８５．　１３５
０）により例えば病原体（例えばウイルス又は細菌）に
おけるＮ＾の存在を後で検出するためにＮ＾を単離する
場合、このように異なるサンプル間でＮ＾が伝播される
危険が大きいと、誤って陽性の結果が生じ、重大な問題
である． 汚染に対して感受性のこのような既知の方法の１例は、
組織及び細胞培養物から全ＲＮＡを単離するための方法
として＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋ｉｓｔ
ｒｙ　１Ｂ２，１９８７．　１５６に記載されている方
法である．この方法によると、生物出発材料からＲＮＡ
を酸性チオシアン酸グアニジニウムーフェノールークロ
ロホルム混合物で１回抽出する，相分離後、更に水相を
処理することにより有用な条件下で４時間以内にＲＮＡ
を回収することができる． ＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１
６２，　１９８７．　４６３には、塩酸グアニジンを含
有する緩衝液に細胞を分散し、エタノール沈降させるこ
とにより、組織及び細胞系から［ｌＮ＾を単離するため
の方法が記載されている．この方法は汚染に対して感受
性であるが、分離したＤＮＡを更に処理してから数時間
以内に有用なＮ＾産物を単離することができる． しかしながら、これらの既知の方法は複雑な出発材料（
例えば全血及び血清）中では首尾よく使用することがで
きない。

本発明の目的は、既知の方法の欠点を解消するような方
法を提供することである． より特定的には本発明の目的は、種々の生物材料のよう
な複雑な出発材料から核酸（即ちＤＮ＾及び／又はＲＮ
Ａ）を未曾有の迅速さで簡単且つ再現可能に、しかもそ
の後、分子生物反応における反応剤として使用可能な非
損傷状態及び高純度で直接（前処理を介さずに）単離す
ることが可能な方法を提供することである。

本発明の別の目的は、他のサンプル及び人体に対する汚
染の危険が低いという点で既知の方法と異なり、即ち異
なるサンプル間におけるＮ＾の伝播の危険を最小にしな
がら数個の臨床サンプルを同時に処理することが可能な
方法、並びに被処理サンプル中に存在し得るウイルス又
は細菌が人体に伝染する危険を最小にすることが可能な
手段を提供することである． これらの目的は本発明に従い、出発材料をカオトロピッ
ク物質及び核酸結合性固相と混合し、核酸が結合した固
相を液体から分離し、その後、こうして得られた固相一
核酸複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から
溶離することを特徴とする、核酸を含有する出発材料か
ら核酸を単離するための方法により実現される． 広義には本発明はあらゆる核酸含有出発材料《ウイルス
又は細菌に感染した食品及び類似製品、ワクチン及びミ
ルクを含む》に適用できるが、使用される出発材料が全
血、血清、パフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液
、唾液、組織及び細胞培養物（例えば噛乳動物細胞培養
物及び細菌培養物）のような核酸含有生物材料であるよ
うな方法に特に適用される．当然のことながら、本発明
の方法はＰＣＲ産物又は更に精製を要する別の核酸回収
方法の産物のような比較的純粋な出発材料にも適用でき
る．しかしながら、核酸含有生物材料の種類によっては
（例えば植物材料、ある種のダラム陽性菌並びにある種
の酵母及びカビ）は特殊な細胞壁構造によりカオトロピ
ック物質に溶解しないため、出発材料として本発明の方
法で直接使用することはできない．従って、このような
出発材料は入手形態の細胞に前処理を施す必要があり、
例えば予め細胞を溶解させてから得られた溶解物に本発
明の方法を実施すればよい． 核酸（Ｎ＾）なる用話は、任意の可能な構造、即ち二重
鎖（ｄｓ）核酸、又は一重Ｍ　（８８）核酸、又はその
組み合わせ（部分的ｄｓ又はｓｓ）としてのＤＮＡ及び
ＲＮＡを意味する． 本発明の主眼は、カオトロピック物質の存在下でＮ＾と
結合することが可能な核酸結合性固相、例えばシリカ粒
子を使用する点にある．シリカなる用語は、Ｓｉｎ２結
晶及び他の形態の酸化ケイ素、ＳｉＯｚから構成される
ケイソウ植物の骨格、無定形酸化ケイ素並びにガラス粉
末を意味する．アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム（
ゼオライト》、−ＮＨ２を有する活性シリカ、ラテック
ス粒子、キュベットもしくは微量滴定プレートの内壁を
形成するある種のポリマー材料、又は例えばニトロセル
ロースから構成されるフィルター材料も本発明の核酸結
合性固相として使用できる． シリカ粒子の使用に関しては、カオトロピック塩Ｍａｌ
（ヨウ化ナトリウム》の高濃度溶液中のｄｓＤＮ＾をア
ガロースから遊離させ、ガラスに結合できることがＰＮ
ＡＳ　７６，　１９７９．　６１５により知見された．
この文献はアガロースゲルからＤＮＡを単離するための
２種の方法について記載しており、そのいずれも第１段
階でアガロースを溶解するためにＭａｌ溶液を使用して
いる．一方の方法では第２段階でＤＮＡをアセトンで沈
降させ、他方の方法では第２段階でＤＮＡをガラス粒子
に結合し、その後、水性ｙｉｍ液に溶離する．しかしな
がら、この方法では体液及び他の生物出発材料のような
複雑な出発材料を使用できない。更にこの論文は、本発
明の１段階方法については開示していない． 本発明によると、結合し、その後、溶離される高純度の
核酸を不純な出発材料から直接得られるように、適当に
選択した粒径を有するシリカ粒子を使用することが好ま
しい。

本発明の好適態様は、実質的に０、０５〜５００μｍの
範囲の粒径を有するシリカ粒子を使用することを特徴と
する．ｒ実質的に」なる用語は、シリカ粒子の８０％以
上、好ましくは９０％が規定された粒径範囲に該当する
ことを意味する．結合したＮ＾を容易に処理できるよう
にするためには、使用されるシリカ粒子は実質的に０、
１〜２００μ躊の範囲の粒径を有すると好適であり、使
用されるシリカ粒子が実質的に１〜２００ｐ＋の範囲の
粒径を有するような方法が最適である。実際に、シリカ
粒子のＮ＾結合能は粒子が小さければ小さいほど高いが
、特にＮ＾含有量の高い出発材料の場合、及びＮ＾分子
が比較的長い場合は、過度に小さいシリカ粒子を使用す
ると、形成されるＮ＾−シリカ複合体をそれ以上有効に
再分散することができなくなる。換言するならば、結合
したＮ＾を純粋な形で複合体から回収することができな
い．人血を出発材料として使用する場合、０。２〜ＩＯ
Ｈの範囲の粒径を有する非分画シリカを使用すると、こ
のような問題が生じることがある。

それ以上再分散することができない凝集物の形成は、粒
径が１〜１０ｐｍの範囲の分画したシリカを使用するこ
とにより避けることができる。しかしながら、細菌培養
物のように細胞中の濃度が高い出発材料を使用する場合
、このような粗いシリカフラクションの使用は再分散し
難い凝集物の形成を避けるためには不十分であり、２〜
ｚｏｏｕ−の粒径を有するケイソウ土のようなもっと粗
いシリカを使用すると、最適の結果が得られることが判
明した。

別の好適態様によると、Ｎ＾結合性固相はフィルター形
態であるか、又はサンプルとカオトロピック物質とを収
容する容器の一部を形成する．Ｎ＾結合性固相を後者の
形態に選択すると、その後のサンプル処理及びＮ＾単離
のために遠心分離又はＰ過を実施する必要がなくなる． 本発明によると、シリカ粒子のような上記核酸結合性固
相以外にカオトロピック物質を使用することが不可欠で
ある．カオトロピック物質なる用語は、タンパク質及び
核酸の二次、三次及び／又は四次構造を変えることが可
能であり且つ少なくとも一次構造を無傷にしておくこと
が可能な任意の物質を意味する．具体例は（イソ）チオ
シアン酸グアニジニウム疎−び塩酸グアニジンである．
核酸を含有する出発材料からＮ＾を単離するために、ヨ
ウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン
酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み合わせも核酸結
合性固相と組み合わせて使用すると非常に好適である．
本発明によると、使用される力オト口ピックグアニジニ
ウム塩は好ましくはチオシアン酸グアニジニウム（Ｇｕ
ＳＣＮ）である．本発明は通常、出発材料を十分大きい
量のカオトロピック物質（例えばグアニジニウム塩）及
び例えばシリカ粒子と混合し、出発材料中に存在する核
酸のほぼ全体を遊離させ、該シリカ粒子に結合させるよ
うに実施される．適当なプロトコールによると、例えば
、反応容器中に存在するＧｕＳＣＮ緩衝溶液にシリカ粒
子懸濁液を加え、その後、サンプルを加えて十分に混合
する．やがて、細胞が溶解し、ウイルスが存在する場合
はウイルスも溶解し、遊離したＮ＾がほとんど即座にシ
リカ粒子に結合する．次に、形成されたシリカー核酸複
合体を例えば迅速沈澱（遠心分離）及び上清の廃棄（例
えば吸引による）により液体から分離し、その後、複合
体（例えばシリカー核酸ペレットの形態）を例えばボル
テックスミキサーを使用してカオトロピックグアニジニ
ウム塩を含有する洗浄用Ｍ＠液で洗浄（再分散又は均質
化）し、再び沈澱させる。好ましくは、洗浄用榎衝液で
洗ったシリカー核酸複合体を更にアルコール水溶液（収
率の損失を制限するために最適には約７０％エタノール
）及びアセトンで洗い、そのｊ表、（例えば加熱下に）
乾燥してアセトンを除去する。次に、洗浄及び乾燥した
シリカー核酸複合体中に存在するＮ＾を水性溶離用！！
街液（ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）により溶離する
．溶離用｝ＪＨ！！液の選択は単敲されるＮ＾の使用目
的に応じて決定される。適当な溶離用緩衝液の例はＴＩ
Ｅ榎街液、２回蒸留水（ａｑｕａ　ｂｉｄｅｓｔ）及び
ＰＣＲＭｉ液（［材料及び方法Ｊの項参照》である．好
ましくは、これらの全段階を単一の反応容器（例えば容
量１　．５ｚ１のポリプロピレン製エツペンドルフチュ
ーブ）中で実施し、比較的少量、例えば１００１１１未
満の精製Ｎ＾を回収する。こうして単離したＮ＾は核酸
分解酵素を含有せず、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばｂ且
−ＯＮ＾ボリメラーゼ）、ＤＮ＾制限酵素、ＤＮＡリガ
ーゼ及び逆転写酵素（例えば＾ＭＹ逆転写酵素）のよう
な種々の酵素の基質として直接使用できるような高純度
を有する。

本発明の方法によると、ＰＣＲ法又はヨーロッパ特許第
ＥＰＯ３２９８２２号に記載されている所謂ＮＡＳＢＡ
法（ＮＡＳＢ＾＝核酸配列に基づく増幅）のような増幅
方法によりＮ＾配列を証明できる程に、例えば血漿及び
血球を予め分離することなく約４５分間に５０，（の全
血から十分な量のＮ＾を単離することができる。

一方、本発明は血清、糞便、尿等のようなＮ＾を含有す
る他の種々の生物材料にも適用することができる．この
ため、本発明は細菌及びウィルス感染の診断において、
並びに出生前診断及び遺伝性腫瘍体買の診断の領域にお
ける遺伝的多形性の研究において有用である。

本発明のＮＡ単離方法は、全手順を単一の反応容器中で
実施することができ、方法の第１段階で粗出発材料から
遊離したＮ＾が完全な別の精製過程の間に少なくとも固
相の大部分に結合するので、汚染の危険が非常に低い。

ウィルス又は細菌に感染している可能性のある材料の処
理に伴う人体への危険は、サンプルを反応容器に入れる
単Ｍ過程の第１段階にほぼ限定される６この第１の処理
において、潜在的に存在する病原体は有効に不活化され
る９本発明の方法は特殊な周辺技術（ボルテックスミキ
サー、１２０００ｆＩエッペンドルフ型の遠心分離機及
び水浴又はエッペンドルフ加熱ブロックが標準実験技術
に属する）も生化学の専門的知識も必要としないので、
多数のサンプルがら機械的にＮ＾を単離するため、換言
するなら自動化に非常に適している。本発明の方法を使
用すると、１０個以上、あるいは２４個以上の異なるサ
ンプルを約１時間で処理することができる。

本発明は核酸を含有する出発材料から核酸を単離するた
めの方法のみならず、そのための手段の組み合わせ及び
該方法により得られた核酸を増幅するためのテストキッ
トにも係る． １Ｒ様によると、本発明の手段の組み合わせは、（ａ）
（イソ》チオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解用
ＭＷＲ液（Ｊｙｓｉｓ　ｂｕｔｌｅｒ）、（ｂ）実Ｈ的
に０．０５　〜５００ｕｍ、好ましくは０．１　〜２０
０１ｍ、最適には１〜２００Ｉ１＋＊の範囲の粒径を有
するシリカ粒子の水性懸濁液、（Ｃ）（イソ）チオシア
ン酸グアニジニウムを含有する洗浄用＃ＩＩ．ＷＩ液、
及び必要に応じて（ｄ）溶離用緩衝液を含む． 即ち、本発明の手段の組み合わせは例えば次の４成分、
即ち 成分ｌ：（イソ）チオシアン酸グアニジニウム緩衝溶液
、 成分２：シリカ粒子の懸濁液、 成分３：洗浄用Ｍ街液、及び（場合によって）成分４：
溶離用緩衝液 から構成され得る． 必要に応じて成分ｌ及び２を一緒にしてもよいが、その
場合、貯蔵寿命が制限される． 本発明のＮ＾単離方法で使用することが好ましい他の反
応剤、例えばエタノール及びアセトンは標準実験技術に
属する。

以下、多数の実施例により本発明を説明する。

先ず、使用される材料と方法について説明する。

（以１・う二口） 仕μ』ＪＬ九法 ？径分布０．５〜１０μｍで且つその８０％が１〜５　
ｐ　＋ｎの、Ｓｉｇｍａ製の二酸化ケイ素（ＳｉＯ■）
を使用した。

シリカ６０，を直径５ｃｎ＋のシリンダーに入れた２回
蒸留水〈最高５００ｍｆ）中に懸濁させると、水柱の高
さは２７．５ｃｍとなった。室温で２５時間ｌｘ　ｇ沈
降させた後に、７０糟１を残して上澄みを吸引して除去
した。２回蒸留水を５００ｍｔ’になるまで加え、シリ
ンダーをｆｉ盪することにより粒子を再度懸濁させた。

５時間ｌｘ　ｇ沈降させた後、６０ｍｌを残して上澄み
を吸引して除去した。３２％（賀／ｖ）ＩＩＣ１６００
μｌを加えた後、渦形成することにより再度懸濁させた
。この懸濁液を６ｍｌ容器に入れて４ｔｎｌアリコート
をつくり、密封し、オートクレープ内で１２１゜Ｃで２
０分間加熱した．この沈降プロトコルによって、粒径１
ｐ輪以上のより大きなシリカ粒子を豊富に得ることがで
きた。これは電子■微鏡検査によって立証された，更に
、酸性（ｐＨ約２）のシリカをオートクレープ処理する
と、任意に存在する核酸が完全に分解される結果となる
。このように得られたシリカ粗材の懸濁液を以下ＳＣと
表記する。

シリ　；４　の懸　゛ ２〜１８個の炭素原子の長さのアルキル末端を有するメ
チルアクリルアミド二酸化ケイ素を用いてシリカを誘導
体化した。誘導体化したシリカの粒径は６３〜Ｚｏｏ，
Ｍであった。使用した粒子の孔径は５００人であった。

上記シリカ誘導体（１２Ｈ＾＾ＭＣｚ−Ｃ，ｓ）はＤｉ
ｏｓｙｎｔｈ，Ｏｓｓから供給された。

Ｎ＾単離のために（実施例１１１）、誘導体化したシリ
力粒子０．５２を２回蒸留水１ｍｌ２中に懸濁させた。

このシリカ懸濁液を、３２％（ｗ／ｖ）ｌｌｃｆ　１２
０ｐｌを用いて９０℃で３０分間予備処理した。

ポリス　レンラーツクス粒　の縣 ２種類のポリスチレンラテ；ンクス粒子を使用した。ボ
リスチレンラテックスＶＱ６９レッドはナトリゥムード
デシルスクシネートスルフェート基を吸収させてあり、
粒径は４２４ｎｎを有した。ボリスチレンラテックスＶ
Ｑ５８１３はより小さい粒径（３２８ｎｍ）を有し、外
側にスルフェ−Ｉ一基を吸収していなかった。

３種の親水性のグリシジルメタクリレートボリスチレン
ラテックス粒子を使用した。＾（１：Ｆ２７ｃ：、ＡＣ
Ｎ３レッド及び＾ＧＹ１５１５の粒径はそれぞれ９３３
ｎｍ、２０６ｎｍ及び８　４　６　ｎ　ｍであった。上
記全てのボリスチレン粒子は＾ＲＬ＾−＾ｒｎｈｅｍよ
り供給のものであった。

ｌＬ２工永ｌ： 以下のものを使用した。

１．　ＰＶＤＦ　　Ｍｉ１１ｉｐｏｒｅ提供のＩｎ＋ｎ
＋ｏｂｉｌｏｎ　ＴｒａｎｓｆｅｒＭｅｍｂｒａｎｅ（
疎水性）、 ２．　Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ
提供のＮｉｔｒｏｃｅｌ１ｕｌｏｓｅ（０．２ＩＩＭ参
照番号４０１　．３９６）、３．　Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ　
　八ｍｅｒｓｈａｍ提供のＮｙＬｏｎ　ｌ｛ｙｂｉｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎＪｌｉ　（０．４５ミクロン、ロット
：１６８７２）。

Ｂ）凶』Ｕ酊搭 ＴＲＩＳ（ＢｏｅｈｒｉｎＨｅｒ）１２．１ｇを２回蒸
留水８　０　０　ｔｏ　ｒｌ中に溶解し、３７％ｈ／ｖ
）ＩＩｃ／　８．１ｍ／を加え、さらに容績１リットル
になるまで２回蒸留水を加えることにより、Ｌ２｝５街
液（０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ．Ｃ１、ｐｌｌ６．４）を調製
した。

Ｃ）ａｌ痰具 ＧｕＳＣＮ（Ｆ　ｌｕｋａ製のチオシアン酸グアニジン
Ｂｚｏ．，をＬ２Ｍ　街液１００ｍｌ中に溶解すること
により、洗浄液Ｌ２を調製した。

Ｌ旧［３ Ｋｌ（Ｍｅｒｃｋ製のヨウ化カリウム）１２．４５ｙを
Ｌ　２　［衝液２５ｍｌ中に溶解することにより洗浄液
Ｌ２本を調製した。

Ｎａｌベースのカオｌ・ロビック物質を調製するために
、Ｍａｌ（Ｍｅｒｃｋ製のヨウ化ナトリウム）１１．２
５１？をＬ２緩衝液２５社中に溶解した。チオシアン酸
ナトリウムベースのカオトロピック物質を調製するため
に、ＮａＳＣＮ（Ｂａｋｅｒ）６．１ｇをＬ２緩衝液２
５社中に溶解した。

Ｋｌ及び尿素（８Ｍ）を含有するカオトロピック物質を
調製するために、Ｋｌ　１２．４５，及び尿素１２．０
ｇをＬ２緩衝液（２５ｇ＋１）中に溶解した。同様に、
尿素及びＮａｌを併有するカオトロピック物質と、尿素
及びＮａＳＣＮを併有するカオトロピック物質とを調製
した． Ｄ）ｌ東肚１１１長 ＧｕＳＣＮ　１２０ｇをＬ２緩衝液１００ｎ＋１中に（
約６０℃の温水浴中で静かに振盪させて）溶解し、次い
で４０％（ｗ／ｖ）デキストランスルフェート（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ）溶液２６．０ｇ、０．２Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ　ｐＨ８　２２ｍ／及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０
０（Ｐａｃｋａｒｄ）２．６ｇを加え、次に溶液を均質
化することにより、溶解用緩衝液Ｌ５を調製した。０．
２ＭＥＤＴＡ　ｐＨ８溶液は、ＥＤＴ＾３フ．２１Ｆ（
Ｍｅｒｃｋ製のＴｉｔｒｉｐｌｅｘ）３７．２，及びＮ
ａＯＨ（Ｍｅｒｃｋ）４．４ｇを水５００ｎ＋Ｎ中に溶
解することにより調製した。

Ｅ）混Ｕ椹ｍ ＧｕＳＣＮ１２０ｌ？をＬ２１１衝液１００ｍｌ中に（
６０℃の水浴中で静かに振盪させて）溶解し、次いで０
．２Ｍ　ＥＤＴ＾ｐ　Ｉｔ　８　２　２　ｍ　ｌ及びＴ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｐａｃｋａｒｄ）２．８１Ｆ
を加え、次に溶液を均質化することにより、溶解用ｗｔ
街液Ｌ６を調製した。

計邂』Ｈ（』腋↓Ｑ Ｋｌ（ヨウ化カリウム、Ｍｅｒｃｋ）１２．４５ｙをＬ
２１Ｊｊ街１２５ｍＮ’中に（４０゜Ｃの水浴中で静か
に振盪させて）溶解し、次いで０．２Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐ
｝１８．０）５．５ｍＮ及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　７８９７０４）０．６５ｙを
加え、最後にこの溶液を均質化することにより、溶解用
緩ＦＩＴ液Ｌ６車を調製した。同じ方法を適用してＮａ
ｐ（ヨウ化ナトリウム、Ｍｅｒｃｋ）を含む溶解用緩衝
液Ｌ６本、及びＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム、
Ｉｌａｋｅｒ）を含む溶解用緩衝液Ｌ６＊を調製した。

Ｋｌ及び尿素を併有する溶解用緩衝液Ｌ６車を、Ｋｌ（
ヨウ化カリウム、Ｍｅｒｃｋ）１２．４５＃及び尿素（
Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）１２．０ｇをＬ２緩衝液２５社中
に溶解することにより調製した．次いで、０．２Ｍ　Ｅ
ＤＴ八（ｐＨ８．０）５．５ｎ＋１及びＴｒｉｔｏｎ　
Ｘ−１００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）０．６５ｇを加え
、この混合物を均質化した。同じ方法を使用してＭａｌ
／尿素及びＮａＳＣＮ／尿素を調製した。

Ｆ）′　　　　　・ＧＥＤＴ＾ ＧＥＤＴ＾とは、ＧｕＳＣＮ　　１２０ｇを０．２Ｍ　
ＥＤＴ八ｐＨ８　　ＬＯＯｍＮ中に溶解した溶液を意味
する。

Ｇ）ＴＥ榎ｌ迩 溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）に適した緩衝液は、所望であれ
ばＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５Ｕ／ｐｆｆｉ
を含有する、ｐｌ＋７．５の１０ｍＨ　Ｔｒｉｓ．Ｃ１
、１ｌＭ　ＥＤＴ＾溶液（ＴＥ［衝液）である。

１１）筬ｌＩ 溶解用緩衝液９００ｔｔｌ及びＮＡキャリャくラテック
スビーズもしくはＳＣのごときシリカ、または珪藻土）
４０ｖ１をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｆ遠心分離管（タイプ
３８１０、１．５ｍｌ）に加えることにより、抽出過程
と同じ日に試験管を準備した。

■）洗１１法 洗浄液１ｍｌを加え、次いでベレットが再度懸濁するま
で渦形成し、１２０００ｘ　ｇで１５秒間遠心分離し、
更に吸引によって上澄みを廃棄することにより、ベレッ
トを洗浄した。

Ｊ）１世方韮 溶出は、少なくとも２５ｕ１、好ましくは少なくとも４
０．１の溶出用ＭＷ液を加え、短時間（２秒間）渦形成
し、５６℃で１０分間インキュベ−１・することにより
実施した． Ｋ）プロトコルＢ このプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料からｄｓＤＮ＾を単離するのに適し
ており、ＧＥＤＴＡ　ｓｏｏｕ１及びＳＣ　４０．１を
含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ試験管を使用した。

１．ペレットが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、 ２．出発材料（例えば血清、全血、便または尿）５０１
１１を加え、直ぐに渦形成して（５〜１０秒間）均質化
し、 ３，室温に１０分間放置し、５秒間渦形成し、４．　１
２０００ｘ　ｇで１５秒間遠心分離し、吸引によって上
澄みを廃棄し、 ５、ペレットをＧＥＤＴ＾で１回洗浄し、６．ペレット
を７０％エタノールで２回洗浄し、７．ベレットをアセ
トンで１回洗浄し、８．ペレットを、蓋を開放して５６
℃で１０分間乾燥し、９．　ＲＮＡｓｉｎを含まないＴ
ＥＩＩ　ｌ液５０，ｆを用いてＮ＾を溶出し、 １０．　１２０００ｘ　ｇで２分間遠心分離すると、上
澄みはＮ＾を含有した。

Ｌ．プロトコルＹ このプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料からＮ＾を単離する〈同時にｄｓＤ
Ｎ＾、ｓｓＤＮＡ，　ｄｓＲＮＡ及びｓ　ｓ　Ｒ　ＮＡ
を精製する）のに適しており、Ｌ６　９００μ！及びＳ
Ｃ　４０．１を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｆ試験管を使
用した。

１．ペレットが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、 ２．出発材料（血清、全血、便または尿）５０．１を加
え、直ぐに渦形成（約５秒間）して均質化し、３，室温
に１０分間放置し、５秒間渦形成し、４．　１２０００
ｘ　ｇで１５秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを廃
棄し、 ５．ベレッ１〜をＬ２で２回洗浄し、 ６，ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、７，ペ
レットをアセトンで１回洗浄し、８．ペレットを、蓋を
開放して５６℃で１０分間乾燥し、 ９．必要によってはＲＮＡｓｉｎの存在下に、ＴＥ｝Ｉ
街ｉ５０パを用いてＮ＾を溶出し、 １０．　１２０００ｘ　ｇで２分間遠心分離すると、上
澄みはＮ＾を含有した． 乙ジΣユ玄叩 このプロトコルは、ヒト血清、尿またはバクテリア培養
液といった複合出発材料からＮ＾を単離するのに適して
いる。

方法： Ｌ６寧９００Ｉ１１及びＳＣ　４０９１を含むＥｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ　ｆ試験管を使用した。

１．ペレ・ソトが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、 ２．出発材料（血清一プラスミド、尿一プラスミド混合
物または一晩培養したバクテリア培養液）５０μｌを加
え、直ぐに渦形成（５秒間）して均質化し、３，混合し
ながら室温に１０分間放置し、４．　１４，０００　，
で１５秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを廃棄し、 ５．ペレットをＬ２車洗浄液で２回洗浄し、６．ベレッ
トを７０％エタノールで２回洗浄し、７．ベレットをア
セトンで１回洗浄゛し、８．ペレットを、蓋を開放して
５６゜Ｃで１０分間乾燥し、 ９，必要によってはＲＮＡｓｉｎの存在下に、ＴＥ緩ｆ
ｉ液（１０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ　−　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　
ｐｌｌ８．０）５０ｕｌを用いてＮ＾を溶出し、 １０．　１４，０００　ｇで２分間遠心分離すると、上
澄みはＮ八を含有した。

プロトコルＹ＊本 このプロトコルは、カオ１〜口ビック物質としてのＧｕ
ＳＣＮ、及びＮ＾を結合できるフィルター（材料及び方
法の項参照）の存在下に、Ｎ＾を単離するのに適してい
る。Ｎ＾検出は、このフィルターをポリメラーゼ連鎖反
応混合物に直接適用することによる、ポリメラーゼ連鎖
反応によって実施し、従ってフィルターからＮ＾を予め
溶出しない。

方法： Ｌ６溶解用緩衝液９００ｐｌ及びフィルター（寸法ｌｃ
ｍ／ｉｃｍ）を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ試験管を使用
した。

ｌ．核酸含有溶液５０１を加え、試験管を短時間渦形成
し、 ２．混合しながら室温に１０分間放置し、３．上澄みを
廃棄し， ４、フィルターをＬ２洗浄液で２回洗浄し、５．フィル
ターを７０％エタノールで２回洗浄し、６．フィルター
を、蓋を開放して５６℃で１０分間乾燥し、 ７．フィルターの小片をポリメラーゼ連鎖反応溶液に直
接加えた。

Ｈ》乙主Σユルｌ このプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料から貼を単離するのに適しており、
Ｌ５　９００ｐ／及びＳＣ　４０，１を含むＥｐｐｅｎ
ｄｏｒｆ　ｆ試験管を使用した．単離したＮ＾はハイブ
リッド形成反応に使用すること゛ができるが、制限酵素
に対する基質としてはやや適当でない．しかしながらＴ
４　ＤＮ＾リガーゼは活性である。プロトコルＹと比較
してプロトコルＺではＮ＾の収率が高くなる。

１．ベレッｌ−が再度懸濁するまで試験管に渦形成し、 ２．出発材料（血清、全血、便または尿）５０，Ｚを加
え、直ぐに渦形成（約５秒間）して均質化し、３，室温
に１０分間放置し，５秒間渦形成し、４．　１２０００
ｘ　ｇで１５秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを廃
棄し、 ５．ペレットをＬ２で２回洗浄し、 ６．ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、７．ベ
レットをアセトンで１回洗浄し、８．ペレットを、藍を
開放して５６℃で１０分間乾燥し、 ９．必要によってはＲＮＡｓｉｎの存在下で、ＴＥ緩衝
液５０，Ｚを用いてＮ＾を溶出し、 １０．　１２０００ｘ　ＩＦで２分間遠心分雛すると、
上澄みは貼を含有した。

Ｎ）匠ＩＬＬＩ 実施例は，出発材料の性質に応じて（特にセクションＡ
〜Ｄ）、以下のようなセクションに分割した． セクションＡ：ヒト血清 セクションＢ：ヒト全血 セクションＣ：ヒ１・尿 上記セクションＡ，Ｂ及びＣは特に、ｄｓＤＮ＾及びｓ
ｓＲＮＡの両方を純粋形態で単離できることを示す意味
がある。

セクションＤ：ヒト便 このセクションＤは、特にｄｓＲＮＡも単離できること
を示す． セクションＥ：一重鎖ＤＮＡ このセクションＥは、本発明が、ｓｓＤＮ＾を単離する
ために使用できることを示す実験からなる。

セクションＦ：珪藻土 このセクションＦは、珪藻土の骨格が本発明に使用する
シリカ粒子として非常は有効であ，ることを示す．更に
、本発明が、種々のダラム陰性菌からＮ＾を単離するた
めに使用できることも示す。

セクションＧは、種々のカオトロピック物質を使用し、
細菌細胞からＮ＾を精製できることを示す。

セクション［Ｉ及びＩは、別の固相を使用するＤＮ八の
単離を示す。

常に５０，ｆの量で使用した。セクションＢ及びＦに使
用した血液は常に、凝固を防止するためにＥＤＴ八の存
在下に採取した鮮血とした（Ｔｅｒｕｍｏ　Ｎ．Ｖ．，
Ｌｏｕｖａｉｎ，ベルギーのＶｅｎｏｊｅｃｔ装置、タ
イブＶＴ−５７４ＴＫＺの採取管を使用）。他のセクシ
ョンに使用した出発材料（血清、尿及び便）は冷凍物で
あった。

実施例＾１、＾２、＾３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ７及び
Ｆ１において、血清または血液は同じ被検体由来であっ
た。

０）肛例去丑 ゲル電気泳動調査に対して、溶出した呈のＮ＾の一部を
、＾ａｉｊ及びＢｏｒｓｔが記載した（Ｂｉｏｃｈｉｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．＾ｅｔａ　２６９，１９７２．１９
２）緩衝液系に臭化エチジウムｌＩＩｇ／ｍｌを含有す
る中性アガロースゲル上にロードした。ゲルにＵ■照射
して写真撮影した。

いくつかの実験において、既知量の精製ＤＮ＾（インプ
ットＤＮＡ）を臨床試料に加えた。これらのケースにお
いて、抽出効率１００％に対応する量のインプットＤＮ
＾を同じゲルにロードした。

Ｉｓｈ−ｔｌｏｒｏｗｉｃｚ及びＩｌｕｒｋｅが記載し
たように（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．９，
１９８１．２９８９）、ＥｓｃｈｅｒｉｃｂｉａＣｏｌ
ｉ　１１８１０１から細菌ブラスミドＤＮＡを精製し、
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　２Ｂ（ＰｈａｒＩＩＩａｃ
ｉａ，Ｉｎｃ．）を用いたカラムクロマトグラフィーに
かけ、エタノールで沈澱させた，　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及
びＤｏｌｙが記載したように（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ
．ら，Ｎｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣＳＩＩ
，ニューヨーク）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　Ｃｏｌ
ｉ　ＪＭ１０１（Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎ８Ｒｅｃ．ＤＮＡ　
Ｔｅｃｈｎ．Ｂｕｌｌ．２：４３−４８（１９７９））
から細菌プラスミドＤＮＡを精製した。ｐｃＭＶ−Ｅは
、２ｋｂベクターｐＨＣ　６２４（Ｂｏｒｏｓ　ｉｎ　
ｇｅｎｅ　３０，１９８４．２５７）においてクローニ
ングされた０．４ｋｂヒ１・サイトメガロウイルスＤＮ
Ａ断片を含み、ｐＥＢＶ−１０は、同じベクターにおい
てクローニングされた０．９ｋｂ　Ｅｐｓｔｅｉｎ　［
ｌａｒｒウイルスＤＮＡ断片を含む。緩和環状（Ｃｌｌ
）分子（ｒｅｌａｘｅｄｃｉｒｃｕｌａｒ　ＩＩｌｏｌ
ｅｃｕｌｅｓ）を豊富に含むプラスミド調製物を得るた
めに、ｐＥＢＶ−１０　ＤＮＡ（２．９ｋｂ）をＤＮＡ
ｓｅで処理した。成分■分子は、３　．　２　ｋ　ｂ　
緩和環状［ＩＮ八分子としてビリオン中に存在するＢ型
肝炎ウイルスＤＮＡの精製のためのモデルの役目をする
。

ｐＧｅｍ３ｐ２４は１．４５ｋｂ　ＨＩＶ配列を含むが
、ｐＧｅｍ３ｐ２４の横成は以下に記述する。

ＩＩＩＶ　ＨｘＢ２　ＤＮ＾の配列は数人が記述してい
る（Ｊ．Ｖｉｒｏ１，６１，６３３−６３７（１９８７
）；Ｎａｔｕｒｅ　３２６，７１１−７１３（１９８７
）　；＾ｉｄｓ　Ｒｅｓ．ＩＩｕｍ．ＲｅＬｒｏｖｉｒ
ｕｓ　３，４１−５５（１９８７）；＾ｉｄｓ　Ｒｅｓ
．ｌＩｕｎ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　３，３３−３９（
１９８７）及びＳｉｅｎｃｅ　２３７，Ｂ８８−８９３
（１９８７））。

Ｉ１１Ｖ　ＨｘＢ２　ＤＮ＾の一部をＦｏｋ　ｌで，も
とのＩＩ　Ｉ　Ｖ　Ｉｔ　ｘ　Ｂ２配列の１１８９及び
２６１３部位で切断した。ヌクレオチド番号は遺伝子バ
ンク指定を参照されたい。

このフラグメントのＦｏｋ　［部位を、クレノウ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）ＤＮ＾ボリメラーゼ（Ｈａｎｉａｔｉａｓ．
上記参照）を使用して充填し、ブラスミドｐＵｃ−１９
のポリリンカーＳ＋＊ａ　１部位においてクローニング
した（Ｍａｎｉａｔｉａｓ，前記参照）。ＩＩ　Ｉ　Ｖ
　１１　ｘ　Ｂ　２　Ｄ　Ｎ＾フラグメンｌ・を担う得
られたブラスミドをｐＵｃ１９−ｐ２４と称した。

プラスミドｐＧｅｍ３ｐ２４を得るために、ｐＵｃ１９
−ｐ２４の１４５０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ旧フラグ
メントをＥｃｏＲＩ−Ｂａ＋ｎｔｌＩ消化ベクターｐＧ
ｅｍ３においてクローニングした（２８６７ｂｐ；ｌ’
ｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ　ＵＳ＾）。

ＰＣＲ法に使用したブライマーをオリゴシンセサイザー
（ｏ１　ｉｇｏ−ｓｙｎｔｌｉｅｓｉｚｅｒ）装置（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製）において合成し
た。プライマーＥＳ４７（２５ｍｅｒ）及びＥＳ７５（
４７ｍｅｒ）のヌクレオチド配列を以下に示す。

ｌＥｓ４７ ＾ＣＡ（：（：Ａ（：ＣＡＧ　　ＡＴＧ八Ｔ八ＣＡＧＴ
　　ＡＴＴＡ（：ＥＳ７５ ほとんどのＲＮＡ単離実験において（実施例＾３、Ｂ５
、Ｂ６、Ｂ７、Ｃ２、Ｄ１、Ｅ１、Ｆ１及びＦ２）、精
製過程の間のＲＮΔの分解を回避するために溶出用緩衝
液中にＲＮＡｓｉｎを任意的に使用する以外には、予防
策を講じなかった。臨床試料を試験管に付加する際にの
み手袋をはめ、試薬の調製に対してはＲＮＡｓｅ阻害剤
を使用せず、オートクレープ処理しないＥｐｐｅｎｄｏ
ｒｆｆ容器及びビペツ１・チップを使用した。特に実施
例Ｆ１及びＦ２は、溶出の際のＲＮＡｓ　ｉ　ｎの存在
は厳密には必要でないことを示した。

使用した酵素は市場入手可能であり、製造業者が推奨す
るままに使用した。ＲＮＡｓｅ＾同様に全ての制限酵素
Ｔ４リガーゼ及びＡＭＶ逆転写酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製であった．″：！］Ｉ　−
　Ｄ　Ｎ　八ボリメラーゼはＣｅｔｕｓ　Ｉｎｃ製とし
た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＰｅｒｋｉｎ　
ＥＩ＋ｎｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮ八一熱循環器を用いて
実施した。

種々の用途に対しては、本発明の方法に使用する試薬、
特にＮ＾キャリャー（例えばシリカ粒子）及びカオトロ
ピック物質を含む溶解用及び洗浄用緩衝液は、核酸（例
えばＮΔ含有の細菌またはウイルス）によって汚染され
るべきではないことは基本的に重要である。これは、Ｎ
＾キャリャーに対しては、これをオートクレープ内で１
２１℃で２０分間加熱することにより保証され得る。し
がしながら、この方法はＧｕＳＣＮ含有の溶解用及び洗
浄用緩衝液（（；ＥＤＴ＾、Ｌ５、Ｌ６及びＬ２）にお
いては、活性が失われる可能性があること、及び環境に
対する付随的な危険性があることから有効ではない。上
記試薬を（出来る限り）核酸を含有しないようにするた
めに、かかる試薬を本発明のシリカ粒子のカラムに通す
ことができる。ＧｕＳＣＮ含有緩衝液の溶解（Ｉｙｓｉ
ｎｇ）特性、及びカオトロピック物質ＧｕＳＣＨの存在
下にＮ＾を結合するシリカの特性に起因し、かかる方法
でＮ＾非含有の緩衝液が得られる。カラム自体は、例え
ば５００℃またはそれ以上で１時間以上加熱することに
より、核酸非含有にすることができる。

Ｐ）ＤＮＡタイプ ＣＩ：共有結合閉環状ＤＮ＾（プラスミド》、Ｃｌｌ　
　　：緩和くニック）環状ＤＮ＾（プラスミド）、ＣＩ
目　：線状ＤＮ＾（線状化プラスミド）、ＬＭＷ　　：
低分子旦ＤＮ＾（＜０．５ｋｂ）．ｐｌｌＣ　６２４の
石■消化、４７１ｂｐ、４０４ｂｐ、２４２ｂｐ（２フ
ラグメント）、１９０ｂｐ、１４７ｂｐ、１１０ｂｐ、
６７ｂｐのフラグメント及び数個のより小さい不定長の
フラグメン１・、 ＭＭｌｌ１＝中分子．ｉＤＮ＾（０．５〜２９ｋｂ）　
；ファージλＤＮＡのＩ１ｉｏｄｌ消化、２３ｋｂ、９
．４ｋｂ、６．７ｋｂ、４．４ｋｂ、２．３ｋｂ、２．
Ｏｋｂ及び０．５８ｋｂのフラグメント、 ＨＭＷ ：高分子ｉＬＤＮ＾（＞　２９ｋｂ）、ｓｓＤＮ＾：フ
ァージ８１３ｓ＋ｐ９一重鎖ＤＮＡ（ＢｏｅｂｒｉｎＦ
１ｅｒ）。

（以下余白） セクションＡ：ヒトの血　からのＤＮ＾／ＲＮＡの精ヒ
トの血清には例えばウイルス又は細菌中にＮ＾が存在し
得る。これらの有機体は共に遊離形憇で生じ得、更には
免疫複合物中に結合して生じ得る。

Ｎ＾の量は通常非常に少ないので、アガロースゲル電気
泳動及びエチジウムブロミド／Ｎ＾複合体の紫外線照射
を通じての検出は不可能である。ＤＮ八をヒトの血清か
ら精製できることを示すために、微量の精製ＯＮ八を血
清に加え、次いでプロトコルＢに基づいてＤＮＡを単離
した（実施例＾１．＾２）。ＤＮＡ及びＲＮＡをヒトの
血清から同時に精製できることを示すために、培養した
噛乳動物細胞又は《小さなプラスミドを有する》細菌を
血清に加え、次いでプロトコルＹに基づいてＮ＾を単離
した《実施例＾３》．最後に実施例八４は、プロトコル
Ｙによりヒトの血清に存在するＲＮＡを旧Ｖ（ヒトの免
疫不全ウイルス）から精製でき、またＰＣＲ法により検
出できることを示している．実施例＾５は、ヒトの血清
中のＤＮＡをプロトコルＹ＊により、核酸結合性固相と
してのシリカと共に種々のカオトロピック物質を使用し
て精製できることを示している。

＾１：ヒトの血　からのＤＮＡの ヒトの血清（５００μ１）を既知量の精製ＤＮＡ［１０
０μ！ＬＨｌ４　（４５μｇ）、２０μｌ　ＭＭＭ（２
０μｇ）、４０μｌ　ＣＩ／ＩＩ（２０μｇ）］と混合
し、１０個の６６μ！試料をプロトコルＢに基づき１０
個のＤＮＡ抽出物用インプット材料（ｉｎｐｕｔ　ｍａ
ｔｅｒｉａｌ）として使用した。この実験では試験管中
に存在するＳＣ（Ｓｉｌｉｃａ　Ｃｏａｒｓｅの懸濁液
）の量を２．５〜４０μ！で変動させた。抽出を二重に
実施し、各試料からの溶離ＤＮ＾の半分（３０μｌ）を
１％アガロースゲルを支持体とする電気泳動にかけた。

比較として、インプットＤＮＡの半分の量を同様にコン
トロールレーン（ｌａｎｅｓ）の同一ゲル上にロードし
た． ＳＣの量が１０μｌを越えると、二重鎮ＤＮＡ、線状（
２３ｋｂ〜約６０ｂｐ）共有結合閉鎖（ＣＩ）ＤＮＡも
緩和環状（Ｃｌｌ）ＤＮＡも効率的に単離された。最大
８８１１フラグメント（約２３ｋｂ）の収率はより小さ
なフラグメントと比較して比較的低いようである．この
ことは他の実験から考慮すると、分子量の大きいフラグ
メントのせん断のせいであろう。

コントロールレーンはそれぞれ、１００％の抽出効率の
場合のＬ１４Ｗ，Ｃｌｌ／ＣＩ及び８８１１１　０Ｎ＾
の量を示している．前述した如（、Ｃｌｌに富む（ＤＮ
Ａｓｅ　Ｉで処理した）３ｋｂプラスミド（ｐＥＢＶ−
１０）をインプット材料として使用した． ること 精製ＤＮＡ調製物を５０μｌのヒトの血清試料１２個に
加えた．プロトコルＢに基づいてこれら１２個の混合物
からＤＮＡを単離した。５０μ！のＴＥで溶離を実施し
た。溶離したＤＨ八の半分を以下の３種の制限酵素：石
Ｒｌ，ＢａｍＨ！，川Ｉ１（これらはそれぞれ低塩、中
塩及び高塩ＭＷＩ液で活性を有する）のいずれかで（二
重に》処理するか、Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼで処理するか
、又は処理しなかった，　ＤＮ＾試料を１％アガロース
ゲルを支持体とする電気泳動にかけ、紫外線照射により
可視化した． Ｔ４リガーゼ処理（３７℃で１時間、３０μｌの反応容
量中に３単位のＴ４リガーゼ）の結果は、ＤＮ八フラグ
メントの分子量のシフトを示すと共に、ヒトの血清から
単離したＤＨ八がエキソヌクレオリティックな（ｅｘｏ
ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）分解の影響をそれほど受けな
いことを示している。

精製７”ラＸ　ミト（ｐｃＭＶ−Ｅ；　３．Ｌｔｚｇ；
　ｌ．５μ１）を加えた８個の血清試料の結果はそれぞ
れ、ＥｃｏＲＩ、Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ　Ｉ　，ＬＬ！　Ｉ　
Ｉダイジェストに対して総ての制限酵素がプラスミドを
線状化したことを示している。

総ての制限酵素は９単位の酵素と共に、３７℃で１時間
３０μｌの反応容量中でインキユベートした。

＾３：ヒトの血　からのＤＮ＾　びｓｓＲＮＡの特」（
原 ヒトの血清にはく例えばウイルス、細菌又は細胞中に》
、エチジウムブロミドで染色したゲルの紫外線照射によ
っては検出することのできない非常に少量のＲＮＡしか
存在しないので、外因性ＲＮＡ源をヒトの血清試料に加
えた．ｒ＠乳動物の細胞又は細菌を外因性ＲＮＡ源とし
て使用した。プロトコルＹに基づいてＮ＾を試料から単
離し、ＲＮＡｓｅ＾（４０ｎｇ／μｌの溶離用緩衝液）
の存在下で又は不在下で、０．５Ｕ／μ／のＲＮＡｓｉ
ｎを含む５０ｔｔｌのＴＥで溶離した．１％アガロース
ゲルを支持体とするその後の電気泳動の結果は、ＲＮＡ
及びＤＮ＾が検出できることを示している．５０μｌの
血清試料に対して加えた噛乳動物の細胞は５Ｘ１０’ラ
ット１０Ｂ細胞（Ｂｏｏｍ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ
．　６９，１９８８．１１７９）であり，５０μ１の血
清に対して加えた細菌はプラスミドｐｃＭＶ−Ｅを含む
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株ＨＢＩＯμｍの１００μｌ一晩培養
物の細胞ベレットであった． ＾４：ヒトの血　から単離したヒトの プロトコルＹに基づいて各々が５０μｌのヒトの血清試
料２個（患者Ｆ，Ｈ）からＮ＾（７５μ！）を単離した
。患者Ｆの血清は（＾ｂｂｏｔｔ研究所のＩＩＩＶ　Ｐ
２４抗原固相免疫検定法に基づく》多量（２７００ｐｇ
／伯ｌ》のＨｆｖ抗原Ｐ２４を含んでいたが、（＾ｂｂ
ｏｔｔ研究所のＩＩＩＶ抗体ＥＩｊＳ＾に基づ（）ｔｌ
ｒＶ抗体に対しては陰性であった．患者Ｈの血清は両方
の試験で陰性であった．単離したＮ＾の一部（４３μ１
）を３７℃で９０分ＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；１０　ＤＮＡｓｅ／，ｕｆ）で
処理した。エタノールでの沈澱及び６８℃で１５分間の
熱不活化の後に、ＲＮ八を１５μｌのＴＥＭ街液に懸濁
した。

このＲＮＡＩＩ製物の一部５μｌを、ＨＩＶ特異的プラ
イマーの存在下において、０．４ｔｌ／μｌの＾ＭＹ逆
転写酵素（４２℃で３０分；反応容量２０μ１）で処理
するか又は処理しなかった．次いで、ｄＮＴＰｓを含む
８０μｌの１．２５　Ｘ濃縮ＰＣＲｉｌ街液を加えて、
反応容量を１００μｌにした，　ＩＵの論−　Ｄ　Ｎ　
Ａポリメラーゼを加えて、増幅を開始した（ｌサイクル
は９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間か
らなる》．２０、２５、３０、３５サイクルで反応混合
物から１０Ｊ．Ｌ１のアリコートを採取して、２％アガ
ロースゲルに適用した．逆転写酵素で処理した患者Ｆの
ＲＮ八については既に２５サイクル後に予期される３３
０　ｂｐ　ＨＩＶアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）フ
ラグメントが確認され、ＨＩＶＲＮＡが患者の血清に存
在することを示唆していた．抽出後に、各試料から溶離
したＤＮ＾の２５％を０，８％アガロースゲル上で分析
した。プラスミドＤＮＡ回収の定量化を可能とするため
に、インプットＤＮＡを同様に同一ゲル上に直接ロード
した。

電気泳動後にゲルを紫外線照射下で撮影し、ＤＮＡ回収
効率をブラスミド帯強度（表＾５．１の表の説明を参照
）を基に視覚的に評価した． カオトロピック物質としてＮａｌ及びＮａＳＣＮを使用
して、同様に実験を実施した（下記の試料の説明を参照
）． ５０μｌのヒトの血清試料１０個を、ＣＩ及びＣｌｌ形
態（方法の項参照）からなるそれぞれが１０μｇの精製
ｐＧｅｍ３ｐ２４　ＤＮＡと混合した．これら１０個の
１ラスミド／血清混合物を、プロトコルＹ＊に基づいて
抽出用インプット材料として使用した。使用した力オト
ロビック物質の濃度については表＾５．１を参照のこと
． 表の説明： 表に記載のカオトロピック物質を使用して、前述したよ
うに１０個の検出可能試料を製造した。

：回収されない。

±：ほとんど回収されない． ＋：目に見えるほど回収される． ＋＋：定量的に回収される． 表＾５．１での結果は、８Ｍ尿素を組み合わせた３Ｍκ
Ｉ、３８　Ｍａｌ又は３８　ＮａＳＣＮをカオトロピッ
ク物質として使用すると、共有結合閉鎖（ＣＩ）及び緩
和環状（Ｃｌｌ）ｐＧｅｍ３ｐ２４　ＤＮ＾が効率的に
単離されることを示している。Ｃｌｌの収率はＣＩと比
較して比較的高いようである． セクションＢ：ヒトの全血からのＤＮＡ　ＲＮＡの１＋
ａ１のヒトの血液は、核生成せず従って血液のＮ＾量に
寄与しない約５Ｘ１０”の赤血球を含んでいる。

血液のＮ＾量は主に白血球細胞（約４−１０×１０’／
ｍ１）により決定される。多量のタンパク質（血液中、
約７０Ｂ／ｍｌ）を含む水性媒体（血漿）にこれらの細
胞が埋め込まれている。従って、全血はＮ＾精製にとっ
て極めて不純な源である。セクションＢの実施例は、に
もかかわらすＮ＾をプロトコルＢ及びＹにより全血から
単離することができることを示している． Ｂ１：ヒトの全血からのＤＮ八の ヒトの血液（５００μ１）を、既知量の精製ＤＨ＾［１
００μｌのＬＭＷ（４５μｇ》、８０μｌのＣｌ／ＩＩ
（４０μｇ）］と混合し、６８μｌの試料１０個をプロ
トコルＢにおける１０個のＤＮＡ抽出用インプット材料
として使用した．この実験では、試験管に存在するＳＣ
（シリカ粗材の懸濁液）の量を２．５〜４０μｌの間で
変動させた．抽出を二重に行い、各試料からの溶離ＯＮ
＾の半分（３０μ１）を、１％アガロースゲルを支持体
とする電気泳動にかけた．比較のために、インプットＤ
Ｎ＾の半分の量を同様に同一ゲル上にロードした．１０
μｌを越えるＳＣを使用すると、二重鎖ＤＮＡ、線状共
有結合閉鎖（ＣＩ）ＤＮＡも緩和環状（ＣＩＩ）ＤＮＡ
もヒトの全血から効率的に単離された．全血から回収さ
れるＤＮＡの量は、約１０μｐまではＳＣの量に比例し
ていた．量が多くなると飽和するようである．精製ＤＮ
Ａ調製物を、５０μｌのヒトの血液試料１２個に加えた
．プロトコルＢに従ってこれら１２個の混合物からＤＮ
Ａを単離した。５０μｌのＴＥで溶離が生じた．溶離し
たＤＮＡの半分を以下の３種の制限酵素：　ＥｃｏＲＩ
，［ｌａｍｌｌｌ追ｄＩＩ（これらはそれぞれ低塩、中
塩及び高塩緩衝液で活性を有する）のいずれか１つで処
理するか、Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼで処理するか、又は処
理しなかった，　ＤＮＡ試料を１％アガロースゲルを支
持体とする電気泳動にかけ、紫外線照射により可視化し
た． Ｔ４リガーゼ処理（３７℃で１時間、３０μｌの反応容
量中に３単位のＴ４リガーゼ）の結果は、ＤＮＡフラグ
メントの分子量の増加を示すと共に、ヒトの血液から単
離したＤＮ＾がエキソヌクレオリティックな分解の影響
をそれほど受けないことを示している。

精製７”ラスミＦ（ｐｃＭＶ−Ｅ；　３．３μＨ；　１
．５μｆｆｉ）を加えた８個の血液試料の結果はそれぞ
れ、ＥｃｏＲＩ、石旧，ＬＩＬＵＩ　Ｉダイジェストに
対して、総ての制限酵素がプラスミドを線状化したこと
を示している。

総ての制限酵素は９単位の酵素と共に、３７℃で１時間
３０μｌの反応容量中でインキユベートした。

Ｂ３：１０　　の　ｔる血　　　からのＤＮ＾のＩ この実施例では、血液バンクから無作為に選択したヒト
の血液の異なる１０個の試料を出発材料として使用した
。各試料において白血球細胞（ＷＢＣ）の数は知られて
いた．プロトコルＢに従って５０μｌの試料からＤＮＡ
を精製し、７５μｌのＴＥで溶離が生じた．単離したＤ
ＮＡの三分のーを１％アガロースゲルに直接適用し、残
余部分（２μ！）をＰＣＲ用に使用した。

３μｌのＬＭＩＩＩ−ＤＮ＾（６μｇ》を５０μｌの各
試料に加えた後に、同一の試料で同一の単離作業を゛実
施した．この場合も２５μ１の溶出液（ｅｌｕａｔｅ）
（７５）ｔ　ｌ）をゲルに直接適用した．２５μｌの溶
出液の他の部分を最初に７４　ＤＮＡリガーゼで処理し
く３７℃で１時間、３０μｌの反応容量中に２１３）、
次いで同一ゲルに適用した． 血液試料１〜１０の白血球細胞（ＷＢＣ）の含量は以下
の通りであった． １　　　　　　　　４，９　　　　　　　６　　　　　
　　　８．３２　　　　　　　　５．１　　　　　　　
７　　　　　　　　８．５３　　　　　　　　５．９　
　　　　　　８　　　　　　　　９．２４　　　　　　
　　６．７　　　　　　　９　　　　　　　１０．３５
　　　　　　　　７．７　　　　　　　１０　　　　　
　　１０．５プロトコルＢに基づいてヒトの全血から単
離したＤＮＡがＴＪ　−　Ｄ　ＮＡポリメラーゼに対し
て良好な基質であることを示すために、実施例Ｂ３に従
って１０個の異なる血液試料から単離した２μｐのＤＮ
八を、βグロビン特異的ブライマーを含むＰＣＲで処理
した。

ＰＣＲは３２サイクルからなり、各サイクルは９４゜Ｃ
で１分間、次いで６５℃で３分間であった。アンプリマ
ーの一部《５０％》を２％アガロースゲルを支持体とす
る電気泳動にかけた。１２０　ｂｐのアンブリマー及び
ブライマー帯を検出することができた。

Ｂ５：ヒトの血　からのＤＮ＾　びｓｓＲＮＡのＢ７：
ヒトの血　からのＤＮ＾　びｓｓＲＮＡの同ＤＮＡ及び
ＲＮＡを再現し得る形でヒトの血液から精製できること
を示すために、一人のヒトから得た各々が５０μｌの６
個の血液試料をプロトコルＹに基づいて処理し、ＲＮＡ
ｓｉｎ（０．５Ｕ／，ｃｚ　１）を含む７５μ１のＴＥ
でＮ＾を溶離した．溶出液の一部２５μｌを中性１％ア
ガロースゲルに適用して、電気泳動にかけた。結果は、
ＤＮＡ及びＲＮＡが検出できることを示している． １０人の異なるヒトから得た５０μｌの血液試料（実施
例Ｂ３参照）をプロトコルＹに基づいて処理し、０．５
Ｕ＃ｚ　１のＲＮＡｓｉｎを含む４０μｌのＴＥでＮ＾
を溶離した．溶出液の一部３０μＩを中性１％アガロー
スゲルを支持体とする電気泳動にかけた。結果は、ＤＮ
＾及びＲＮＡが検出できることを示している．外因性Ｒ
ＮＡ源をヒトの血液試料に加えた。噛乳動物の細胞又は
細菌を外因性ＲＮＡ源として使用した。プロトコルＹに
基づいて試料からＮ＾を単離し、ＲＮＡｓｅ＾＜４０ｎ
ｇ／ｔｔ　１の溶離用＃ＩＬｌ液》の不存在下又は存在
下において、５０μＩＴＥ　＋０．５　Ｕ／μｌＲＮＡ
ｓｉｎで溶離した。５０μｌの血液試料に対して５Ｘ１
０’ラ・ント１０Ｂ細胞（Ｂｏｏ＋ａ等、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．　６９，１９８８．１１７９）を噛乳動物
細胞として加え、５０μｌの血液に対し”Ｃ　７　ラス
ミＦ　ｐｃＭＶ−Ｅを含ｔｊＥ．ｃｏｌｉ細胞株Ｈｔｌ
１０１ノ１００μ！一晩培養物の細胞ペレットを細菌と
して加えた． 結果は、噛乳動物のｓｓＲＮＡ（１８Ｓ及び２８Ｓリボ
ソー十も ムＲＮＡ）も細菌＠　ｓ　ｓ　Ｒ　Ｎ＾（１６Ｓ及び２
３ＳリポソームＲＮＡ）もヒトの全血から精製され得る
ことを示している。

更には、ゲノムＤＮ＾及びブラスミド（形態Ｉ　）ＤＮ
＾が効率的に回収される。

セクションＣ：ヒト尿からのＤＮＡ／ＲＮＡ　　製ヒト
の尿ではＮ＾は、例えばウイルスまたは細菌中や尿路由
来の細胞中に存在し得る。量は普通、エチジウムブロミ
ド／Ｎ＾複合体のアガロースゲル電気泳動及びＵｖ照射
による検出が不可能なほど少ない．ヒト尿からＤＨ八を
精製し得ることを示すために、マイクログラム量の精製
ＤＮＡを尿に添加し、続いてプロｌ・コルＢに従ってＤ
ＮＡを単廻したく実施例Ｃ１）．ヒト尿からＤＮＡとＲ
ＮＡとを同時に精製し得ることを示すために、培養した
細菌（小ブラスミド保有》を尿に添加し、続いてＮ＾を
プロトコルＹに従って単離した（実施例Ｃ２）。

実施例Ｃ３は、プロトコルＹ本により核酸結合性固相と
してシリカと共に、ＧｕＳＣＮに替えてＫｌ、Ｎａｒ及
びＮａＳＣＮのような別のカオトロピック物質を用いて
もヒト尿からＤＮＡを精製し得ることを示す．Ｃ１：ヒ
ト尿からのＤＮＡ ３μ１のＬＭＷ　ＤＮ＾（６μｇ》を、任意に選択した
１０の、様々な混濁度の５０μ１ヒト尿試料に添加した
（試料第４号、第５号、第６号及び第７号は澄明であり
、試料第１号、第２号、第３号及び第８号は僅かに混濁
し、試料第９号及び第１０号は非常に混濁していた）。

ＤＮＡをプロトコルＢに従って単離し、７５μ１のＴ　
Ｅ　７３街液で溶離した。各溶出物の１７３を１％アガ
ロースゲルに適用した。別の部分２５μ１を１．８Ｕの
Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼで（反応量３０μ！において３７
℃で１時間）処理し、やはり上記ゲルに適用した。マー
カーレーンはＬＭＩＩＩ　ＤＮ＾及びＭＨ　ＤＮ＾をそ
れぞれ含有する．マーカーレーン中のＬＭＷ　ＤＮ八の
量（２μｇ》は、抽出効率１００％で観察されるべき量
を表す．実験結果は、プロトコルＢでヒＩ・尿がらＤＮ
＾を有効に精製し得、得られるＤＮＡはＴ４　ＤＮ＾リ
ガーゼのための優れた基質であることを示す。

尿試料第１０号から単離したＬＩＯＩ　ＯＮ＾は明らが
に分解されていた。しかし、（この実験で用いたような
）裸のＤＮＡは尿試料中にヌクレアーゼが豊富であれば
分解されるだろうと予想できた．従って、分解は精製時
にではなく、それ以前の尿／ＤＮＡ混合物調製時に起こ
ったと考えられる．次の実施例（Ｃ２）は、（裸の場合
に反して）細胞中に存在するＤＮＡは、特にｓｓＲＮＡ
までもが尿試料第１０号から有効に回収できることを示
す。

Ｃ２：ヒト　　　のＤＮＡ　　ｓｓＲＮＡ　のこの実験
では、実施例ＣＩで用いたのと同じ１０の尿試料を、２
．４ｋｂの１ラスミド（ｐｃＭＶ−Ｅ）を保有する細菌
と混合した。混合物からＮ＾をプロトコルＹに従って単
離し、かつ７５μ１のＴＥＩＩ　衝液中に０．５Ｕ／μ
Ｉ　ＲＮＡｓｉｎを用いて溶離した．溶出物の１７３を
１％アガロースゲルでの電気泳動に掛けた。溶出物の別
の部分２５μ１を１０Ｕの、ｐｃＭＶ−Ｅを直頷化する
制限酵素ＥｃｏＲ　ｌで処理した（反応量３０Ａｔｌに
おいて３７℃で１時間）。この処理は４　０　ｎ　ｇ　
／μｌ　ＲＮＡｓｅ＾の存在下に行なった．電気泳動の
結果は、２３Ｓ及び１６ＳリポソームＲＮＡ、並びに共
有結合で閉じた形態（ＣＩ）及び直鎖形ｉ（ＣＩ［［）
のブラスミドＤＮＡを示す。

ヒト尿（５０μ１）を、４００μ１のカオトロピック物
質、溶菌（ｌｙｓｉｓ）緩衝液Ｌ６寧及びｔμｓのｐＧ
ｅｍ３ｐ２４ＤＮ＾と混合した．得られた懸濁液を全部
、プロトコルＹ本によりＤＮＡを精製するべく５００μ
１のカオトロピック物質（表０３．１参照）及び４０μ
μｍのＳｉ０２に混合添加した。尿から単離したＤＮＡ
の量を、アガロースゲル電気泳動を用いて解析した。Ｄ
ＮＡ回収効率を実施例＾５に述べたようにして判定した
結果を表０３．１にまとめる． 人竪ユ ？　　　　　８ａ１　３Ｍ／ＳｉＯｚ　　　　　　　　
＋　　　　　　　　＋４　　　　　　　ＮａＳＣＮ　３
８／Ｓｉｎ■　　　　　　　　十　　　　　　　　　　
＋表０３，１は、ＣＩ型及びＣ■型プラスミドＤＮＡの
ＤＮＡバンドの収率が同じであったことを示す．施例０
１：ヒト　便からのロタウイルスｄｓＲＮＡ精レオウイ
ルス（Ｒｅｏｖｉｒｄａｅ）利のウイルスは、二重ｊｌ
ＲＮＡから成るゲノムを有する。この科に属する重要な
病原体は、重症の下痢を惹起し得、従って糞便試料中に
大量に存在するロタウイルスである。ロタウイルスのゲ
ノムは１１個のｄｓＲＮＡセグメントから成り（Ｈｉｓ
ｈｉｎｏ　ｉｎ　Ｊ．　ＣＩｉｎ．　Ｎｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．２１，　１９８５．　４２５参照》、これらのｄｓ
ＲＮ八セグメントはプロトコルＢによって糞便上清から
単離可能である。下痢試料を１２０００ｘｇで２分間遠
心分離して得た上清１００μ１を用いて単離を行なった
。

ロタウイルスに感染したことが（Ｗｃｌｌｃｏｍｅロタ
ウイルスラテックス試験及びＫａｌｌｅｓｔａｄ　Ｐａ
Ｌｌ＋ｒｉｎｄｅｒロタウイルス直接抗原検出系によっ
て）確認された６人の異なる患者から採取した試料を用
いた結果、ｄｓＲＮＡを抽出できることが判明した。

最初の遠心分離ステップを省略し、糞便試料を直接プロ
トコルＢまたはＹのためのインプット物質として直接用
いても同様の結果（Ｖ通、ロタウイルスｄｓＲＮＡ収率
はより高い）が得られた。

Ｅ１：　ヒト血　　血　　び尿からのｓｓＤＮ＾臨床試
料から一重ＩＤＮＡも単離できることを示すために、１
μｇ（４μ１》の精製ファージ８１３　０Ｎ＾（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ社のＭ１３ｍｐ９　ＤＮ＾》を５０μ１
のヒト血清、ヒト血液またはヒＩ・尿に添加し、プロト
コルＢまたはプロトコルＹによって精製した。いずれの
抽出作業も４回ずつ行なった。ＤＮＡを５０μｌのＴＥ
緩衝液中に溶離し、２５μ１を１％アガロースゲルでの
電気泳動に掛けた。マーカーレーンは５００ｎｇの８１
３ｓｓＤＮ＾を含有する． この実験の結果から、一重鎮ＤＮＡをヒト血液、血清ま
たは尿からプロ１〜コルＹによって、また程度はより低
いがプロトコルＢによっても単離できることが判明した
。

セクションＦ：Ｎ＾のケイ藻土への　ムケイ藻土の組織
はほぼ完全にＳｉ０２から成るので、ケイ藻土が使用シ
リカとして有用であるかどうか調べた。５種の異なる市
販ケイ藻製品［ＪａｎｓｓｅｎＢｉｏｃｈｉｓ＋ｉｃａ
，　Ｌｏｕｖａｉｎ，　ＢｅｌｇｉｕｍのＣｅｌａｔｏ
ｍ　ＦＷ１４、Ｃｅｌａｔｏｍ　ＦＷ５０、Ｃｅｌａｔ
ｏｍ　ＦＷ６０、Ｃｅｌｉｔｅ　（ΔＫ》及びＣｅｌｉ
Ｌｅ　５２１］各１０ｇを５０１の２回蒸留水及び５０
０μ１の３７％ＨＣＩと混合し、得られた懸濁液をオー
トクレーブで２０分間１２１℃に加熱した。実施例Ｆ１
及びＦ２において、上記のように生成した懸濁液をプロ
トコルＹによるＮ＾抽出に用いた。

Ｆ１：ヒト血　からのＮ＾ ヒト血液を，プラスミドｐＣＭＶ−Ｅを保有するしｃｏ
ｌｉ　ｆｌｌｌｌｏ１細菌と混合し、一晩経過した培養
物１００μｌの細菌ペレットを５０μ！の血液に添加し
た。

５０μ１試料を、プロトコルＹによるＮ＾抽出のための
インプット物質として用いた。４０μ！のＳＣに替えて
、４０μμｍの上記ケイ藻土懸濁液を用いた。Ｎ＾を７
５μ１のＴＥ緩衝液中に、ＲＮＡｓｅ阻害物質を用いず
に溶離し、２０μｌの溶出物を直接ゲルに付与した。

別の２０μ１の溶出物を、９ＵのＢａｎ｝Ｉ　ｌを伴っ
たＲＮＡｓｅ＾（４０ｎｇ／ｕ　ｌ）で反応量２５μ＋
において３７℃で１時間処理してからゲルに付与した。

マーカーレーンは１μｇのＭＭｌｌＩＤＮＡを含有する
。

得られた結果から、ケイ藻土懸濁液がＳＣに類似のＮ＾
結合特性を有することが判明した，　ｄｓＤＮ＾（成分
１分子》とｓｓＲＮＡ（２３Ｓ及び１６Ｓ　ｒＲＮΔ）
との両方が結合した。プラスミドＤＮ＾は、Ｂａ＋ｎＨ
Ｉによって完全に直鎖１ヒされる（成分■）ほど十分に
純粋であった。

Ｆ２；　グーム　　　か　のＮ＾ ヒ１〜において疾病を惹起することが知られている９種
類の異なるダラム陰性菌種を固形寒天プレート上で培養
した。上記各相菌種を５〜１０μ１ずつプレートから掻
き取って、プロトコルＹによるＮΔ抽出のためのインプ
ット物質として用い、また４０μμｍのＳＣかまたは４
０μｌのＣｅｌｉｔｅ　５２１懸濁液をＨＡキャリャー
として用いた。

ＳＣを用いた抽出は最初の洗浄の間に停止しなければな
らなかったが、これは、たとえ（３分を越える）長時間
渦形成を行なったとしてもちはやＮ＾シリカ複合体を均
質化し得なくなったからである。

池方、Ｃｅｌｉｔｅ　５２１を用いた抽出は問題無く続
行することができたが、これはおそらくケイ藻土の粒径
がＳＣ粒子の粒径より大きかったためであろう。

Ｎ＾を７０μ１のＴＥ桜衝液で、ＲＮＡｓｉｎを用いず
に溶離し、溶出物の一部（２０μｌ）を１％アガロース
ゲルでの電気泳動に掛けた。

マーカーレーンは１μｇのＭＭＷ　ＤＮＡを含有する。

次のような細菌に関する結果を得た。

１：ｑ見Ｕお辿胚↓■一旺護住 ２：　Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｌ　Ｌｉｃａ　
ｔｙｐｅ　３５：　　Ｈａｅｍｏｐｌ＋ｉｌｕｓ　　ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　　ｔｙｐｅ　　ｂこの方法で、Ｉ
ＩＭＷ細菌ＤＮ＾及びｒＲＮ八を検出することができた
。

精」【 ダラム陰性菌からのＮ＾の単離が、本発明により可能で
ある。細菌細胞中には、高レベルの高分子量ＤＮＡ（Ｉ
ＩＭＷ　ＤＮＡ）及びリポソームＲＮＡが存在する。

実施例Ｇ１は、細菌細胞からＮ＾を、Ｎ＾結合性固相と
してシリカと共に様々なカオトロピック物質を用いて精
製できることを示す。

３８　Ｎａｌ ３８　ＮａＳＣＮ 人吐 一晩経過した細菌培養物ＪＭ１０１　５０μｌからＮ＾
を、９００μ１のカオトロピック物質及び４０μ１のＳ
ｉＯｚの存在下に単離した。高レベルのＨＭＩＩＩ　Ｄ
Ｎ＾及び内在リポソームＲＮＡ（１６Ｓ及び２３Ｓ）が
、エチジウムブロミドで染色したゲルのＵＶ照射によっ
て単離ＨＡを検出することを可能にする。単離はプロト
コルＹ＊に従って行ない、溶出Ｎ’Ａの２５％（４０μ
１部分）をアガロースゲル上で解析した． 細菌細胞からの内在ＲＮＡ単離のための基準として、Ｅ
．　ｃｏｌｉｒＲＮＡマーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
）を用いた。

セクション■：カオト口ピック　質としてグアニ結ムさ
せ　る　の固相とを用いる 叶人庫肩一 ＧｕＳＣＮ及び幾つかのシリカ誘導体またはラテックス
粒子（゛材料及び方法゜゛参照）を用いてＮ＾単離／精
製を行ない得ることを示すために、純粋なプラスミドを
低塩緩街液（Ｔｒｉｓ　１０ｍＭ　−　ＥＤＴ＾１ｍＭ
，　ｐｌｌ８．０）に添加し、その後プロトコルＹに従
って単雛したが、その際ステップ７及び９は省略した（
ＴＥでの溶離を行なわなかった）。結合したＮ＾を伴っ
たシリカ／ラテックス粒子をＰＣＲ反応混合物中に導入
した。単離したＤＮＡはＰＣＲ法によ．って検出し得る
。

実施例Ｈ１は、カオトロピック物質としてのＧｕＳＣＮ
と共に別の固相を用い、かつＰＣＲ法で検出を行なうこ
とによってＮ＾を精製し得ることを示す。

Ｉｌｌ：　ＧｕＳＣＮ　　び　の　　を　いるＤＮＡ５
０μ１のＴｒｉｓ　１０＋Ｍ／ＥＤＴ＾１ｍＭ（ｐＨ８
．０）中に存在する０．５μｇのｐＧｅｍ３ｐ２４を、
８０μ１のシリカ懸濁液または８０μμｍのラテックス
懸濁液（゛材料及び方法”参照）及び９００μ１の溶菌
Ｍ衝／ＩＩＬ８と混合した。

プロトコルＹにより洗浄し、かつ５６゜Ｃで乾燥した後
（溶離ステップ省略》、ペレットを５０μ１の水に再懸
濁した。プラスミドーシリ力懸濁液の２０μ１部分を、
ＩＩＩＶ特異的ブライマー（゛゜材料及び方法゛参照）
の存在下にＰＣＲ混合物中に用い、５μ１の１０倍濃縮
Ｐ　Ｃ　Ｒ　ｆ−Ｊ街液と、１μ１の１０ｍＭ　ｄＮＴ
Ｐと、２単位のｂｌ−ＤＮＡポリメラーゼと、最終量を
５０μ１とする量の水とを添加して増幅反応を開始させ
たく９５℃で１分、３７゜Ｃで１分、更に７２゜Ｃで３
分を１周期とする）。

３０周期後、反応混合物から１０μ１アリコー１〜を取
り分け、２％アガロースゲル上で解析した。ラテックス
粒子でＮ＾を単離した場合、シリカで単離した場合のよ
うなペレットは得られなかった．１＋ｎｌの洗浄液Ｌ２
を３００μ＋の７０％ｅ　ｔ　Ｏ　ＩＩと混合したとこ
ろ、二つの液相間にラテックス含有バンドが見いだされ
た。ラテックス粒子はその色によって検出可能である．
単離したラテックス含有画分を７０％Ｅ　ｔ　Ｏ　ｔｌ
で２回洗浄し、遠心分離すると、該画分はＥｐｐｅｎｄ
ｏｒｆｆ管内で小さいペレットを形成した．剋 セクション■二Ｎ八　人フィルター　びＧｕＳＣＮを用
い化Ｍｉｌｌ　ＤＮ＾）の検出レベル １　　　　粗シリカ（対照）＋＋ ２１２Ｍ＾＾Ｍ−Ｃ２　十 ３１２Ｍ＾八Ｍ−Ｃ３　十 ４１２Ｍ＾＾Ｍ−Ｃ４　　　　　　　　　　＋５　　　
　　１２　ＭＡＡＭ−Ｃ６　　　　　　　　　　＋　＋
６１２Ｍ＾＾Ｍ−Ｃ８　十 ７１２Ｍ＾＾Ｍ−ＣＩＯ　　　　　　　　　　＋８１２
Ｍ＾＾Ｍ−０１８　　　　　　　　　　＋＋９　　　　
　ＶＱ６９（疎水性）＋＋ １０　　　　　ＶＱ　５８Ｂ　（疎水性）＋＋１１　　
　　　＾ＧＹ　１５１５　（親水性）　　　　　　＋１
２　　　　　＾ＣＦ　２７Ｇ　（親水性）　　　　　　
　十１３　　　　　＾ＣＮ３ｒｅｄ　（親水性）　　　
　　　　十八夕Ｌ 結果を表Ｈ１にまとめる。３０周期後、予想した２９０
ｂｐ　ＦＩＩＶアンブライマーフラグメントを総ての事
例で観察した。フラグメン１・のサイズを、やはりゲル
上に載置したマーカーφｘ　１７４　ＲＦＤＮＡ　ｔｌ
ａｅ［［　ｄｉｇｅｓｔ　（ＰＩ＋ａｒＩＩｌａｃｉａ
）と比較した。

＋＋：固相として粗シリカを用いた場合（対照）と同じ
レベルの１＋１Ｖ特異的２９０ｂｐフラグメントをアガ
ロースゲル上に検出したことを表す。

＋：　２９０ｂｐフラグメントの検出レベルが対照の粗
シリカの場合より低いことを表す． プロトコルＹ＊本による核酸の単離では、ＳｉＯｚの替
わりにＮ＾結合フィルター（′゛材料及び方法゛参照）
を用い得る。

低塩緩衝液（Ｔｒｉｓ　１０ｍＭ−ＥＤＴ＾１ｍＭ，　
ｐｌｌ８．０）中では通常ＤＮＡの放出が起こらないが
、場合によって生起するこの問題点は、ＤＮＡを結合さ
せたフィルターからＤＮ＾を溶離する替わりに該フィル
ターをＰＣＲ反応混合物中に仙入することによって排除
できる。実施例Ｉ１は、Ｎ＾結合フィルター及びカオト
ロピック物質としてのＧｕＳＣＮを用い、かつＰＣＲ法
で解析することによってＮ＾を精製し得ることを示す。

Ｔｒｉｓ　１０ｍＨ／ＥＤＴ＾１ｍＭ（ｐＨ８．０）５
０μＩ中の純粋なｐＧｅＩＩｌ３ｐ２４　ＤＮ＾（濃度
１μｇ、０．０１μｇ及びＯ．ＯＯ５μｇ）を、寸法１
ｃｍＸ　ｌａｍの３個のＤＮ＾結合フィルター及び９０
０μ１のＧｕＳＣＮ（溶菌桜所液Ｌ８）に添加した。

（プロトコルＹ＊＊による）洗浄（遠心分離ステップ省
略）及び５６℃での乾燥の後、ＤＮＡを結合させたフィ
ルターを直接ＰＣＲ混合物中に導入した。ｌ｛ＩＶ特異
的ブライマーの存在下に、ＰＣＲサイクラーで増幅を行
なった。

反応混合物は更に、５μ１の１０倍濃縮ＰＣＲ緩衝液と
、１μ１の１０階１４　ｄＮＴＰと、２単位のシＬ！Ｌ
ＤＮ＾ポリメラーゼと、最終量を５０μ１とする量の水
とを含有する９続いて、増幅反応を開始させた。

３０周期後、反応混合物から１０μｌアリコートを収り
分け（実施例Ｈ１参照）、２％アガロースゲル上で解析
した． 及Ｕ ＤＮＡ量　　　　ＤＮＡの量 １　　　　　　１１ｙｂｏｎｄＮ　　　　　１．０　　
μｇ　　　　　　　＋２　　　　　　１１ｙｂｏｎｄ　
Ｎ　　　　　Ｏ．０１　ｔｔｇ　　　　　　　Ｏ３　　
　　　　Ｉ１ｙｂｏｎｄ　Ｎ　　　　　Ｏ．００５μＨ
　　　　　　　Ｏ４　　ニトロセルロース　１．０　　
μｇ　　　　　＋５　　ニトロセルロース　０．０１μ
ｇＯ６　　ニトロセルロース　０．００５μｇ０７　　
　　ＰＶＤＦ−ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　　　１．０　　μ
ｇ　　　　　　＋＋８　　　　ＰＶＤＦ−ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ　　　Ｏ．０１　１ｔＨ　　　　　　＋９　　　
　ＰＶＤＦ−ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　　　Ｏ．００５μｇ
　　　　　　＋フラグメントを観察した．フラグメント
を市販φｘｌｌａｅＩＩと比較した。

＋十：アガロースゲル上で、エチジウムブロミドで強度
に染色された２９０ｂｐフラグメントを検出 ＋：　２９０ｂｐフラグメントを検出 ０：　２９０ｂｐフラグメント検出せず比較として：　
ＰＣＲ増幅混合物に添加した７ｎｇの精製ｐＧｅｍ３ｐ
２４　ＤＮ＾は、“＋＋”として定量される２９０ｂｐ
フラグメン１・をもならす。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）核酸を含有する出発材料から核酸を単離するため
   の方法であって、出発材料、カオトロピック物質及び核
   酸結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を液体から
   分離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を
   洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離すること
   を特徴とする方法。
2. （２）使用される出発材料が全血、血清、バフィーコー
   ト、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織及び細胞培
   養物のような、核酸を含有する生物材料であることを特
   徴とする請求項１に記載の方法。
3. （３）使用されるカオトロピック物質がグアニジニウム
   塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオ
   シアン酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み合わせか
   ら構成される群から選択されることを特徴とする請求項
   １又は２に記載の方法。
4. （４）グアニジニウム塩が（イソ）チオシアン酸グアニ
   ジニウムであることを特徴とする請求項３に記載の方法
   。
5. （５）使用される核酸結合性固相がシリカ粒子、ポリマ
   ー材料、フィルター材料、ポリスチレンビーズ又はニト
   ロセルロース紙から構成される群から選択されることを
   特徴とする請求項１に記載の方法。
6. （６）ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを単離することを特徴と
   する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. （７）実質的に０．０５〜５００μｍの範囲の粒径を有
   するシリカ粒子を使用することを特徴とする請求項１か
   ら６のいずれか一項に記載の方法。
8. （８）実質的に０．１〜２００μｍの範囲の粒径を有す
   るシリカ粒子を使用することを特徴とする請求項１から
   ６のいずれか一項に記載の方法。
9. （９）実質的に１〜２００μｍの範囲の粒径を有するシ
   リカ粒子を使用することを特徴とする請求項１から８の
   いずれか一項に記載の方法。
10. （１０）得られた固相−核酸複合体を沈澱させ、かつ上
    清を廃棄することにより分離し、その後、カオトロピッ
    ク物質を含有する洗浄用緩衝液で複合体を洗浄すること
    を特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方
    法。
11. （１１）洗浄用緩衝液で洗った固相−核酸複合体を更に
    １種以上の有機溶剤で洗浄し、その後、乾燥することを
    特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. （１２）洗浄及び乾燥した固相−核酸複合体中に存在す
    る核酸を溶離用緩衝液により溶離することを特徴とする
    請求項１１に記載の方法。
13. （１３）こうして得られた該固相−核酸複合体を複数の
    成分の混合物と接触させ、該固相に結合しているか又は
    該固相から溶離した核酸を増幅することを特徴とする請
    求項１に記載の方法。
14. （１４）請求項１に記載の方法を実施するための手段の
    組み合わせ。
15. （１５）請求項１３に記載の方法を実施するためのテス
    トキット。