JP2680462B2

JP2680462B2 - 核酸の単離方法

Info

Publication number: JP2680462B2
Application number: JP2075323A
Authority: JP
Inventors: ウイレム・レネ・ボーム; ヘンリエツテ・マリア・アレイダ・アドリアーンセ; テイム・キエフイツ; ペテル・フランクリン・レンス
Original assignee: アクゾ・エヌ・ヴエー
Priority date: 1989-03-23
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1997-11-19
Anticipated expiration: 2012-11-19
Also published as: JPH02289596A; KR900014594A; DE389063T1; JPH1072485A; AU641641B2; NL8900725A; CA2271603A1; ES2085245T5; GR960300019T1; EP0389063B2; ZA902190B; GR3025351T3; CA2012777C; DK0389063T4; EP0389063A3; ES2085245T3; AU5215390A; EP0389063B1; DE69031237D1; EP0389063A2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は核酸を含有する出発材料から核酸を単離する
ための方法及び手段の組み合わせ、並びに該方法により
得られた核酸を増幅する（amplify）するためのテスト
キットに係る。より特定的には、本発明は全血、血清、
バフィーコート（血液の炎症性痂皮又は白血球フラクシ
ョン）、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織、細胞
培養物等のような、核酸を含有する生物材料から核酸を
単離するための方法及びキットに係る。上記生物材料か
ら単離された核酸は、サンプルを採取した生物に内在す
る核酸及び外来性（ウイルス、真菌、細胞又は寄生虫に
由来する）核酸も含有し得る。

全血、血清、尿又は糞便のような複雑な出発材料から
核酸（NA）を単離する既知の方法は通常、タンパク質分
解酵素の存在下で生物材料を洗剤により溶解させた後、
有機溶剤（例えばフェノール及び／又はクロロホルム）
で数回抽出し、エタノール沈降させ、核酸を透析するこ
とにより実施される。例えば臨床材料から（二重鎖）DN
Aを単離するこれらの既知の方法は多大な労力と時間を
必要とする。このような出発材料からNAを精製するため
には比較的多数の段階が必要とされるので、数個の臨床
サンプルを同時に処理する場合、サンプル間にNAが伝播
される危険が大きい。核酸増幅法、例えば最も感受性の
高いポリメラーゼ鎖反応（PCR,Saiki他、Science 230,1
985,1350）により例えば病原体（例えばウイルス又は細
菌）におけるNAの存在を後で検出するためにNAを単離す
る場合、このように異なるサンプル間でNAが伝播される
危険が大きいと、誤って陽性の結果が生じ、重大な問題
である。

汚染に対して感受性のこのような既知の方法の１例
は、組織及び細胞培養物から全RNAを単離するための方
法としてAnalytical Biochemistry 162,1987,156に記載
されている方法である。この方法によると、生物出発材
料からRNAを酸性チオシアン酸グアニジニウム−フェノ
ール−クロロホルム混合物で１回抽出する。相分離後、
更に水相を処理することにより有用な条件下で４時間以
内にRNAを回収することができる。

Analytical Biochemistry 162,1987,463には、塩酸グ
アニジンを含有する緩衝液に細胞を分散し、エタノール
沈降させることにより、組織及び細胞系からDNAを単離
するための方法が記載されている。この方法は汚染に対
して感受性であるが、分離したDNAを更に処理してから
数時間以内に有用なNA産物を単離することができる。

しかしながら、これらの既知の方法は複雑な出発材料
（例えば全血及び血清）中では首尾よく使用することが
できない。

本発明の目的は、既知の方法の欠点を解消するような
方法を提供することである。

より特定的には本発明の目的は、種々の生物材料のよ
うな複雑な出発材料（複合出発材料ともいう）から核酸
（即ちDNA及び／又はRNA）を未曾有の迅速さで簡単且つ
再現可能に、しかもその後、分子生物反応における反応
剤として使用可能な非損傷状態及び高純度で直接（前処
理を介さずに）単離することが可能な方法を提供するこ
とである。

本発明の別の目的は、他のサンプル及び人体に対する
汚染の危険が低いという点で既知の方法と異なり、即ち
異なるサンプル間におけるNAの伝播の危険を最小にしな
がら数個の臨床サンプルを同時に処理することが可能な
方法、並びに被処理サンプル中に存在し得るウイルス又
は細菌が人体に伝染する危険を最小にすることが可能な
手段を提供することである。

これらの目的は本発明に従い、出発材料をカオトロピ
ック物質及び核酸結合性固相と混合し、核酸が結合した
固相を液体から分離し、その後、こうして得られた固相
−核酸複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体か
ら溶離することを特徴とする、核酸を含有する出発材料
から核酸を単離するための方法により実現される。

広義には本発明はあらゆる核酸含有出発材料（ウイル
ス又は細菌に感染した食品及び類似製品、ワクチン及び
ミルクを含む）に適用できるが、使用される出発材料が
全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精
液、唾液、組織及び細胞培養物（例えば哺乳動物細胞培
養物及び細菌培養物）のような核酸含有生物材料である
ような方法に特に適用される。しかしながら、核酸含有
生物材料の種類によっては（例えば植物材料、ある種の
グラム陽性菌並びにある種の酵母及びカビ）は特殊な細
胞壁構造によりカオトロピック物質に溶解しないため、
出発材料として本発明の方法で直接使用することはでき
ない。従って、このような出発材料は入手形態の細胞に
前処理を施す必要があり、例えば予め細胞を溶解させて
から得られた溶解物に本発明の方法を実施すればよい。

核酸（NA）なる用語は、任意の可能な構造、即ち二重
鎖（ds）核酸、又は一重鎖（ss）核酸、又はその組み合
わせ（部分的ds又はss）としてのDNA及びRANを意味す
る。

本発明の主眼は、カオトロピック物質の存在下でNAと
結合することが可能な核酸結合性固相、例えばシリカ粒
子を使用する点にある。シリカなる用語は、SiO₂結晶及
び他の形態の酸化ケイ素、SiO₂から構成されるケイソウ
植物の骨格、無定形酸化ケイ素並びにガラス粉末を意味
する。アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム（ゼオライ
ト）、−NH₂を有する活性シリカ、ラテックス粒子、キ
ュベットもしくは微量滴定プレートの内壁を形成するあ
る種のポリマー材料、又は例えばニトロセルロースから
構成されるフィルター材料も本発明の核酸結合性固相と
して使用できる。

シリカ粒子の使用に関しては、カオトロピック塩NaI
（ヨウ化ナトリウム）の高濃度溶液中のdsDNAをアガロ
ースから遊離させ、ガラスに結合できることがPNAS 76,
1979,615により知見された。この文献はアガロースゲル
からDNAを単離するための２種の方法について記載して
おり、そのいずれも第１段階でアガロースを溶解するた
めにNaI溶液を使用している。一方の方法では第２段階
でDNAをアセトンで沈降させ、他方の方法では第２段階
でDNAをガラス粒子に結合し、その後、水性緩衝液に溶
離する。しかしながら、この方法では体液及び他の生物
出発材料のような複雑な出発材料を使用できない。更に
この論文は、本発明の１段階方法については開示してい
ない。

本発明によると、結合し、その後、溶離される高純度
の核酸を不純な出発材料から直接得られるように、適当
に選択した粒径を有するシリカ粒子を使用することが好
ましい。

本発明の好適態様は、実質的に0.05〜500μｍの範囲
の粒径を有するシリカ粒子を使用することを特徴とす
る。「実質的に」なる用語は、シリカ粒子の80％以上、
好ましくは90％以上が規定された粒径範囲に該当するこ
とを意味する。結合したNAを容易に処理できるようにす
るためには、使用されるシリカ粒子は実質的に0.1〜200
μｍの範囲の粒径を有すると好適であり、使用されるシ
リカ粒子が実質的に１〜200μｍの範囲の粒径を有する
ような方法が最適である。実際に、シリカ粒子のNA結合
能は粒子が小さければ小さいほど高いが、特にNA含有量
の高い出発材料の場合、及びNA分子が比較的長い場合
は、過度に小さいシリカ粒子を使用すると、形成される
NA−シリカ複合体をそれ以上有効に再分散することがで
きなくなる。換言するならば、結合したNAを純粋な形で
複合体から回収することができない。人血を出発材料と
して使用する場合、0.2〜10μｍの範囲の粒径を有する
非分画シリカを使用すると、このような問題が生じるこ
とがある。それ以上再分散することができない凝集物の
形成は、粒径が１〜10μｍの範囲の分画したシリカを使
用することにより避けることができる。しかしながら、
細菌培養物のように細胞中の濃度が高い出発材料を使用
する場合、このような粗いシリカフラクションの使用は
再分散し難い凝集物の形成を避けるためには不十分であ
り、２〜200μｍの粒径を有するケイソウ土のようなも
っと粗いシリカを使用すると、最適な結果が得られるこ
とが判明した。

別の好適態様によると、NA結合性固相はフィルター形
態であるか、又はサンプルとカオトロピック物質とを収
容する容器の一部を形成する。NA結合性固相を後者の形
態に選択すると、その後のサンプル処理及びNA単離のた
めに遠心分離又は過を実施する必要がなくなる。

本発明によると、シリカ粒子のような上記核酸結合性
固相以外にカオトロピック物質を使用することが不可欠
である。カオトロピック物質なる用語は、タンパク質及
び核酸の二次、三次及び／又は四次構造を変えることが
可能であり且つ少なくとも一次構造を無傷にしておくこ
とが可能な任意の物質を意味する。具体例は（イソ）チ
オシアン酸グアニジニウム及び塩酸グアニジンである。
核酸を含有する出発材料からNAを単離するために、ヨウ
化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸
ナトリウム、尿素又はその相互の組み合わせも核酸結合
性固相と組み合わせて使用すると非常に好適である。本
発明によると、使用されるカオトロピックグアニジニウ
ム塩は好ましくはチオシアン酸グアニジニウム（GuSC
N）である。

本発明は通常、出発材料を十分大きい量のカオトロピ
ック物質（例えばグアニジニウム塩）及び例えばシリカ
粒子と混合し、出発材料中に存在する核酸のほぼ全体を
遊離させ、該シリカ粒子に結合させるように実施され
る。適当なプロトコールによると、例えば、反応容器中
に存在するGuSCN緩衝溶液にシリカ粒子懸濁液を加え、
その後、サンプルを加えて十分に混合する。やがて、細
胞が溶解し、ウイルスが存在する場合はウイルスも溶解
し、遊離したNAがほとんど即座にシリカ粒子に結合す
る。次に、形成されたシリカ−核酸複合体を例えば迅速
沈澱（遠心分離）及び上清の廃棄（例えば吸引による）
により液体から分離し、その後、複合体（例えばシリカ
−核酸ペレットの形態）を例えばボルテックスミキサー
を使用してカオトロピックグアニジニウム塩を含有する
洗浄用緩衝液で洗浄（再分散又は均質化）し、再び沈澱
させる。好ましくは、洗浄用緩衝液で洗ったシリカ−核
酸複合体を更にアルコール水溶液（収率の損失を制限す
るために最適には約70％エタノール）及びアセトンで洗
い、その後、（例えば加熱下に）乾燥してアセトンを除
去する。次に、洗浄及び乾燥したシリカ−核酸複合体中
に存在するNAを水性溶離用緩衝液（elution buffer）に
より溶離する。溶離用緩衝液の選択は単離されるNAの使
用目的に応じて決定される。適当な溶離用緩衝液の例は
TE緩衝液、２回蒸留水（aqua bidest）及びPCR緩衝液
（「材料及び方法」の項参照）である。好ましくは、こ
れらの全段階を単一の反応容器（例えば容量1.5mlのポ
リプロピレン製エッペンドルフチューブ）中で実施し、
比較的少量、例えば100μ未満の精製NAを回収する。
こうして単離したNAは核酸分解酵素を含有せず、DNAポ
リメラーゼ（例えばTaq−DNAポリメラーゼ）、DNA制限
酵素、DNAリガーゼ及び逆転写酵素（例えばAMV逆転写酵
素）のような種々の酵素の基質として直接使用できるよ
うな高純度を有する。

本発明の方法によると、PCR法又はヨーロッパ特許第E
P0329822号に記載されている所謂NASBA法（NASBA＝核酸
配列に基づく増幅）のような増幅方法によりNA配列を証
明できる程に、例えば血漿及び血球を予め分離すること
なく約45分間に50μの全血から十分な量のNAを単離す
ることができる。一方、本発明は血清、糞便、尿等のよ
うなNAを含有する他の種々の生物材料にも適用すること
ができる。このため、本発明は細菌及びウイルス感染の
診断において、並びに出生前診断及び遺伝性腫瘍体質の
診断の領域における遺伝的多形性の研究において有用で
ある。

本発明のNA単離方法は、全手順を単一の反応容器中で
実施することができ、方法の第１段階で粗出発材料から
遊離したNAが完全な別の精製過程の間に少なくとも固相
の大部分に結合するので、汚染の危険が非常に低い。ウ
イルス又は細菌に感染している可能性のある材料の処理
に伴う人体への危険は、サンプルを反応容器に入れる単
離過程の第１段階にほぼ限定される。この第１の処理に
おいて、潜在的に存在する病原体は有効に不活化され
る。本発明の方法は特殊な周辺技術（ボルテックスミキ
サー、12000gエッペンドルフ型の遠心分離機及び水浴又
はエッペンドルフ加熱ブロックが標準実験技術に属す
る）も生化学の専門的知識も必要としないので、多数の
サンプルから機械的にNAを単離するため、換言するなら
自動化に非常に適している。本発明の方法を使用する
と、10個以上、あるいは24個以上の異なるサンプルを約
１時間で処理することができる。

本発明は核酸を含有する出発材料から核酸を単離する
ための方法のみならず、そのための手段の組み合わせ及
び該方法により得られた核酸を増幅するためのテストキ
ットにも係る。

１態様によると、本発明の手段の組み合わせは、
（ａ）（イソ）チオシアン酸グアニジニウムを含有する
溶解用緩衝液（lysis buffer）、（ｂ）実質的に0.05〜
500μｍ、好ましくは0.1〜200μｍ、最適には１〜200μ
ｍの範囲の粒径を有するシリカ粒子の水性懸濁液、
（ｃ）（イソ）チオシアン酸グアニジニウムを含有する
洗浄用緩衝液、及び必要に応じて（ｄ）溶離用緩衝液を
含む。

即ち、本発明の手段の組み合わせは例えば次の４成
分、即ち成分1:（イソ）チオシアン酸グアニジニウム緩衝溶液、成分2:シリカ粒子の懸濁液、成分3:洗浄用緩衝液、及び（場合によって）成分4:溶離用緩衝液から構成され得る。

必要に応じて成分１及び２を一緒にしてもよいが、そ
の場合、貯蔵寿命が制限される。

本発明のNA単離方法で使用することが好ましい他の反
応剤、例えばエタノール及びアセトンは標準実験技術に
属する。

以下、多数の実施例により本発明を説明する。先ず、
使用される材料と方法について説明する。

材料及び方法Ａ）シリカ粗材（SC）の懸濁液粒径分布0.5〜10μｍで且つその80％が１〜５μｍ
の、Sigma製の二酸化ケイ素（SiO₂）を使用した。

シリカ60gを直径5cmのシリンダーに入れた２回蒸留水
（最高500ml）中に懸濁させると、水柱の高さは27.5cm
となった。室温で25時間1x g沈降させた後に、70mlを残
して上澄みを吸引して除去した。２回蒸留水を500mlに
なるまで加え、シリンダーを振盪することにより粒子を
再度懸濁させた。５時間1x g沈降させた後、60mlを残し
て上澄みを吸引して除去した。32％（w/v）HCl600μ
を加えた後、渦形成することにより再度懸濁させた。こ
の懸濁液を6ml容器に入れて4mlアリコートをつくり、密
封し、オートクレーブ内で121℃で20分間加熱した。こ
の沈降プロトコルによって、粒径１μｍ以上のより大き
なシリカ粒子を豊富に得ることができた。これは電子顕
微鏡検査によって立証された。更に、酸性（pH約２）の
シリカをオートクレーブ処理すると、任意に存在する核
酸が完全に分解される結果となる。このように得られた
シリカ粗材の懸濁液を以下SCと表記する。

シリカ誘導体の懸濁液２〜18個の炭素原子の長さのアルキル末端を有するメ
チルアクリルアミド二酸化ケイ素を用いてシリカを誘導
体化した。誘導体化したシリカの粒径は63〜200μＭで
あった。使用した粒子の孔径は500Åであった。上記シ
リカ誘導体（12MAAMC₂−C₁₈）はDiosynth,Ossから供給
された。

NA単離のために（実施例H1）、誘導体化したシリカ粒
子0.5gを２回蒸留水1ml中に懸濁させた。このシリカ懸
濁液を、32％（w/v）HCl 120μを用いて90℃で30分間
予備処理した。

ポリスチレンラテックス粒子の懸濁液２種類のポリスチレンラテックス粒子を使用した。ポ
リスチレンラテックスVQ69レッドはナトリウム−ドデシ
ルスクシネートスルフェート基を吸収させてあり、粒径
は424nmを有した。ポリスチレンラテックスVQ58Bはより
小さい粒径（328nm）を有し、外側にスルフェート基を
吸収していなかった。

３種の親水性のクリシジルメタクリレートポリスチレ
ンラテックス粒子を使用した。AGF27G、ACN3レッド及び
AGY1515の粒径はそれぞれ933nm、206nm及び846nmであっ
た。上記全てのポリスチレン粒子はARLA−Arnhemより供
給のものであった。

市販フィルター以下のものを使用した。

1.PVDF Millipore提供のImmobilon Transfer Membrane
（疎水性）、 2.Schleicher and Schuell提供のNitro−cellulose（0.
2μM 参照番号401.396）、 3.Hybond−Ｎ Amersham提供のNylon Hybiridi−zation
膜（0.45ミクロン、ロット:16872）。

Ｂ）L2緩衝液 TRIS（Boehringer）12.1gを２回蒸留水800ml中に溶解
し、37％（w/v）HCl 8.1mlを加え、さらに容積１リット
ルになるまで２回蒸留水を加えることにより、L2緩衝液
（0.1M Tris.Cl、pH6.4）を調製した。

Ｃ）洗浄液L2 GuSCN（Fluka製のチオシアン酸グアニジン）120gをL2
緩衝液100ml中に溶解することにより、洗浄液L2を調製
した。

洗浄液L2＊ KI（Merck製のヨウ化カリウム）12.45gをL2緩衝液25m
l中に溶解することにより洗浄液L2＊を調製した。

NaIベースのカオトロピック物質を調製するために、N
aI（Merck製のヨウ化ナトリウム）11.25gをl2緩衝液25m
l中に溶解した。チオシアン酸ナトリウムベースのカオ
トロピック物質を調製するために、NaSCN（Baker）6.1g
をL2緩衝液25ml中に溶解した。

KI及び尿素（8M）を含有するカオトロピック物質を調
製するために、KI 12.45g及び尿素12.0gをL2緩衝液（25
ml）中に溶解した。同様に、尿素及びNaIを併有するカ
オトロピック物質と、尿素及びNaSCNを併有するカオト
ロピック物質とを調製した。

Ｄ）溶解用緩衝液L5 GuSCN 120gをL2緩衝液100ml中に（約60℃の温水浴中
で静かに振盪させて）溶解し、次いで40％（w/v）デキ
ストランスルフェート（Pharmacia LKB）溶液26.0g、0.
2M EDTA pH8 22ml及びTriton X−100（Packard）2.6gを
加え、次に溶液を均質化することにより、溶解用緩衝液
L5を調製した。0.2M EDTA pH8溶液は、EDTA37.2g（Merc
k製のTitriplex）37.2g及びNaOH（Merck）4.4gを水500m
l中に溶解することにより調製した。

Ｅ）溶解用緩衝液L6 GuSCN120gをL2緩衝液100ml中に（60℃の水浴中で静か
に振盪させて）溶解し、次いで0.2M EDTA pH8 22ml及び
Triton X−100（Packard）2.6gを加え、次に溶液を均質
化することにより、溶解用緩衝液L6を調製した。

溶解用緩衝液L6＊ KI（ヨウ化カリウム、Merck）12.45gをL2緩衝液25ml
中に（40℃の水浴中で静かに振盪させて）溶解し、次い
で0.2M EDTA（pH8.0）5.5ml及びTriton X−100（Boehr
inger 789704）0.65gを加え、最後にこの溶液を均質化
することにより、溶解用緩衝液L6＊を調製した。同じ方
法を適用してNaI（ヨウ化ナトリウム、Merck）を含む溶
解用緩衝液L6＊、及びNaSCN（チオシアン酸ナトリウ
ム、Baker）を含む溶解用緩衝液L6＊を調製した。

KI及び尿素を併有する溶解用緩衝液L6＊を、KI（ヨウ
化カリウム、Merck）12.45g及び尿素（Gibco BRL）12.0
gをL2緩衝液25ml中に溶解することにより調製した。次
いで、0.2M EDTA（pH8.0）5.5ml及びTriton X−100（Bo
ehringer）0.65gを加え、この混合物を均質化した。同
じ方法を使用してNaI/尿素及びNaSCN/尿素を調製した。

Ｆ）溶解用緩衝液GEDTA GEDTAとは、GuSCN 120gを0.2M EDTA pH8 100ml中に溶
解した溶液を意味する。

Ｇ）TE緩衝液溶出（elution）に適した緩衝液は、所望であればRNA
sin（Promega）0.5U/μを含有する、pH7.5の10mM Tri
s.Cl、1mM EDTA溶液（TE緩衝液）である。

Ｈ）試験管溶解用緩衝液900μ及びNAキャリヤ（ラテックスビ
ーズもしくはSCのごときシリカ、または珪藻土）40μ
をEppendorff遠心分離管（タイプ3810、1.5ml）に加え
ることにより、抽出過程と同じ日に試験管を準備した。

Ｉ）洗浄方法洗浄液1mlを加え、次いでペレットが再度懸濁するま
で渦形成し、12000x gで15秒間遠心分離し、更に吸引に
よって上澄みを廃棄することにより、ペレットを洗浄し
た。

Ｊ）溶出方法溶出は、少なくとも25μ、好ましくは少なくとも40
μの溶出用緩衝液を加え、短時間（２秒間）渦形成
し、56℃で10分間インキュベートすることにより実施し
た。

Ｋ）プロトコルＢこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿
といった複合出発材料からdsDNAを単離するのに適して
おり、GEDTA 900μ及びSC 40μを含むEppendorff試
験管を使用した。

1.ペレットが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、 2.出発材料（例えば血清、全血、便または尿）50μを
加え、直ぐに渦形成して（５〜10秒間）均質化し、 3.室温に10分間放置し、５秒間渦形成し、 4.12000x gで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを
廃棄し、 5.ペレットをGEDTAで１回洗浄し、 6.ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7.ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8.ペレットを、蓋で開放して56℃で10分間乾燥し、 9.RNAsinを含まないTE緩衝液50μを用いてNAを溶出
し、 10.12000x gで２分間遠心分離すると、上澄みはNAを含
有した。

L.プロトコルＹこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿
といった複合出発材料からNAを単離する（同時にdsDN
A、ssDNA、dsRNA及びssRNAを精製する）のに適してお
り、L6 900μ及びSC 40μを含むEppendorff試験管
を使用した。

1.ペレットが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、 2.出発材料（血清、全血、便または尿）50μを加え、
直ぐに渦形成（約５秒間）して均質化し、 3.室温に10分間放置し、５秒間渦形成し、 4.12000x gで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを
廃棄し、 5.ペレットをL2で２回洗浄し、 6.ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7.ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8.ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9.必要によってはRNAsinの存在下に、TE緩衝液50μを
用いてNAを溶出し、 10.12000x gで２分間遠心分離すると、上澄みはNAを含
有した。

プロトコルＹ＊このプロトコルは、ヒト血清、尿またはバクテリア培
養液といった複合出発材料からNAを単離するのに適して
いる。

方法： L6＊ 900μ及びSC 40μを含むEppendorff試験管を
使用した。

1.ペレットが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、 2.出発材料（血清−プラスミド、尿−プラスミド混合物
または一晩培養したバクテリア培養液）50μを加え、
直ぐに渦形成（５秒間）して均質化し、 3.混合しながら室温に10分間放置し、 4.14,000gで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを
廃棄し、 5.ペレットをL2＊洗浄液で２回洗浄し、 6.ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7.ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8.ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9.必要によってはRNAsinの存在下に、TE緩衝液（10mM T
ris−1mM EDTA pH8.0）50μを用いてNAを溶出し、 10.14,000gで２分間遠心分離すると、上澄みはNAを含有
した。

プロトコルＹ＊＊このプロトコルは、カオトロピック物質としてのGuSC
N、及びNAを結合できるフィルター（材料及び方法の項
参照）の存在下に、NAを単離するのに適している。NA検
出は、このフィルターをポリメラーゼ連鎖反応混合物に
直接適用することによる、ポリメラーゼ連鎖反応によっ
て実施し、従ってフィルターからNAを予め溶出しない。

方法： L6溶解用緩衝液900μ及びフィルター（寸法1cm/1cm）
を含むEppendorff試験管を使用した。

1.核酸含有溶液50μを加え、試験管を短時間渦形成
し、 2.混合しながら室温に10分間放置し、 3.上澄みを廃棄し、 4.フィルターをL2洗浄液で２回洗浄し、 5.フィルターを70％エタノールで２回洗浄し、 6.フィルターを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 7.フィルターの小片をポリメラーゼ連鎖反応溶液に直接
加えた。

Ｍ）プロトコルＺこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿
といった複合出発材料からNAを単離するのに適してお
り、L5 900μ及びSC 40μを含むEppendorff試験管
を使用した。単離したNAはハイブリッド形成反応に使用
することができるが、制限酵素に対する基質としてはや
や適当でない。しかしながらT4 DNAリガーゼは活性であ
る。プロトコルＹと比較してプロトコルＺではNAの収率
が高くなる。

1.ペレットが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、 2.出発材料（血清、全血、便または尿）50μを加え、
直ぐに渦形成（約５秒間）して均質化し、 3.室温に10分間放置し、５秒間渦形成し、 4.12000x gで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを
廃棄し、 5.ペレットをL2で２回洗浄し、 6.ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7.ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8.ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9.必要によってはRNAsinの存在下で、TE緩衝液50μを
用いてNAを溶出し、 10.12000x gで２分間遠心分離すると、上澄みはNAを有
した。

Ｎ）出発材料実施例は、出発材料の性質に応じて（特にセクションＡ〜Ｄ）、以下のようなセク
ションに分割した。

セクションA:ヒト血清セクションB:ヒト全血セクションC:ヒト尿上記セクションＡ、Ｂ及びＣは特に、dsDNA及びssRNA
の両方を純粋形態で単離できることを示す意味がある。

セクションD:ヒト便このセクションＤは、特にdsRNAも単離できることを
示す。

セクションE:一重鎖DNA このセクションＥは、本発明が、ssDNAを単離するた
めに使用できることを示す実験からなる。

セクションF:珪藻土このセクションＦは、珪藻土の骨格が本発明に使用す
るシリカ粒子として非常に有効４であることを示す。更
に、本発明が、種々のプログラム陰性菌からNAを単離す
るために使用できることも示す。

セクションＧは、種々のカオトロピック物質を使用
し、細菌細胞からNAを精製できることを示す。

セクションＨ及びＩは、別の固相を使用するDNAの単
離を示す。

常に50μの量で使用した。セクションＢ及びＦに使
用した血液は常に、凝固を防止するためにEDTAの存在下
に採取した鮮血とした（Terumo N.V.,Louvain,ベルギー
のVenoject装置、タイプVT−574TKZの採取管を使用）。
他のセクションに使用した出発材料（血清、尿及び便）
は冷凍物であった。実施例A1、A2、A3、B1、B2、B5、B7
及びF1において、血清または血液は同じ被検体由来であ
った。

Ｏ）他の方法ゲル電気泳動調査に対して、溶出した量のNAの一部
を、Aaij及びBorstが記載した（Biochim.Biophys.Acta
269,1972,192）緩衝液系に臭化エチジウム１μg/mlを含
有する中性アガロースゲル上にロードした。ゲルにUV照
射して写真撮影した。

いくつかの実験において、既知量の精製DNA（インプ
ットDNA）を臨床試料に加えた。これらのケースにおい
て、抽出効率100％に対応する量のインプットDNAを同じ
ゲルにロードした。

Ish−Horowicz及びBurkeが記載したように（Nucleic
Acids Res.９,1981,2989）、Escherichia Coli HB101か
ら細菌プラスミドDNAを精製し、Sepharose CL 2B（Phar
macia,Inc.）を用いたカラムクロマトグラフィーにか
け、エタノールで沈澱させた。Birnboim及びDolyが記載
したように（Maniatis,T.ら,Molecular Cloning,CSH,ニ
ューヨーク）、Escherichia Coli JM101（J.Messing,Re
c.DNA Techn.Bull.2:43−48（1979））から細菌プラス
ミドDNAを精製した。pCMV−Ｅは、2kbベクターpHC 624
（Boros in gene 30,1984,257）においてクローニング
された0.4kbヒトサイトメガロウイルスDNA断片を含み、
pEBV−10は、同じベクターにおいてクローニングされた
0.9kb Epstein BarrウイルスDNA断片を含む。緩和環状
（C II）分子（relaxed circular molecules）を豊富に
含むプラスミド調製物を得るために、pEBV−10 DNA（2.
9kb）をDNAse Iで処理した。成分II分子は、3.2kb緩和
環状DNA分子としてビリオン中に存在するＢ型肝炎ウイ
ルスDNAの精製のためのモデルの役目をする。

pGem3p24は1.45kb HIV配列を含むが、pGem3p24の構成
は以下に記述する。

HIV HxB2 DNAの配列は数人が記述している（J.Virol,
61,633−637（1987）;Nature 326,711−713（1987）;Ai
ds Res.Hum.Retrovirus 3,41−55（1987）;Aids Res.Hu
m.Retrovirus 3,33−39（1987）及びSience 237,888−8
93（1987））。

HIV HxB2 DNAの一部をFok Iで、もとのHIV HxB2配列
の1189及び2613部位で切断した。ヌクレオチド番号は遺
伝子バンク指定を参照されたい。

このフラグメントのFok I部位を、クレノウ（Kleno
w）DNAポリメラーゼ（Maniatias,上記参照）を使用して
充填し、プラスミドpUC−19のポリリンカーSma I部位に
おいてクローニングした（Maniatias,前記参照）。HIV
HxB2 DNAフラグメントを担う得られたプラスミドpUC19
−p24と称した。

プラスミドpGem3p24を得るために、pUC19−p24の1450
bp EcoR I−BamH IフラグメントをEcoR I−BamH I消化
ベクターpGem3においてクローニングした（2867bp;Prom
ega Corporation,Madison USA）。

PCR法に使用したプライマーをオリゴシンセサイザー
（oligo−synthesizer）装置（Applied Biosystem製）
において合成した。プライマーES47（25mer）及びES75
（47mer）のヌクレオチド配列を以下に示す。

ほとんどのRNA単離実験において（実施例A3、B5、B
6、B7、C2、D1、E1、F1及びF2）、精製過程の間のRNAの
分解を回避するために溶出用緩衝液中にRNAsinを任意的
に使用する以外には、予防策を講じなかった。臨床試料
を試験管に付加する際にのみ手袋をはめ、試薬の調製に
対してはRNAse阻害剤を使用せず、オートクレーブ処理
しないEppendorff容器及びピペットチップを使用した。
特に実施例F1及びF2は、溶出の際のRNAsinの存在は厳密
には必要でないことを示した。

使用した酵素は市場入手可能であり、製造業者が推奨
するままに使用した。RNAse A同様に全ての制限酵素T4
リガーゼ及びAMV逆転写酵素はBoehringer（Mannheim）
製であった。Tag−DNAポリメラーゼはCetus Inc製とし
た。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はPerkin Elmer Cetu
s DNA−熱循環器を用いて実施した。

種々の用途に対しては、本発明の方法に使用する試
薬、特にNAキャリヤー（例えばシリカ粒子）及びカオト
ロピック物質を含む溶解用及び洗浄用緩衝液は、核酸
（例えばNA含有の細菌またはウイルス）によって汚染さ
れるべきではないことは基本的に重要である。これは、
NAキャリヤーに対しては、これをオートクレーブ内で12
1℃で20分間加熱することにより保証され得る。しかし
ながら、この方法はGuSCN含有の溶解用及び洗浄用緩衝
液（GEDTA、L5、L6及びL2）においては、活性が失われ
る可能性があること、及び環境に対する付随的な危険性
があることから有効ではない。上記試薬を（出来る限
り）核酸を含有しないようにするために、かかる試薬を
本発明のシリカ粒子のカラムに通すことができる。GuSC
N含有緩衝液の溶解（lysing）特性、及びカオトロピッ
ク物質GuSCNの存在下にNAを結合するシリカの特性に起
因し、かかる方法でNA非含有の緩衝液が得られる。カラ
ム自体は、例えば500℃またはそれ以上で１時間以上加
熱することにより、核酸非含有にすることができる。

Ｐ）DNAタイプ C I:共有結合閉環状DNA（プラスミド）、 C II:緩和（ニック）環状DNA（プラスミド）、 C III:線状DNA（線状化プラスミド）、 LMW:低分子量DNA（＜0.5kb）;pHC 624のHpa II消化、47
1bp、404bp、242bp（２フラグメント）、190bp、147b
p、110bp、67bpのフラグメント及び数個のより小さい不
定長のフラグメント、 MMW:中分子量DNA（0.5〜29kb）；ファージλDNAのHind
III消化、23kb、9.4kb、6.7kb、4.4kb、2.3kb、2.0kb及
び0.56kbのフラグメント、 HMW:高分子量DNA（＞29kb）、 ssDNA:ファージM13mp9一重鎖DNA（Boehringer）。

セクションA:ヒトの血清からのDNA/RNAの精製ヒトの血清には例えばウイルス又は細菌中にNAが存在
し得る。これらの有機体は共に遊離形態で生じ得、更に
は免疫複合物中に結合して生じ得る。NAの量は通常非常
に少ないので、アガロースゲル電気泳動及びエチジウム
ブロミド/NA複合体の紫外線照射を通じての検出は不可
能である。DNAをヒトの血清から精製できることを示す
ために、微量の精製DNAを血清に加え、次いでプロトコ
ルＢに基づいてDNAを単離した（実施例A1,A2）。DNA及
びRNAをヒトの血清から同時に精製できることを示すた
めに、培養した哺乳動物細胞又は（小さなプラスミドを
有する）細菌を血清に加え、次いでプロトコルＹに基づ
いてNAを単離した（実施例A3）。最後に実施例A4は、プ
ロトコルＹによりヒトの血清に存在するRNAをHIV（ヒト
の免疫不全ウイルス）から精製でき、またPCR法により
検出できることを示している。実施例A5は、ヒトの血清
中のDNAをプロトコルＹ＊により、核酸結合性固相とし
てのシリカと共に種々のカオトロピック物質を使用して
精製できることを示している。

実施例A1:ヒトの血清からのDNAの精製ヒトの血清（500μ）を既知量の精製DNA［100μL
MW（45μｇ）、20μMMW（20μｇ）、40μC I/II（2
0μｇ）］と混合し、10個の66μ試料をプロトコルＢ
に基づき10個のDNA抽出物用インプット材料（input mat
erial）として使用した。この実験では試験管中に存在
するSC（Silica Coarseの懸濁液）の量を2.5〜40μで
変動させた。抽出を二重に実施し、各試料からの溶離DN
Aの半分（30μ）を１％アガロースゲルを支持体とす
る電気泳動にかけた。比較として、インプットDNAの半
分の量を同様にコントロールレーン（lanes）の同一ゲ
ル上にロードした。

SCの量が10μを越えると、二重鎖DNA、線状（23kb
〜約60bp）共有結合閉鎖（C I）DNAも緩和環状（C II）
DNAも効率的に単離された。最大MMWフラグメント（約23
kb）の収率はより小さなフラグメントと比較して比較的
低いようである。このことは他の実験から考慮すると、
分子量の大きいフラグメントのせん断のせいであろう。

コントロールレーンはそれぞれ、100％の抽出効率の
場合のLMW,C II/C I及びMMW DNAの量を示している。前
述した如く、C IIに富む（DNAse Iで処理した）3kbプラ
スミド（pEBV−10）をインプット材料として使用した。

実施例A2:ヒトの血清から単離したDNAは制限酵素及びT4
DNAリガーゼに対して良好な基質であること精製DNA調製物を50μのヒトの血清試料12個に加え
た。プロトコルＢに基づいてこれら12個の混合物からDN
Aを単離した。50μのTEで溶離を実施した。溶離したD
NAの半分を以下の３種の制限酵素：EcoR I,BamH I,Bgl
II（これらはそれぞれ低温、中塩及び高塩緩衝液で活性
を有する）のいずれかで（二重に）処理するか、T4 DNA
リガーゼで処理するか、又は処理しなかった。DNA試料
を１％アガロースゲルを支持体とする電気泳動にかけ、
紫外線照射により可視化した。

T4リガーゼ処理（37℃で１時間、30μの反応容量中
に３単位のT4リガーゼ）の結果は、DNAフラグメントの
分子量のシフトを示すと共に、ヒトの血清から単離した
DNAがエキソヌクレオリティックな（exonucleolytic）
分解の影響をそれほど受けないことを示している。

精製プラスミド（pCMV−E;3.3μg;1.5μ）を加えた
８個の血清試料の結果はそれぞれ、EcoR I、BamH I、Bg
l IIダイジェストに対して総ての制限酵素がプラスミド
を線状化したことを示している。総ての制限酵素は９単
位の酵素と共に、37℃で１時間30μの反応容量中でイ
ンキュベートした。

実施例A3:ヒトの血清からのDNA及びssRNAの同時単離ヒトの血清には（例えばウイルス、細菌又は細胞中
に）、エチジウムブロミドで染色したゲルの紫外線照射
によっては検出することのできない非常に少量のRNAし
か存在しないので、外因性RNA源をヒトの血清試料に加
えた。哺乳動物の細胞又は細菌を外因性RNA源として使
用した。プロトコルに基づいてNAを試料から単離し、RN
Ase A（40ng/μの溶離用緩衝液）の存在下で又は不在
下で、0.5U/μのRNAsinを含む50μのTEで溶離し
た。１％アガロースゲルを支持体とするその後の電気泳
動の結果は、RNA及びDNAが検出できることを示してい
る。50μの血清試料に対して加えた哺乳動物の細胞は
５×10⁵ラット10B細胞（Boom等、J.Gen.Virol.69,1988,
1179）であり、50μの血清に対して加えた細菌はプラ
スミドpCMV−Ｅを含むE.coli細胞株HB101の100μ一晩
培養物の細胞ペレットであった。

実施例A4:ヒトの血清から単離したヒトの免疫不全ウイ
ルスRNAの検出用ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルＹに基づいて各々が50μのヒトの血清試
料２個（患者F,H）からNA（75μ）を単離した。患者
Ｆの血清は（Abbott研究所のHIV P24抗原固相免疫検定
法に基づく）多量（2700pg/ml）のHIV抗原P24を含んで
いたが、（Abbott研究所のHIV抗体ELISAに基づく）HIV
抗体に対しては陰性であった。患者Ｈの血清は両方の試
験で陰性であった。

単離したNAの一部（43μ）を37℃で90分RNAseを含
まないDNAse（Boehringer;1U DNAse/μ）で処理し
た。エタノールでの沈澱及び68℃で15分間の熱不活化の
後に、RNAを15μのTE緩衝液に懸濁した。このRNA調製
物の一部５μを、HIV特異的プライマーの存在下にお
いて、0.4U/μのAMV逆転写酵素（42℃で30分；反応容
量20μ）で処理するか又は処理しなかった。次いで、
dNTPsを含む80μの1.25×濃縮PCR緩衝液を加えて、反
応容量を100μにした。1UのTaq−DNAポリメラーゼを
加えて、増幅を開始した（１サイクルは95℃で１分間、
55℃で１分間、72℃で２分間からなる）。20、25、30、
35サイクルで反応混合物から10μのアリコートを採取
して、２％アガロースゲルに適用した。逆転写酵素で処
理した患者ＦのRNAについては既に259サイクル後に予期
される330 bp HIVアンプリマー（amplimer）フラグメン
トが確認され、HIV RNAが患者の血清に存在することを
示唆していた。

実施例A5:数種のカオトロピック物質を用いるDNA精製 50μのヒトの血清試料10個を、C I及びC II形態
（方法の項参照）からなるそれぞれ10μｇの精製pGem3p
24 DNAと混合した。これら10個のプラスミド／血清混合
物を、プロトコルＹ＊に基づいて抽出用インプット材料
として使用した。使用したカオトロピック物質の濃度に
ついては表A5.1を参照のこと。

抽出後に、各試料から溶離したDNAの25％を0.8％アガ
ロースゲル上で分析した。プラスミドDNA回収の定量化
を可能とするために、インプットDNAを同様に同一ゲル
上に直接ロードした。

電気泳動後にゲルを紫外線照射下で撮影し、DNA回収
効率をプラスミド帯強度（表A5.1の表の説明を参照）を
基に視覚的に評価した。

カオトロピック物質としてNaI及びNaSCNを使用して、
同様に実験を実施した（下記の試料の説明を参照）。

表A5.1での結果は、8M尿素を組み合わせた3M KI、3M
NaI又は3M NaSCNをカオトロピック物質として使用する
と、共有結合閉鎖（C I）及び緩和環状（C II）pGem3p2
4 DNAが効率的に単離されることを示している。C IIの
収率はC Iと比較して比較的高いようである。

セクションB:ヒトの全血からのDNA/RNAの精製 1mlのヒトの血液は、核生成せず従って血液のNA量に
寄与しない約５×10⁹の赤血球を含んでいる。血液のNA
量は主に白血球細胞（約４−10×10⁶/ml）により決定さ
れる。多量のタンパク質（血液中、約70mg/ml）を含む
水性媒体（血漿）にこれらの細胞が埋め込まれている。
従って、全血はNA精製にとって極めて不純な源である。
セクションＢの実施例は、にもかかわらずNAをプロトコ
ルＢ及びＹにより全血から単離することができることを
示している。

実施例B1:ヒトの全血からのDNAの単離ヒトの血液（500μ）を、既知量の精製DNA［100μ
のLMW（45μｇ）、80μのC I/II（40μｇ）］と混
合し、68μの試料10個をプロトコルＢにおける10個の
DNA抽出用インプット材料として使用した。この実験で
は、試験管に存在するSC（シリカ粗材の懸濁液）の量を
2.5〜40μの間で変動させた。抽出を二重に行い、各
試料からの溶離DNAの半分（30μ）を、１％アガロー
スゲルを支持体とする電気泳動にかけた。比較のため
に、インプットDNAの半分の量を同様に同一ゲル上にロ
ードした。

10μを越えるSCを使用すると、二重鎖DNA、線状共
有結合閉鎖（C I）DNAも緩和環状（C II）DNAもヒトの
全血から効率的に単離された。全血から回収されるDNA
の量は、約10μまではSCの量に比例していた。量が多
くなると飽和するようである。

実施例B2:ヒトの全血から単離したDNAは制限酵素及びT4
DNAリガーゼに対して良好な基質であること精製DNA調製物を、50μのヒトの血液試料12個に加
えた。プロトコルＢに従ってこれら12個の混合物からDN
Aを単離した。50μのTEで溶離が生じた。溶離したDNA
の半分を以下の３種の制限酵素：EcoR I,BamH I,Bal II
（これらはそれぞれ低温、中塩及び高塩緩衝液で活性を
有する）のいずれか１つで処理するか、T4 DNAリガーゼ
で処理するか、又は処理しなかった。DNA試料を１％ア
ガロースゲルを支持体とする電気泳動にかけ、紫外線照
射により可視化した。

T4リガーゼ処理（37℃で１時間、30μの反応容量中
に３単位のT4リガーゼ）の結果は、DNAフラグメントの
分子量の増加を示すと共に、ヒトの血液から単離したDN
Aはエキソヌクレオリティックな分解の影響をそれほど
受けないことを示している。

精製プラスミド（pCMV−E;3.3μg;1.5μ）を加えた
８個の血液試料の結果はそれぞれ、EcoR I、BamH I、Ba
l IIダイジェストに対して、総ての制限酵素がプラスミ
ドを線状化したことを示している。総ての制限酵素は９
単位の酵素と共に、37℃で１時間30μの反応容量中で
インキュベートした。

実施例B3:10個の異なる血液試料からのDNAの単離この実施例では、血液バンクから無作為に選択したヒ
トの血液の異なる10個の試料を出発材料として使用し
た。各試料において白血球細胞（WBC）の数は知られて
いた。プロトコルＢに従って50μの試料からDNAを精
製し、75μのTEで溶離が生じた。単離したDNAの三分
の一を１％アガロースゲルに直接適用し、残余部分（２
μ）をPCR用に使用した。

３μのLMW−DNA（６μｇ）を50μの各試料に加え
た後に、同一の試料で同一の単離作業を実施した。この
場合も25μの溶出液（eluate）（75μ）をゲルに直
接適用した。25μの溶出液の他の部分を最初にT4 DNA
リガーゼで処理し（37℃で１時間、30μの反応容量中
に2U）、次いで同一ゲルに適用した。

血液試料１〜10の白血球細胞（WBC）の含量は以下の
通りであった。試料番号 WBC×10⁹/ 試料番号 WBC×10⁹/ １ 4.9 ６ 8.3 ２ 5.1 ７ 8.5 ３ 5.9 ８ 9.2 ４ 6.7 ９ 10.3 ５ 7.7 10 10.5 実施例B4:ヒトの白血球細胞中のヒトのβ−グロビン遺
伝子検出用ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルＢに基づいてヒトの全血から単離したDNA
がTaq−DNAポリメラーゼに対して良好な基質であること
を示すために、実施例B3に従って10個の異なる血液試料
から単離した２μのDNAを、β−グロビン特異的プラ
イマーを含むPCRで処理した。PCRは32サイクルからな
り、各サイクルは94℃で１分間、次いで65℃で３分間で
あった。アンプリマーの一部（50％）を２％アガロース
ゲルを支持体とする電気泳動にかけた。120bpのアンプ
リマー及びプライマー帯を検出することができた。

実施例B5:ヒトの血液からのDNA及びssRNAの同時精製
（再現性） DNA及びRNAを再現し得る形で人の血液から精製できる
ことを示すために、一人のヒトから得た各々が50μの
６個の血液試料をプロトコルＹに基づいて処理し、RNAs
in（0.5U/μ）を含む75μのTEでNAを溶離した。溶
出液の一部25μを中性１％アガロースゲルに適用し
て、電気泳動にかけた。結果は、DNA及びRNAが検出でき
ることを示している。

実施例B6:ヒトの血液（10個の異なる試料）からのDNA及
びssRNAの同時精製 10人の異なるヒトから得た50μの血液試料（実施例
B3参照）をプロトコルＹに基づいて処理し、0.5U/μ
のRNAsinを含む40μのNAを溶離した。溶出液の一部30
μを中性１％アガロースゲルを支持体とする電気泳動
にかけた。結果は、DNA及びRNAが検出できることを示し
ている。

実施例B7:ヒトの血液からのDNA及びssRNAの同時精製外因性RNA源をヒトの血液試料に加えた。哺乳動物の
細胞又は細菌を外因性RNA源として使用した。プロトコ
ルＹに基づいて試料NAを単離し、RNAse A（40ng/μの
溶離用緩衝液）の不存在下又は存在下において、50μ
TE＋0.5U/μRNAsinで溶離した。50μの血液試料に
対して５×10⁵ラット10B細胞（Boom等、J.Gen.Virol.6
9,1988,1179）を哺乳動物細胞として加え、50μの血
液に対してプラスミドpCMV−Ｅを含むE.coli細胞株HB10
1の100μ一晩培養物の細胞ペレットを細菌として加え
た。

結果は、哺乳動物のssRNA（18S及び28SリボソームRN
A）も細菌性ssRNA（16S及び23SリボソームRNA）もヒト
の全血から精製され得ることを示している。

更には、ゲノムDNA及びプラスミド（形態Ｉ）DNAが効
率的に回収される。

セクションC:ヒト尿からのDNA/RNA精製ヒトの尿ではNAは、例えばウイルスまたは細菌中や尿
路由来の細胞中に存在し得る。量は普通、エチジウムブ
ロミド/NA複合体のアガロースゲル電気泳動及びUV照射
による検出が不可能なほど少ない。ヒト尿からDNAを精
製し得ることを示すために、マイクログラム量の精製DN
Aを尿に添加し、続いてプロトコルＢに従ってDNAを単離
した（実施例C1）。ヒト尿からDNAとRNAとを同時に精製
し得ることを示すために、培養した細菌（小プラスミド
保有）を尿に添加し、続いてNAをプロトコルＹに従って
単離した（実施例C2）実施例C3は、プロトコルＹ＊により核酸結合性固相と
してシリカと共に、GuSCNに替えてKI、NaI及びNaSCNの
ような別のカオトロピック物質を用いてもヒト尿からDN
Aを精製し得ることを示す。

実施例C1:ヒト尿からのDNA精製３μｌのLMW DNA（６μｇ）を、任意に選択した10
の、様々な混濁度の50μｌヒト尿試料に添加した（試料
第４号、第５号、第６号及び第７号は澄明であり、試料
第１号、第２号、第３号及び第８号は僅かに混濁し、試
料第９号及び第10号は非常に混濁していた）。DNAをプ
ロトコルＢに従って単離し、75μｌのTE緩衝液で溶離し
た。各溶出物の1/3を１％アガロースゲルに適用した。
別の部分25μｌを1.8UのT4 DNAリガーゼで（反応量30μ
ｌにおいて37℃で１時間）処理し、やはり上記ゲルに適
用した。マーカーレーンはLMW DNA及びMMW DNAをそれぞ
れ含有する。マーカーレーン中のLMW DNAの量（２μ
ｇ）は、抽出効率100％で観察されるべき量を表す。

実験結果は、プロトコルＢでヒト尿からDNAを有効に
精製し得、得られるDNAはT4 DNAリガーゼのための優れ
た基質であることを示す。

尿試料第10号から単離したLMW DNAは明らかに分解さ
れていた。しかし、（この実験で用いたような）裸のDN
Aは尿試料中にヌクレアーゼが豊富であれば分解される
だろうと予想できた。従って、分解は精製時にではな
く、それ以前の尿/DNA混合物調製時に起こったと考えら
れる。次の実施例（C2）は、（裸の場合に反して）細胞
中に存在するDNAは、特にssRNAまでもが尿試料第10号か
ら有効に回収できることを示す。

実施例C2:ヒト尿からのDNAとssRNAとの同時精製この実験では、実施例C1で用いたのと同じ10の尿試料
を、2.4kbのプラスミド（pCMV−Ｅ）を保有する細菌と
混合した。混合物からNAをプロトコルＹに従って単離
し、かつ75μｌのTE緩衝液中に0.5U/μl RNAsinを用い
て溶離した。溶出物の1/3を１％アガロースゲルでの電
気泳動に掛けた。溶出物の別の部分25μｌを10Uの、pCM
V−Ｅを直鎖化する制限酵素EcoR Iで処理した（反応量3
0μｌにおいて37℃で１時間）。この処理は40ng/μl RN
Ase Aの存在下に行なった。電気泳動の結果は、23S及び
26SリボソームRNA、並びに共有結合で閉じた形態（C
I）及び直鎖形態（C III）のプラズミドDNAを示す。

実施例C3:他のカオトロピック物質を用いるDNA精製ヒト尿（50μｌ）を、400μｌのカオトロピック物
質、溶菌（lysis）緩衝液L6＊及び１μｇのpGem3p24 DN
Aと混合した。得られた懸濁液を全部、プロトコルＹ＊
によりDNAを精製するべく500μｌのカオトロピック物質
（表C3.1参照）及び40μｌのSiO₂に混合添加した。尿か
ら単離したDNAの量を、アガロースゲル電気泳動を用い
て解析した。DNA回収効率を実施例A5に述べたようにし
て判定した結果を表C3.1にまとめる。

表C3.1は、C I型及びC II型プラスミドDNAのDNAバン
ドの収率が同じであったことを示す。

実施例D1:ヒト糞便からのロタウイルスdsRNA精製レオウイルス（Reovirdae）科のウイルスは、二重鎖R
NAから成るゲノムを有する。この科に属する重要な病原
体は、重症の下痢を惹起し得、従って糞便試料中に大量
に存在するロタウイルスである。ロタウイルスのゲノム
は11個のdsRNAセグメントから成り（Hishino in J.Cli
n.Microbiol.21,1985,425参照）、これらのdsRNAセグメ
ントはプロトコルＢによって糞便上清から単離可能であ
る。下痢試料を12000×ｇで２分間遠心分離して得た上
清100μｌを用いて単離を行なった。

ロタウイルスに感染したことが（Wellcomeロタウイル
スラテックス試験及びKallestad Pathfinderロタウイル
ス直接抗原検出系によって）確認された６人の異なる患
者から採取した試料を用いた結果、dsRNAを抽出できる
ことが判明した。

最初の遠心分離ステップを省略し、糞便試料を直接プ
ロトコルＢまたはＹのためのインプット物質として直接
用いても同様の結果（普通、ロタウイルスdsRNA収率は
より高い）が得られた。

実施例E1:ヒト血液、血清及び尿からのssDNA精製臨床試料から一重鎖DNAも単離できることを示すため
に、１μｇ（４μｌ）の精製ファージM13 DNA（Boehrin
ger社のM13mp9 DNA）を50μｌのヒト血清、ヒト血液ま
たはヒト尿に添加し、プロトコルＢまたはプロトコルＹ
によって精製した。いずれの抽出作業も４回ずつ行なっ
た。DNAを50μｌのTE緩衝液中に溶離し、25μｌを１％
アガロースゲルでの電気泳動に掛けた。マーカーレーン
は500ngのM13ssDNAを含有する。

この実験の結果から、一重鎖DNAをヒト血液、血清ま
たは尿からプロトコルＹによって、また程度はより低い
がプロトコルＢによっても単離できることが判明した。

セクションF:NAのケイ藻土への結合ケイ藻土の組織はほぼ完全にSiO₂から成るので、ケイ
藻土が使用シリカとして有用であるかどうか調べた。５
種の異なる市販ケイ藻製品［Janssen Biochimica,Louva
in,BelgiumのCelatom FW14、Celatom FW50、Celatom FW
60、Celite（AK）及びCelite 521］各10gを50mlの２回
蒸留水及び500μｌの37％HClと混合し、得られた懸濁液
をオートクレーブで20分間121℃に加熱した。実施例F1
及びF2において、上記のように生成した懸濁液をプロト
コルＹによるNA抽出に用いた実施例F1:ヒト血液からのNA単離ヒト血液を、プラスミドpCMV−Ｅを保有するE.coli H
B101細菌と混合し、一晩経過した培養物100μｌの細菌
ペレットを50μｌの血液に添加した。50μｌ試料を、プ
ロトコルＹによるNA抽出のためのインプット物質として
用いた。40μｌのSCに替えて、40μｌの上記ケイ藻土懸
濁液を用いた。NAを75μｌのTE緩衝液中にRNAse阻害物
質を用いずに溶離し、20μｌの溶出物を直接ゲルに付与
した。別の20μｌの溶出物を、9UのBamH Iを伴ったRNAs
e A（40ng/μｌ）で反応量25μｌにおいて37℃で１時間
処理してからゲルに付与した。

マーカーレーンは１μｇのMMW DNAを含有する。

得られた結果から、ケイ藻土懸濁液がSCに類似のNA結
合特性を有することが判明した。dsDNA（成分Ｉ分子）
とssRNA（23S及び16S rRNA）との両方が結合した。プラ
スミドDNAは、BamH Iによって完全に直鎖化される（成
分III）ほど十分に純粋であった。

実施例F2:グラム陰性菌からのNA精製ヒトにおいて疾病を惹起することが知られている９種
類の異なるグラム陰性菌種を固形寒天プレート上で培養
した。上記各細菌種を５〜10μｌずつプレートから掻き
取って、プロトコルＹによるNA抽出のためのインプット
物質として用い、また40μｌのSCかまたは40μｌのCeli
te 521懸濁液をNAキャリヤーとして用いた。

SCを用いた抽出は最初の洗浄の間に停止しなければな
らなかったが、これは、たとえ（３分を越える）長時間
渦形成を行なったとしてももはやNAシリカ複合体を均質
化し得なくなったからである。他方、Celite 521を用い
た抽出は問題無く続行することができたが、これはおそ
らくケイ藻土の粒径がSC粒子の粒径より大きかったため
であろう。NAを70μｌのTE緩衝液で、RNAsinを用いずに
溶離し、溶出物の一部（20μｌ）を１％アガロースゲル
での電気泳動に掛けた。

マーカーレーンは１μｇのMMW DNAを含有する。次の
ような細菌に関する結果を得た。

1:Campylobacter pylori 2:Yersinia enterolytica type 3 3:Neisseria meningitidis 4:Neisseria gonorrhoeae 5:Haemophilus influenzae type b 6:Kelbsiella pneumoniae 7:Salmonella typhimurium 8:Pseudomonas aeruginosa 9:Escherichia coli K1−083 この方法で、HMW細菌DNA及びrRNAを検出することがで
きた。

セクションG:Escherichia coli JM101のDNA/RNA精製グラム陰性菌からのNAの単離が、本発明により可能で
ある。細菌細胞中には、高レベルの高分子量DNA（HMW D
NA）及びリボソームRNAが存在する。実施例G1は、細菌
細胞からNAを、NA結合性固相としてシリカと共に様々な
カオトロピック物質を用いて精製できることを示す。

実施例G1:NA結合性固相として様々なカオトロピック物
質及びシリカを用いて行なう細菌細胞からのNA単離／精
製（内在）一晩経過した細菌培養物JM101 50μｌからNAを、900
μｌのカオトロピック物質及び40μｌのSiO₂の存在下に
単離した。高レベルのHMW DNA及び内在リボソームRNA
（16S及び23S）が、エチジウムブロミドで染色したゲル
のUV照射によって単離NAを検出することを可能にする。
単離はプロトコルＹ＊に従って行ない、溶出NAの25％
（40μｌ部分）をアガロースゲル上で解析した。

凡例：アガロースゲル解析の結果を表G1にまとめる。HMW DN
A及びrRNA回収の定量を、シリカと共に用いるカオトロ
ピック物質がGuSCNであった場合と比較した。表G1中の
“1"は、DNAまたはRNA回収の効率が同等であることを表
す。表G1中の“＞1"は回収効率がより高いことを表す。

細菌細胞からの内在RNA単離のための基準として、E.c
oli rRNAマーカー（Boehringer）を用いた。

セクションH:カオトロピック物質としてグアニジニウム
チオシアネートと、NAを結合させ得る別の固相とを用い
るDNA精製 GuSCN及び幾つかのシリカ誘導体またはラテックス粒
子（参考例）（“材料及び方法”参照）を用いてNA単離
／精製を行ない得ることを示すために、純粋なプラスミ
ドを低塩緩衝液（Tris 10mM−EDTA 1mM,pH8.0）に添加
し、その後プロトコルＹに従って単離したが、その際ス
テップ７及び９は省略した（TEでの溶離を行なわなかっ
た）。結合したNAを伴ったシリカ／ラテックス粒子をPC
R反応混合物中に導入した。単離したDNAはPCR法によっ
て検出し得る。実施例H1は、カオトロピック物質として
のGuSCNと共に別の固相を用い、かつPCR法で検出を行な
うことによってNAを精製し得ることを示す。

実施例H1:GuSCN及び別の固相を用いるDNA精製 50μｌのTris 10mM/EDTA 1mM（pH8.0）中に存在する
0.5μｇのpGem3p24を、80μｌのシリカ懸濁液または80
μｌのラテックス懸濁液（参考例）（“材料及び方法”
参照）及び900μｌの溶菌緩衝液L6と混合した。

プロトコルＹにより洗浄し、かつ56℃で乾燥した後
（溶離ステップ省略）、ペレットを50μｌの水に再懸濁
した。プラスミド−シリカ懸濁液の20μｌ部分を、HIV
特異的プライマー（“材料及び方法”参照）の存在下に
PCR混合物中に用い、５μｌの10倍濃縮PCR緩衝液と、１
μｌの10mM dNTPと、２単位のTap DNAポリメラーゼと、
最終量を50μｌとする量の水とを添加して増幅反応を開
始させた（95℃で１分、37℃で１分、更に72℃で３分を
１周期とする）。

30周期後、反応混合物から10μｌアリコートを取り分
け、２％アガロースゲル上で解析した。ラテックス粒子
でNAを単離した場合、シリカで単離した場合のようなペ
レットは得られなかった。

1mlの洗浄液L2を300μｌの70％EtOHと混合したとこ
ろ、二つの液相間にラテックス含有バンドが見いだされ
た。ラテックス粒子はその色によって検出可能である。
単離したラテックス含有画分を70％EtOHで２回洗浄し、
遠心分離すると、該画分はEppendorff管内で小さいペレ
ットを形成した。

セクションＩ（参考例）:NA結合フィルター及びGuSCNを
用いる精製プロトコルＹ＊＊による核酸の単離では、SiO₂の替わ
りにNA結合フィルター（“材料及び方法”参照）を用い
得る。

低塩緩衝液（Tris 10mM−EDTA 1mM,pH8.0）中では通
常DNAの放出が起こらないが、場合によって生起するこ
の問題点は、DNAを結合させたフィルターからDNAを溶離
する替わりに該フィルターをPCR反応混合物中に挿入す
ることによって排除できる。実施例I1は、NA結合フィル
ター及びカオトロピック物質としてのGuSCNを用い、か
つPCR法で解析することによってNAを精製し得ることを
示す。

実施例I1:DNA結合フィルターを用い、かつPCR増幅によ
る検出を行なうDNA単離／精製 Tris 10mM/EDTA 1mM（pH8.0）50μｌ中の純粋なpGem3
p24 DNA（濃度１μｇ、0.01μｇ及び0.005μｇ）を、寸
法1cm×1cmの３個のDNA結合フィルター及び900μｌのGu
SCN（溶菌緩衝液L6）に添加した。

（プロトコルＹ＊＊による）洗浄（遠心分離ステップ
省略）及び56℃での乾燥の後、DNAを結合させたフィル
ターを直接PCR混合物中に導入した。HIV特異的プライマ
ーの存在下に、PCRサイクラーで増幅を行なった。

反応混合物は更に、５μｌの10倍濃縮PCR緩衝液と、
１μｌの10mM dNTPと、２単位のTap DNAポリメラーゼ
と、最終量を50μｌとする量の水とを含有する。続い
て、増幅反応を開始させた。

30周期後、反応混合物から10μｌアリコートを取り分
け（実施例H1参照）、２％アガロースゲル上で解析し
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者テイム・キエフイツオランダ国、2593・ヘー・エー・デン・ハーグ、スタイフエサントストラート・ 183 (72)発明者ペテル・フランクリン・レンスオランダ国、1015・ヘー・カー・アムステルダム・ブラウエルスフラフト・823

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を含有する複合生物出発材料から核酸
を単離するための方法であって、複合生物出発材料、カ
オトロピック物質及びシリカ又はその誘導体を含む核酸
結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を液体から分
離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を洗
浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離することを
特徴とする方法。
【請求項２】使用される複合生物出発材料が全血、血
清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾
液、組織又は細胞培養物であることを特徴とする請求項
１に記載の方法。
【請求項３】使用されるカオトロピック物質がグアニジ
ニウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イ
ソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み
合わせから構成される群から選択されることを特徴とす
る請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】グアニジニウム塩が（イソ）チオシアン酸
グアニジニウムであることを特徴とする請求項３に記載
の方法。
【請求項５】核酸結合性固相がシリカ粒子を含むことを
特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】0.05〜500μｍの範囲の粒径を有するシリ
カ粒子を使用することを特徴とする請求項５に記載の方
法。
【請求項７】１〜200μｍの範囲の粒径を有するシリカ
粒子を使用することを特徴とする請求項５に記載の方
法。
【請求項８】得られた固相−核酸複合体を沈澱させ、か
つ上清を廃棄することにより液体から分離し、その後、
カオトロピック物質を含有する洗浄用緩衝液で複合体を
洗浄することを特徴とする請求項１から７のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項９】洗浄用緩衝液で洗った固相−核酸複合体を
更に１種以上の有機溶剤で連続して洗浄し、その後、乾
燥することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】洗浄及び乾燥した固相−核酸複合体中に
存在する核酸を溶離用緩衝液により溶離することを特徴
とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】得られた固相−核酸複合体を増幅用の複
数の成分の混合物と接触させ、該固相に結合しているか
又は該固相から溶離した核酸を増幅することを特徴とす
る請求項１に記載の方法。