JP2001078790A

JP2001078790A - 核酸の単離方法

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Publication number: JP2001078790A
Application number: JP2000247680A
Authority: JP
Inventors: Willem R Boom; ウイレム・レネ・ボーム; Henriette M A Adriaanse; ヘンリエツテ・マリア・アレイダ・アドリアーンセ; Tim Kievits; テイム・キエフイツ; Peter F Lens; ペテル・フランクリン・レンス
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1989-03-23
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2001-03-27
Also published as: ES2085245T5; ZA902190B; ES2085245T3; JP2680462B2; DE69031237T3; KR900014594A; DE69031237D1; KR0148693B1; AU641641B2; NL8900725A; DK0389063T4; EP0389063A3; DE389063T1; EP0819696A3; ES2085245T1; CA2012777A1; JPH1072485A; CA2012777C; EP0389063B1; EP0389063A2

Abstract

(57)【要約】【課題】複雑な生物出発材料から核酸を迅速かつ簡単
で、非損傷状態及び高純度で直接に単離する。【解決手段】核酸を含有する出発材料から核酸を単離
するための方法であって、出発材料、カオトロピック物
質及び核酸結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を
液体から分離し、その後、こうして得られた固相-核酸
複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離
することを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は核酸を含有する出発
材料から核酸を単離するための方法及び手段の組み合わ
せ、並びに該方法により得られた核酸を増幅する(ampli
fy)するためのテストキットに係る。より特定的には、
本発明は全血、血清、バフィーコート（血液の炎症性痂
皮又は白血球フラクション）、尿、糞便、脳脊髄液、精
液、唾液、組織、細胞培養物等のような、核酸を含有す
る生物材料から核酸を単離するための方法及びキットに
係る。上記生物材料から単離された核酸は、サンプルを
採取した生物に内在する核酸及び外来性（ウイルス、真
菌、細菌又は寄生虫に由来する）核酸も含有し得る。

【０００２】

【従来の技術】全血、血清、尿又は糞便のような複雑な
出発材料から核酸(NA)を単離する既知の方法は通常、タ
ンパク質分解酵素の存在下で生物材料を洗剤により溶解
させた後、有機溶剤（例えばフェノール及び／又はクロ
ロホルム）で数回抽出し、エタノール沈降させ、核酸を
透析することにより実施される。例えば臨床材料から
（二重鎖）DNAを単離するこれらの既知の方法は多大な
労力と時間を必要とする。このような出発材料からNAを
精製するためには比較的多数の段階が必要とされるの
で、数個の臨床サンプルを同時に処理する場合、サンプ
ル間にNAが伝播される危険が大きい。核酸増幅法、例え
ば最も感受性の高いポリメラーゼ鎖反応（PCR,Saiki
他、Science230,1985,1350）により例えば病原体（例え
ばウイルス又は細菌）におけるNAの存在を後で検出する
ためにNAを単離する場合、このように異なるサンプル間
でNAが伝播される危険が大きいと、誤って陽性の結果が
生じ、重大な問題である。

【０００３】汚染に対して感受性のこのような既知の方
法の1例は、組織及び細胞培養物から全RNAを単離するた
めの方法としてAnalyticalBiochemistry162,1987,156に
記載されている方法である。この方法によると、生物出
発材料からRNAを酸性チオシアン酸グアニジニウム-フェ
ノール-クロロホルム混合物で1回抽出する。相分離後、
更に水相を処理することにより有用な条件下で4時間以
内にRNAを回収することができる。

【０００４】AnalyticalBiochemistry162,1987,463に
は、塩酸グアニジンを含有する緩衝液に細胞を分散し、
エタノール沈降させることにより、組織及び細胞系から
DNAを単離するための方法が記載されている。この方法
は汚染に対して感受性であるが、分離したDNAを更に処
理してから数時間以内に有用なNA産物を単離することが
できる。

【０００５】しかしながら、これらの既知の方法は複雑
な出発材料（例えば全血及び血清）中では首尾よく使用
することができない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、既知
の方法の欠点を解消するような方法を提供することであ
る。

【０００７】より特定的には本発明の目的は、種々の生
物材料のような複雑な出発材料から核酸（即ちDNA及び
／又はRNA)を未曾有の迅速さで簡単且つ再現可能に、し
かもその後、分子生物反応における反応剤として使用可
能な非損傷状態及び高純度で直接（前処理を介さずに）
単離することが可能な方法を提供することである。

【０００８】本発明の別の目的は、他のサンプル及び人
体に対する汚染の危険が低いという点で既知の方法と異
なり、即ち異なるサンプル間におけるNAの伝播の危険を
最小にしながら数個の臨床サンプルを同時に処理するこ
とが可能な方法、並びに被処理サンプル中に存在し得る
ウイルス又は細菌が人体に伝染する危険を最小にするこ
とが可能な手段を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】これらの目的は本発明に
従い、出発材料をカオトロピック物質及び核酸結合性固
相と混合し、核酸が結合した固相を液体から分離し、そ
の後、こうして得られた固相-核酸複合体を洗浄し、必
要に応じて核酸を該複合体から溶離することを特徴とす
る、核酸を含有する出発材料から核酸を単離するための
方法により実現される。

【００１０】広義には本発明はあらゆる核酸含有出発材
料（ウイルス又は細菌に感染した食品及び類似製品、ワ
クチン及びミルクを含む）に適用できるが、使用される
出発材料が全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳
脊髄液、精液、唾液、組織及び細胞培養物（例えば哺乳
動物細胞培養物及び細菌培養物）のような核酸含有生物
材料であるような方法に特に適用される。当然のことな
がら、本発明の方法はPCR産物又は更に精製を要する別
の核酸回収方法の産物のような比較的純粋な出発材料に
も適用できる。しかしながら、核酸含有生物材料の種類
によっては（例えば植物材料、ある種のグラム陽性菌並
びにある種の酵母及びカビ）は特殊な細胞壁構造により
カオトロピック物質に溶解しないため、出発材料として
本発明の方法で直接使用することはできない。従って、
このような出発材料は入手形態の細胞に前処理を施す必
要があり、例えば予め細胞を溶解させてから得られた溶
解物に本発明の方法を実施すればよい。

【００１１】核酸（NA）なる用語は、任意の可能な構
造、即ち二重鎖(ds)核酸、又は一重鎖（ss）核酸、又は
その組み合わせ（部分的ds又はss）としてのDNA及びRNA
を意味する。

【００１２】本発明の主眼は、カオトロピック物質の存
在下でNAと結合することが可能な核酸結合性固相、例え
ばシリカ粒子を使用する点にある。シリカなる用語は、
SiO _２結晶及び他の形態の酸化ケイ素、SiO_２から構成さ
れるケイソウ植物の骨格、無定形酸化ケイ素並びにガラ
ス粉末を意味する。アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウ
ム（ゼオライト）、−NH_２を有する活性シリカ、ラテッ
クス粒子、キュベットもしくは微量滴定プレートの内壁
を形成するある種のポリマー材料、又は例えばニトロセ
ルロースから構成されるフィルター材料も本発明の核酸
結合性固相として使用できる。

【００１３】シリカ粒子の使用に関しては、カオトロピ
ック塩NaI（ヨウ化ナトリウム）の高濃度溶液中のdsDNA
をアガロースから遊離させ、ガラスに結合できることが
PNAS76,1979,615により知見された。この文献はアガロ
ースゲルからDNAを単離するための2種の方法について記
載しており、そのいずれも第１段階でアガロースを溶解
するためにNaI溶液を使用している。一方の方法では第
２段階でDNAをアセトンで沈降させ、他方の方法では第
２段階でDNAをガラス粒子に結合し、その後、水性緩衝
液に溶離する。しかしながら、この方法では体液及び他
の生物出発材料のような複雑な出発材料を使用できな
い。更にこの論文は、本発明の1段階方法については開
示していない。

【００１４】本発明によると、結合し、その後、溶離さ
れる高純度の核酸を不純な出発材料から直接得られるよ
うに、適当に選択した粒径を有するシリカ粒子を使用す
ることが好ましい。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の好適態様は、実質的に0.
05〜500μｍの範囲の粒径を有するシリカ粒子を使用す
ることを特徴とする。「実質的に」なる用語は、シリカ
粒子の80％以上、好ましくは90％が規定された粒径範囲
に該当することを意味する。結合したNAを容易に処理で
きるようにするためには、使用されるシリカ粒子は実質
的に0.1〜200μｍの範囲の粒径を有すると好適であり、
使用されるシリカ粒子が実質的に1〜200μｍの範囲の粒
径を有するような方法が最適である。実際に、シリカ粒
子のNA結合能は粒子が小さければ小さいほど高いが、特
にNA含有量の高い出発材料の場合、及びNA分子が比較的
長い場合は、過度に小さいシリカ粒子を使用すると、形
成されるNA-シリカ複合体をそれ以上有効に再分散する
ことができなくなる。換言するならば、結合したNAを純
粋な形で複合体から回収することができない。人血を出
発材料として使用する場合、0.2〜10μｍの範囲の粒径
を有する非分画シリカを使用すると、このような問題が
生じることがある。それ以上再分散することができない
凝集物の形成は、粒径が1〜10μｍの範囲の分画したシ
リカを使用することにより避けることができる。しかし
ながら、細菌培養物のように細胞中の濃度が高い出発材
料を使用する場合、このような粗いシリカフラクション
の使用は再分散し難い凝集物の形成を避けるためには不
十分であり、2〜200μｍの粒径を有するケイソウ土のよ
うなもっと粗いシリカを使用すると、最適の結果が得ら
れることが判明した。

【００１６】別の好適態様によると、NA結合性固相はフ
ィルター形態であるか、又はサンプルとカオトロピック
物質とを収容する容器の一部を形成する。NA結合性固相
を後者の形態に選択すると、その後のサンプル処理及び
NA単離のために遠心分離又は濾過を実施する必要がなく
なる。

【００１７】本発明によると、シリカ粒子のような上記
核酸結合性固相以外にカオトロピック物質を使用するこ
とが不可欠である。カオトロピック物質なる用語は、タ
ンパク質及び核酸の二次、三次及び／又は四次構造を変
えることが可能であり且つ少なくとも一次構造を無傷に
しておくことが可能な任意の物質を意味する。具体例は
（イソ）チオシアン酸グアニジニウム及び塩酸グアニジ
ンである。核酸を含有する出発材料からNAを単離するた
めに、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チ
オシアン酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み合わせ
も核酸結合性固相と組み合わせて使用すると非常に好適
である。本発明によると、使用されるカオトロピックグ
アニジニウム塩は好ましくはチオシアン酸グアニジニウ
ム(GuSCN)である。

【００１８】本発明は通常、出発材料を十分大きい量の
カオトロピック物質（例えばグアニジニウム塩）及び例
えばシリカ粒子と混合し、出発材料中に存在する核酸の
ほぼ全体を遊離させ、該シリカ粒子に結合させるように
実施される。適当なプロトコールによると、例えば、反
応容器中に存在するGuSCN緩衝溶液にシリカ粒子懸濁液
を加え、その後、サンプルを加えて十分に混合する。や
がて、細胞が溶解し、ウイルスが存在する場合はウイル
スも溶解し、遊離したNAがほとんど即座にシリカ粒子に
結合する。次に、形成されたシリカ-核酸複合体を例え
ば迅速沈澱（遠心分離）及び上清の廃棄（例えば吸引に
よる）により液体から分離し、その後、複合体（例えば
シリカ-核酸ペレットの形態）を例えばボルテックスミ
キサーを使用してカオトロピックグアニジニウム塩を含
有する洗浄用緩衝液で洗浄（再分散又は均質化）し、再
び沈澱させる。好ましくは、洗浄用緩衝液で洗ったシリ
カ-核酸複合体を更にアルコール水溶液（収率の損失を
制限するために最適には約70％エタノール）及びアセト
ンで洗い、その後、（例えば加熱下に）乾燥してアセト
ンを除去する。次に、洗浄及び乾燥したシリカ-核酸複
合体中に存在するNAを水性溶離用緩衝液(elutionbuffe
r)により溶離する。溶離用緩衝液の選択は単離されるNA
の使用目的に応じて決定される。適当な溶離用緩衝液の
例はTE緩衝液、2回蒸留水(aquabidest)及びPCR緩衝液
（「材料及び方法」の項参照）である。

【００１９】好ましくは、これらの全段階を単一の反応
容器（例えば容量1.5mlのポリプロピレン製エッペンド
ルフチューブ）中で実施し、比較的少量、例えば100μl
未満の精製NAを回収する。こうして単離したNAは核酸分
解酵素を含有せず、DNAポリメラーゼ（例えばTaq-DNAポ
リメラーゼ）、DNA制限酵素、DNAリガーゼ及び逆転写酵
素（例えばAMV逆転写酵素）のような種々の酵素の基質
として直接使用できるような高純度を有する。

【００２０】本発明の方法によると、PCR法又はヨーロ
ッパ特許第EP0329822号に記載されている所謂NASBA法
（NASBA＝核酸配列に基づく増幅）のような増幅方法に
よりNA配列を証明できる程に、例えば血漿及び血球を予
め分離することなく約45分間に50μlの全血から十分な
量のNAを単離することができる。一方、本発明は血清、
糞便、尿等のようなNAを含有する他の種々の生物材料に
も適用することができる。このため、本発明は細菌及び
ウイルス感染の診断において、並びに出生前診断及び遺
伝性腫瘍体質の診断の領域における遺伝的多形性の研究
において有用である。

【００２１】本発明のNA単離方法は、全手順を単一の反
応容器中で実施することができ、方法の第１段階で粗出
発材料から遊離したNAが完全な別の精製過程の間に少な
くとも固相の大部分に結合するので、汚染の危険が非常
に低い。ウイルス又は細菌に感染している可能性のある
材料の処理に伴う人体への危険は、サンプルを反応容器
に入れる単離過程の第１段階にほぼ限定される。この第
１の処理において、潜在的に存在する病原体は有効に不
活化される。本発明の方法は特殊な周辺技術（ボルテッ
クスミキサー、12000ｇエッペンドルフ型の遠心分離機
及び水浴又はエッペンドルフ加熱ブロックが標準実験技
術に属する）も生化学の専門的知識も必要としないの
で、多数のサンプルから機械的にNAを単離するため、換
言するなら自動化に非常に適している。本発明の方法を
使用すると、10個以上、あるいは24個以上の異なるサン
プルを約1時間で処理することができる。

【００２２】本発明は核酸を含有する出発材料から核酸
を単離するための方法のみならず、そのための手段の組
み合わせ及び該方法により得られた核酸を増幅するため
のテストキットにも係る。

【００２３】1態様によると、本発明の手段の組み合わ
せは、(a)（イソ）チオシアン酸グアニジニウムを含有
する溶解用緩衝液(lysisbuffer)、(b)実質的に0.05〜50
0μｍ、好ましくは0.1〜200μｍ、最適には1〜200μｍ
の範囲の粒径を有するシリカ粒子の水性懸濁液、(c)
（イソ）チオシアン酸グアニジニウムを含有する洗浄用
緩衝液、及び必要に応じて(d)溶離用緩衝液を含む。

【００２４】即ち、本発明の手段の組み合わせは例えば
次の4成分、即ち成分1：(イソ）チオシアン酸グアニジニウム緩衝溶液、成分2：シリカ粒子の懸濁液、成分3：洗浄用緩衝液、及び（場合によって）成分4：溶離用緩衝液から構成され得る。

【００２５】必要に応じて成分1及び2を一緒にしてもよ
いが、その場合、貯蔵寿命が制限される。

【００２６】本発明のNA単離方法で使用することが好ま
しい他の反応剤、例えばエタノール及びアセトンは標準
実験技術に属する。

【００２７】

【実施例】以下、多数の実施例により本発明を説明す
る。先ず、使用される材料と方法について説明する。

【００２８】材料及び方法Ａ）シリカ粗材(SC)の懸濁液粒径分布0.5〜10μｍで且つその80％が1〜5μｍの、Sig
ma製の二酸化ケイ素(SiO_２)を使用した。

【００２９】シリカ60ｇを直径5cmのシリンダーに入れ
た２回蒸留水（最高500ml）中に懸濁させると、水柱の
高さは27.5cmとなった。室温で25時間1×ｇ沈降させた
後に、70mlを残して上澄みを吸引して除去した。２回蒸
留水を500mlになるまで加え、シリンダーを振盪するこ
とにより粒子を再度懸濁させた。５時間1×ｇ沈降させ
た後、60mlを残して上澄みを吸引して除去した。32％(w
/v)HCl600μlを加えた後、渦形成することにより再度懸
濁させた。この懸濁液を6ml容器に入れて4mlアリコート
をつくり、密封し、オートクレーブ内で121℃で20分間
加熱した。この沈降プロトコルによって、粒径１μｍ以
上のより大きなシリカ粒子を豊富に得ることができた。
これは電子顕微鏡検査によって立証された。更に、酸性
（pH約2）のシリカをオートクレーブ処理すると、任意
に存在する核酸が完全に分解される結果となる。このよ
うに得られたシリカ粗材の懸濁液を以下SCと表記する。

【００３０】シリカ誘導体の懸濁液 2〜18個の炭素原子の長さのアルキル末端を有するメチ
ルアクリルアミド二酸化ケイ素を用いてシリカを誘導体
化した。誘導体化したシリカの粒径は63〜200μＭであ
った。使用した粒子の孔径は500オングストロームであ
った。上記シリカ誘導体(12MAAMC_２-C１８）はDiosynt
h,Ossから供給された。NA単離のために（実施例H1）、
誘導体化したシリカ粒子0.5ｇを２回蒸留水1ml中に懸濁
させた。このシリカ懸濁液を、32％(w/v)HCl120μlを用
いて90℃で30分間予備処理した。

【００３１】ポリスチレンラテックス粒子の懸濁液２種類のポリスチレンラテックス粒子を使用した。ポリ
スチレンラテックスVQ69レッドはナトリウム−ドデシル
スクシネートスルフェート基を吸収させてあり、粒径は
424nmを有した。ポリスチレンラテックスVQ58Bはより小
さい粒径(328nm)を有し、外側にスルフェート基を吸収
していなかった。３種の親水性のグリシジルメタクリレ
ートポリスチレンラテックス粒子を使用した。AGF27G、
ACN3レッド及びAGY1515の粒径はそれぞれ933nm、206nm
及び846nmであった。上記全てのポリスチレン粒子はARL
A-Arnhemより供給のものであった。

【００３２】市販フィルター以下のものを使用した。

【００３３】1.PVDFMillipore提供のImmobilonTransfer
Membrane（疎水性）、 2.SchleicherandSchuell提供のNitro-cellulose（0.2μ
M参照番号401.396）、 3.Hybond-NAmersham提供のNylonHybiridi-zation膜（0.
45ミクロン、ロット:16872）。

【００３４】Ｂ）L2緩衝液 TRIS(Boehringer)12.1ｇを２回蒸留水800ml中に溶解
し、37％(w/v)HCl8.1mlを加え、さらに容積１リットル
になるまで２回蒸留水を加えることにより、L2緩衝液
(0.1MTris.Cl、pH6.4)を調製した。

【００３５】Ｃ）洗浄液L2 GuSCN（Fluka製のチオシアン酸グアニジン）120ｇをL2
緩衝液100ml中に溶解することにより、洗浄液L2を調製
した。

【００３６】洗浄液L2* KI（Merck製のヨウ化カリウム）12.45ｇをL2緩衝液25ml
中に溶解することにより洗浄液L2*を調製した。

【００３７】NaIベースのカオトロピック物質を調製す
るために、NaI（Merck製のヨウ化ナトリウム）11.25ｇ
をL2緩衝液25ml中に溶解した。チオシアン酸ナトリウム
ベースのカオトロピック物質を調製するために、NaSCN
(Baker)6.1gをL2緩衝液25ml中に溶解した。

【００３８】KI及び尿素(8M)を含有するカオトロピック
物質を調製するために、KI12.45ｇ及び尿素12.0ｇをL2
緩衝液（25ml）中に溶解した。同様に、尿素及びNaIを
併有するカオトロピック物質と、尿素及びNaSCNを併有
するカオトロピック物質とを調製した。

【００３９】Ｄ）溶解用緩衝液L5 GuSCN120ｇをL2緩衝液100ml中に（約60℃の温水浴中で
静かに振盪させて）溶解し、次いで40％(w/v)デキスト
ランスルフェート(PharmaciaLKB)溶液26.0ｇ、0.2MEDTA
pH822ml及びTritonX-100(Packard)2.6ｇを加え、次に溶
液を均質化することにより、溶解用緩衝液L5を調製し
た。0.2MEDTApH8溶液は、EDTA37.2ｇ（Merck製のTitrip
lex）37.2ｇ及びNaOH(Merck)4.4ｇを水500ml中に溶解す
ることにより調製した。

【００４０】Ｅ）溶解用緩衝液L6 GuSCN120ｇをL2緩衝液100ml中に（60℃の水浴中で静か
に振盪させて）溶解し、次いで0.2MEDTApH822ml及びTri
tonX-100(Packard)2.6ｇを加え、次に溶液を均質化する
ことにより、溶解用緩衝液L6を調製した。

【００４１】溶解用緩衝液L6* KI（ヨウ化カリウム、Merck）12.45ｇをL2緩衝液25ml中
に（40℃の水浴中で静かに振盪させて）溶解し、次いで
0.2MEDTA(pH8.0)5.5ml及びTritonX-100(Boehringer7897
04)0.65ｇを加え、最後にこの溶液を均質化することに
より、溶解用緩衝液L6*を調製した。同じ方法を適用し
てNaI（ヨウ化ナトリウム、Merck）を含む溶解用緩衝液
L6*、及びNaSCN（チオシアン酸ナトリウム、Baker）を
含む溶解用緩衝液L6*を調製した。

【００４２】KI及び尿素を併有する溶解用緩衝液L6*
を、KI（ヨウ化カリウム、Merck）12.45ｇ及び尿素（Gi
bcoBRL）12.0ｇをL2緩衝液25ml中に溶解することにより
調製した。次いで、0.2MEDTA(pH8.0)5.5ml及びTritonX-
100(Boehringer)0.65ｇを加え、この混合物を均質化し
た。同じ方法を使用してNaI/尿素及びNaSCN/尿素を調製
した。

【００４３】Ｆ）溶解用緩衝液GEDTA GEDTAとは、GuSCN120ｇを0.2MEDTApH8100ml中に溶解し
た溶液を意味する。

【００４４】Ｇ）TE緩衝液溶出(elution)に適した緩衝液は、所望であればRNAsin
(Promega)0.5U/μlを含有する、pH7.5の10mMTris.Cl、1
mMEDTA溶液（TE緩衝液）である。

【００４５】Ｈ）試験管溶解用緩衝液900μl及びNAキャリヤ（ラテックスビーズ
もしくはSCのごときシリカ、または珪藻土）40μlをEpp
endorff遠心分離管（タイプ3810、1.5ml）に加えること
により、抽出過程と同じ日に試験管を準備した。

【００４６】Ｉ）洗浄方法洗浄液1mlを加え、次いでペレットが再度懸濁するまで
渦形成し、12000×ｇで15秒間遠心分離し、更に吸引に
よって上澄みを廃棄することにより、ペレットを洗浄し
た。

【００４７】Ｊ）溶出方法溶出は、少なくとも25μl、好ましくは少なくとも40μl
の溶出用緩衝液を加え、短時間（２秒間）渦形成し、56
℃で10分間インキュベートすることにより実施した。

【００４８】Ｋ）プロトコルＢこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料からdsDNAを単離するのに適してお
り、GEDTA900μl及びSC40μlを含むEppendorff試験管を
使用した。

【００４９】1．ペレットが再度懸濁するまで試験管に
渦形成し、 2．出発材料（例えば血清、全血、便または尿）50μlを
加え、直ぐに渦形成して（5〜10秒間）均質化し、 3．室温に10分間放置し、5秒間渦形成し、 4．12000×ｇで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄み
を廃棄し、 5．ペレットをGEDTAで１回洗浄し、 6．ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7．ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8．ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9．RNAsinを含まないTE緩衝液50μlを用いてNAを溶出
し、 10．12000×ｇで2分間遠心分離すると、上澄みはNAを含
有した。

【００５０】Ｌ）プロトコルＹこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料からNAを単離する（同時にdsDNA、s
sDNA、dsRNA及びssRNAを精製する）のに適しており、L6
900μl及びSC40μlを含むEppendorff試験管を使用し
た。

【００５１】1．ペレットが再度懸濁するまで試験管に
渦形成し、 2．出発材料（血清、全血、便または尿）50μlを加え、
直ぐに渦形成（約5秒間）して均質化し、 3．室温に10分間放置し、5秒間渦形成し、 4．12000×ｇで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄み
を廃棄し、 5．ペレットをL2で２回洗浄し、 6．ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7．ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8．ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9．必要によってはRNAsinの存在下に、TE緩衝液50μlを
用いてNAを溶出し、 10．12000×ｇで2分間遠心分離すると、上澄みはNAを含
有した。

【００５２】プロトコルY* このプロトコルは、ヒト血清、尿またはバクテリア培養
液といった複合出発材料からNAを単離するのに適してい
る。

【００５３】方法: L6*900μl及びSC40μlを含むEppendorff試験管を使用し
た。

【００５４】1．ペレットが再度懸濁するまで試験管に
渦形成し、 2．出発材料（血清−プラスミド、尿−プラスミド混合
物または一晩培養したバクテリア培養液）50μlを加
え、直ぐに渦形成（5秒間）して均質化し、 3．混合しながら室温に10分間放置し、 4．14,000ｇで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄み
を廃棄し、 5．ペレットをL2*洗浄液で２回洗浄し、 6．ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7．ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8．ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9．必要によってはRNAsinの存在下に、TE緩衝液(10mMTr
is−1mMEDTApH8.0)50μlを用いてNAを溶出し、 10．14,000ｇで2分間遠心分離すると、上澄みはNAを含
有した。

【００５５】プロトコルY** このプロトコルは、カオトロピック物質としてのGuSC
N、及びNAを結合できるフィルター（材料及び方法の項
参照）の存在下に、NAを単離するのに適している。NA検
出は、このフィルターをポリメラーゼ連鎖反応混合物に
直接適用することによる、ポリメラーゼ連鎖反応によっ
て実施し、従ってフィルターからNAを予め溶出しない。

【００５６】方法:L6溶解用緩衝液900μl及びフィルタ
ー（寸法1cm/1cm）を含むEppendorff試験管を使用し
た。

【００５７】1．核酸含有溶液50μlを加え、試験管を短
時間渦形成し、 2．混合しながら室温に10分間放置し、 3．上澄みを廃棄し、 4．フィルターをL2洗浄液で２回洗浄し、 5．フィルターを70％エタノールで２回洗浄し、 6．フィルターを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 7．フィルターの小片をポリメラーゼ連鎖反応溶液に直
接加えた。

【００５８】Ｍ）プロトコルＺこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料からNAを単離するのに適しており、
L5900μl及びSC40μlを含むEppendorff試験管を使用し
た。単離したNAはハイブリッド形成反応に使用すること
ができるが、制限酵素に対する基質としてはやや適当で
ない。しかしながらT4DNAリガーゼは活性である。プロ
トコルＹと比較してプロトコルＺではNAの収率が高くな
る。

【００５９】1．ペレットが再度懸濁するまで試験管に
渦形成し、 2．出発材料（血清、全血、便または尿）50μlを加え、
直ぐに渦形成（約5秒間）して均質化し、 3．室温に10分間放置し、5秒間渦形成し、 4．12000×ｇで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄み
を廃棄し、 5．ペレットをL2で２回洗浄し、 6．ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7．ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8．ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9．必要によってはRNAsinの存在下で、TE緩衝液50μlを
用いてNAを溶出し、 10．12000×ｇで2分間遠心分離すると、上澄みはNAを含
有した。

【００６０】Ｎ）出発材料実施例は、出発材料の性質に応じて（特にセクションＡ
〜Ｄ）、以下のようなセクションに分割した。

【００６１】セクションＡ:ヒト血清セクションＢ:ヒト全血セクションＣ:ヒト尿上記セクションＡ、Ｂ及びＣは特に、dsDNA及びssRNAの
両方を純粋形態で単離できることを示す意味がある。

【００６２】セクションＤ:ヒト便このセクションＤは、特にdsRNAも単離できることを示
す。

【００６３】セクションＥ:一重鎖DNA このセクションＥは、本発明が、ssDNAを単離するため
に使用できることを示す実験からなる。．セクションＦ:珪藻土このセクションＦは、珪藻土の骨格が本発明に使用する
シリカ粒子として非常に有効であることを示す。更に、
本発明が、種々のグラム陰性菌からNAを単離するために
使用できることも示す。

【００６４】セクションＧは、種々のカオトロピック物
質を使用し、細菌細胞からNAを精製できることを示す。

【００６５】セクションＨ及びＩは、別の固相を使用す
るDNAの単離を示す。

【００６６】常に50μlの量で使用した。セクションＢ
及びＦに使用した血液は常に、凝固を防止するためにED
TAの存在下に採取した鮮血とした（TerumoN.V.,Louvai
n,ベルギーのVenoject装置、タイプVT-574TKZの採取管
を使用）。他のセクションに使用した出発材料（血清、
尿及び便）は冷凍物であった。実施例A1、A2、A3、B1、
B2、B5、B7及びF1において、血清または血液は同じ被検
体由来であった。

【００６７】Ｏ）他の方法ゲル電気泳動調査に対して、溶出した量のNAの一部を、
Aaij及びBorstが記載した（Biochim.Biophys.Acta269,1
972,192）緩衝液系に臭化エチジウム1μg/mlを含有する
中性アガロースゲル上にロードした。ゲルにUV照射して
写真撮影した。

【００６８】いくつかの実験において、既知量の精製DN
A（インプットDNA）を臨床試料に加えた。これらのケー
スにおいて、抽出効率100％に対応する量のインプットD
NAを同じゲルにロードした。

【００６９】Ish-Horowicz及びBurkeが記載したように
（NucleicAcidsRes.9,1981,2989）、EscherichiaColiHB
101から細菌プラスミドDNAを精製し、SepharoseCL2B(Ph
armacia,Inc.)を用いたカラムクロマトグラフィーにか
け、エタノールで沈澱させた。Birnboim及びDolyが記載
したように（Maniatis,T.ら，MolecularCloning,CSH,ニ
ューヨーク）、EscherichiaColiJM101(J.Messing,Rec.D
NATechn.Bull.2:43-48(1979))から細菌プラスミドDNAを
精製した。pCMV-Eは、2kbベクターpHC624（Borosingene
30,1984,257）においてクローニングされた0.4kbヒトサ
イトメガロウイルスDNA断片を含み、pEBV-10は、同じベ
クターにおいてクローニングされた0.9kbEpsteinBarrウ
イルスDNA断片を含む。緩和環状(CII)分子(relaxedcirc
ularmolecules)を豊富に含むプラスミド調製物を得るた
めに、pEBV-10DNA(2.9kb)をDNAseＩで処理した。成分II
分子は、3.2kb緩和環状DNA分子としてビリオン中に存在
するＢ型肝炎ウイルスDNAの精製のためのモデルの役目
をする。

【００７０】pGem3p24は1.45kbHIV配列を含むが、pGem3
p24の構成は以下に記述する。HIVHxB2DNAの配列は数人
が記述している（J.Virol,61,633-637(1987);Nature32
6,711-713(1987);AidsRes.Hum.Retrovirus3,41-55(198
7);AidsRes.Hum.Retrovirus3,33-39(1987)及びSience23
7,888-893(1987)）。

【００７１】HIVHxB2DNAの一部をFokＩで、もとのHIVHx
B2配列の1189及び2613部位で切断した。ヌクレオチド番
号は遺伝子バンク指定を参照されたい。

【００７２】このフラグメントのFokＩ部位を、クレノ
ウ（Klenow）DNAポリメラーゼ（Maniatias，上記参照）
を使用して充填し、プラスミドpUC-19のポリリンカーSm
aＩ部位においてクローニングした（Maniatias，前記参
照）。HIVHxB2DNAフラグメントを担う得られたプラスミ
ドをpUC19-p24と称した。

【００７３】プラスミドpGem3p24を得るために、pUC19-
p24の1450bpEcoRI-BamHIフラグメントをEcoRI-BamHI消
化ベクターpGem3においてクローニングした(2867bp;Pro
megaCorporation,MadisonUSA)。

【００７４】PCR法に使用したプライマーをオリゴシン
セサイザー(oligo-synthesizer)装置（AppliedBiosyste
m製）において合成した。プライマーES47（25mer）及び
ES75（47mer）のヌクレオチド配列を以下に示す。 ES47 10 20 ACAGGAGCAG ATGATACAGT ATTAG ES75 10 20 30 40 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGCCTGG CTTTAATTTT ACTGGTA ほとんどのRNA単離実験において（実施例A3、B5、B6、B
7、C2、D1、E1、F1及びF2）、精製過程の間のRNAの分解
を回避するために溶出用緩衝液中にRNAsinを任意的に使
用する以外には、予防策を講じなかった。臨床試料を試
験管に付加する際にのみ手袋をはめ、試薬の調製に対し
てはRNAse阻害剤を使用せず、オートクレーブ処理しな
いEppendorff容器及びピペットチップを使用した。特に
実施例F1及びF2は、溶出の際のRNAsinの存在は厳密には
必要でないことを示した。

【００７５】使用した酵素は市場入手可能であり、製造
業者が推奨するままに使用した。RNAseA同様に全ての制
限酵素T4リガーゼ及びAMV逆転写酵素はBoehringer(Mann
heim)製であった。Tag-DNAポリメラーゼはCetusInc製と
した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR）はPerkinElmerCetus
DNA-熱循環器を用いて実施した。

【００７６】種々の用途に対しては、本発明の方法に使
用する試薬、特にNAキャリヤー（例えばシリカ粒子）及
びカオトロピック物質を含む溶解用及び洗浄用緩衝液
は、核酸（例えばNA含有の細菌またはウイルス）によっ
て汚染されるべきではないことは基本的に重要である。
これは、NAキャリヤーに対しては、これをオートクレー
ブ内で121℃で20分間加熱することにより保証され得
る。しかしながら、この方法はGuSCN含有の溶解用及び
洗浄用緩衝液（GEDTA、L5、L6及びL2）においては、活
性が失われる可能性があること、及び環境に対する付随
的な危険性があることから有効ではない。上記試薬を
（出来る限り）核酸を含有しないようにするために、か
かる試薬を本発明のシリカ粒子のカラムに通すことがで
きる。GuSCN含有緩衝液の溶解(lysing)特性、及びカオ
トロピック物質GuSCNの存在下にNAを結合するシリカの
特性に起因し、かかる方法でNA非含有の緩衝液が得られ
る。カラム自体は、例えば500℃またはそれ以上で1時間
以上加熱することにより、核酸非含有にすることができ
る。

【００７７】Ｐ）DNAタイプ CI：共有結合閉環状DNA(プラスミド）、 CII：緩和（ニック）環状DNA(プラスミド）、 CIII：線状DNA(線状化プラスミド）、 LMW：低分子量DNA(＜0.5kb);pHC624のHpaII消化、471b
p、404bp、242bp（2フラグメント）、190bp、147bp、11
0bp、67bpのフラグメント及び数個のより小さい不定長
のフラグメント、 MMW：中分子量DNA(0.5〜29kb);ファージλDNAのHindIII
消化、23kb、9.4kb、6.7kb、4.4kb、2.3kb、2.0kb及び
0.56kbのフラグメント、 HMW：高分子量DNA(＞29kb）、 ssDNA：ファージM13mp9一重鎖DNA(Boehringer)。

【００７８】セクションＡ：ヒトの血清からのDNA/RNA
の精製ヒトの血清には例えばウイルス又は細菌中にNAが存在し
得る。これらの有機体は共に遊離形態で生じ得、更には
免疫複合物中に結合して生じ得る。NAの量は通常非常に
少ないので、アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブ
ロミド／NA複合体の紫外線照射を通じての検出は不可能
である。DNAをヒトの血清から精製できることを示すた
めに、微量の精製DNAを血清に加え、次いでプロトコル
Ｂに基づいてDNAを単離した（実施例A1,A2）。DNA及びR
NAをヒトの血清から同時に精製できることを示すため
に、培養した哺乳動物細胞又は（小さなプラスミドを有
する）細菌を血清に加え、次いでプロトコルＹに基づい
てNAを単離した（実施例A3）。最後に実施例A4は、プロ
トコルＹによりヒトの血清に存在するRNAをHIV（ヒトの
免疫不全ウイルス）から精製でき、またPCR法により検
出できることを示している。実施例A5は、ヒトの血清中
のDNAをプロトコルＹ＊により、核酸結合性固相として
のシリカと共に種々のカオトロピック物質を使用して精
製できることを示している。

【００７９】実施例A1：ヒトの血清からのDNAの精製ヒトの血清(500μl)を既知量の精製DNA[100μlLMW(45μ
g)、20μlMMW(20μg)、40μlCI/II(20μg)]と混合し、1
0個の66μl試料をプロトコルＢに基づき10個のDNA抽出
物用インプット材料(inputmaterial)として使用した。
この実験では試験管中に存在するSC（SilicaCoarseの懸
濁液）の量を2.5〜40μlで変動させた。抽出を二重に実
施し、各試料からの溶離DNAの半分（30μl）を1％アガ
ロースゲルを支持体とする電気泳動にかけた。比較とし
て、インプットDNAの半分の量を同様にコントロールレ
ーン(lanes)の同一ゲル上にロードした。

【００８０】SCの量が10μlを越えると、二重鎖DNA、線
状（23kb〜約60bp）共有結合閉鎖（CI）DNAも緩和環状
(CII)DNAも効率的に単離された。最大MMWフラグメント
（約23kb）の収率はより小さなフラグメントと比較して
比較的低いようである。このことは他の実験から考慮す
ると、分子量の大きいフラグメントのせん断のせいであ
ろう。

【００８１】コントロールレーンはそれぞれ、100％の
抽出効率の場合のLMW,CII/CI及びMMWDNAの量を示してい
る。前述した如く、CIIに富む（DNAseＩで処理した）3k
bプラスミド(pEBV-10)をインプット材料として使用し
た。

【００８２】実施例A2：ヒトの血清から単離したDNAは
制限酵素及びT4DNAリガーゼに対して良好な基質である
こと精製DNA調製物を50μlのヒトの血清試料12個に加えた。
プロトコルＢに基づいてこれら12個の混合物からDNAを
単離した。50μlのTEで溶離を実施した。溶離したDNAの
半分を以下の３種の制限酵素：EcoRI,BamHI,BglII（こ
れらはそれぞれ低塩、中塩及び高塩緩衝液で活性を有す
る）のいずれかで（二重に）処理するか、T4DNAリガー
ゼで処理するか、又は処理しなかった。DNA試料を１％
アガロースゲルを支持体とする電気泳動にかけ、紫外線
照射により可視化した。

【００８３】T4リガーゼ処理（37℃で１時間、30μlの
反応容量中に３単位のT4リガーゼ）の結果は、DNAフラ
グメントの分子量のシフトを示すと共に、ヒトの血清か
ら単離したDNAがエキソヌクレオリティックな(xonucleo
lytic)分解の影響をそれほど受けないことを示してい
る。

【００８４】精製プラスミド（pCMV-E；3.3μg；1.5μ
l）を加えた８個の血清試料の結果はそれぞれ、EcoRI、
BamHI、BglIIダイジェストに対して総ての制限酵素がプ
ラスミドを線状化したことを示している。総ての制限酵
素は９単位の酵素と共に、37℃で１時間30μlの反応容
量中でインキュベートした。

【００８５】実施例A3：ヒトの血清からのDNA及びssRNA
の同時単離ヒトの血清には（例えばウイルス、細菌又は細胞中
に）、エチジウムブロミドで染色したゲルの紫外線照射
によっては検出することのできない非常に少量のRNAし
か存在しないので、外因性RNA源をヒトの血清試料に加
えた。哺乳動物の細胞又は細菌を外因性RNA源として使
用した。プロトコルＹに基づいてNAを試料から単離し、
RNAseA(40ng/μlの溶離用緩衝液）の存在下で又は不在
下で、0.5U／μlのRNAsinを含む50μlのTEで溶離した。
１％アガロースゲルを支持体とするその後の電気泳動の
結果は、RNA及びDNAが検出できることを示している。50
μlの血清試料に対して加えた哺乳動物の細胞は5×10^５
ラット10B細胞(Boom等、J.Gen.Virol.69,1988,1179）で
あり、50μlの血清に対して加えた細菌はプラスミドpCM
V-Eを含むE.coli細胞株HB101の100μl一晩培養物の細胞
ペレットであった。

【００８６】実施例A4：ヒトの血清から単離したヒトの
免疫不全ウイルスRNAの検出用ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルＹに基づいて各々が50μlのヒトの血清試料
２個（患者Ｆ，Ｈ）からNA（75μl）を単離した。患者
Ｆの血清は（Abbott研究所のHIVP24抗原固相免疫検定法
に基づく）多量(2700pg/ml)のHIV抗原P24を含んでいた
が、（Abbott研究所のHIV抗体ELISAに基づく)HIV抗体に
対しては陰性であった。患者Ｈの血清は両方の試験で陰
性であった。

【００８７】単離したNAの一部（43μl）を37℃で90分R
NAseを含まないDNAse(Boehringer;1UDNAse/μl)で処理
した。エタノールでの沈澱及び68℃で15分間の熱不活化
の後に、RNAを15μlのTE緩衝液に懸濁した。このRNA調
製物の一部5μlを、HIV特異的プライマーの存在下にお
いて、0.4U／μlのAMV逆転写酵素（42℃で30分；反応容
量20μl）で処理するか又は処理しなかった。次いで、d
NTPsを含む80μlの1.25×濃縮PCR緩衝液を加えて、反応
容量を100μlにした。1UのTaq-DNAポリメラーゼを加え
て、増幅を開始した（１サイクルは95℃で１分間、55℃
で１分間、72℃で２分間からなる）。20、25、30、35サ
イクルで反応混合物から10μlのアリコートを採取し
て、２％アガロースゲルに適用した。逆転写酵素で処理
した患者ＦのRNAについては既に25サイクル後に予期さ
れる330bpHIVアンプリマー(amplimer)フラグメントが確
認され、HIVRNAが患者の血清に存在することを示唆して
いた。

【００８８】実施例A5：数種のカオトロピック物質を用
いるDNA精製 50μlのヒトの血清試料10個を、CI及びCII形態（方法の
項参照）からなるそれぞれが10μgの精製pGem3p24DNAと
混合した。これら10個のプラスミド／血清混合物を、プ
ロトコルＹ＊に基づいて抽出用インプット材料として使
用した。使用したカオトロピック物質の濃度については
表A5.1を参照のこと。

【００８９】抽出後に、各試料から溶離したDNAの25％
を0.8％アガロースゲル上で分析した。プラスミドDNA回
収の定量化を可能とするために、インプットDNAを同様
に同一ゲル上に直接ロードした。

【００９０】電気泳動後にゲルを紫外線照射下で撮影
し、DNA回収効率をプラスミド帯強度（表A5.1の表の説
明を参照）を基に視覚的に評価した。

【００９１】カオトロピック物質としてNaI及びNaSCNを
使用して、同様に実験を実施した（下記の試料の説明を
参照）。

【００９２】

【表１】表の説明：表に記載のカオトロピック物質を使用して、
前述したように10個の検出可能試料を製造した。 −：回収されない。 ±：ほとんど回収されない。＋：目に見えるほど回収される。＋＋：定量的に回収される。

【００９３】表A5.1での結果は、8M尿素を組み合わせた
3MKI、3MNaI又は3MNaSCNをカオトロピック物質として使
用すると、共有結合閉鎖(CI)及び緩和環状(CII)pGem3p2
4DNAが効率的に単離されることを示している。CIIの収
率はCIと比較して比較的高いようである。

【００９４】セクションＢ：ヒトの全血からのDNA/RNA
の精製１mlのヒトの血液は、核生成せず従って血液のNA量に寄
与しない約5×10９の赤血球を含んでいる。血液のNA量
は主に白血球細胞（約4^−１０×10^６/mｌ）により決定
される。多量のタンパク質（血液中、約70mg／ml）を含
む水性媒体（血漿）にこれらの細胞が埋め込まれてい
る。従って、全血はNA精製にとって極めて不純な源であ
る。セクションＢの実施例は、にもかかわらずNAをプロ
トコルＢ及びＹにより全血から単離することができるこ
とを示している。

【００９５】実施例B1：ヒトの全血からのDNAの単離ヒトの血液(500μl)を、既知量の精製DNA[100μlのLMW
(45μg)、80μlのCI/II(40μg)]と混合し、68μlの試料
10個をプロトコルＢにおける10個のDNA抽出用インプッ
ト材料として使用した。この実験では、試験管に存在す
るSC（シリカ粗材の懸濁液）の量を2.5〜40μlの間で変
動させた。抽出を二重に行い、各試料からの溶離DNAの
半分（30μl）を、１％アガロースゲルを支持体とする
電気泳動にかけた。比較のために、インプットDNAの半
分の量を同様に同一ゲル上にロードした。

【００９６】10μlを越えるSCを使用すると、二重鎖DN
A、線状共有結合閉鎖(CI)DNAも緩和環状(CII)DNAもヒト
の全血から効率的に単離された。全血から回収されるDN
Aの量は、約10μlまではSCの量に比例していた。量が多
くなると飽和するようである。

【００９７】実施例B2：ヒトの全血から単離したDNAは
制限酵素及びT4DNAリガーゼに対して良好な基質である
こと精製DNA調製物を、50μlのヒトの血液試料12個に加え
た。プロトコルＢに従ってこれら12個の混合物からDNA
を単離した。50μlのTEで溶離が生じた。溶離したDNAの
半分を以下の３種の制限酵素：EcoRI,BamHI,BglII（こ
れらはそれぞれ低塩、中塩及び高塩緩衝液で活性を有す
る）のいずれか１つで処理するか、T4DNAリガーゼで処
理するか、又は処理しなかった。DNA試料を１％アガロ
ースゲルを支持体とする電気泳動にかけ、紫外線照射に
より可視化した。

【００９８】T4リガーゼ処理（37℃で１時間、30μlの
反応容量中に３単位のT4リガーゼ）の結果は、DNAフラ
グメントの分子量の増加を示すと共に、ヒトの血液から
単離したDNAがエキソヌクレオリティックな分解の影響
をそれほど受けないことを示している。

【００９９】精製プラスミド（pCMV-E；3.3μg；1.5μ
l）を加えた８個の血液試料の結果はそれぞれ、EcoRI、
BamHI、BglIIダイジェストに対して、総ての制限酵素が
プラスミドを線状化したことを示している。総ての制限
酵素は９単位の酵素と共に、37℃で１時間30μlの反応
容量中でインキュベートした。

【０１００】実施例B3：10個の異なる血液試料からのDN
Aの単離この実施例では、血液バンクから無作為に選択したヒト
の血液の異なる10個の試料を出発材料として使用した。
各試料において白血球細胞(WBC)の数は知られていた。
プロトコルＢに従って50μlの試料からDNAを精製し、75
μlのTEで溶離が生じた。単離したDNAの三分の一を１％
アガロースゲルに直接適用し、残余部分(2μl)をPCR用
に使用した。

【０１０１】3μlのLMW-DNA(6μg)を50μlの各試料に加
えた後に、同一の試料で同一の単離作業を実施した。こ
の場合も25μlの溶出液(eluate)(75μl)をゲルに直接適
用した。25μlの溶出液の他の部分を最初にT4DNAリガー
ゼで処理し（37℃で１時間、30μlの反応容量中に2
U）、次いで同一ゲルに適用した。

【０１０２】血液試料1〜10の白血球細胞(WBC）の含量
は以下の通りであった。

【０１０３】

【表２】

【０１０４】実施例B4：ヒトの白血球細胞中のヒトのβ
-グロビン遺伝子検出用ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルＢに基づいてヒトの全血から単離したDNAがT
aq-DNAポリメラーゼに対して良好な基質であることを示
すために、実施例B3に従って10個の異なる血液試料から
単離した2μlのDNAを、β-グロビン特異的プライマーを
含むPCRで処理した。PCRは32サイクルからなり、各サイ
クルは94℃で１分間、次いで65℃で３分間であった。ア
ンプリマーの一部（50％）を２％アガロースゲルを支持
体とする電気泳動にかけた。120bpのアンプリマー及び
プライマー帯を検出することができた。

【０１０５】実施例B5：ヒトの血液からのDNA及びssRNA
の同時精製（再現性） DNA及びRNAを再現し得る形でヒトの血液から精製できる
ことを示すために、一人のヒトから得た各々が50μlの
６個の血液試料をプロトコルＹに基づいて処理し、RNAs
in(0.5U/μl)を含む75μlのTEでNAを溶離した。溶出液
の一部25μlを中性１％アガロースゲルに適用して、電
気泳動にかけた。結果は、DNA及びRNAが検出できること
を示している。

【０１０６】実施例B6：ヒトの血液（10個の異なる試
料）からのDNA及びssRNAの同時精製 10人の異なるヒトから得た50μlの血液試料（実施例B3
参照）をプロトコルＹに基づいて処理し、0.5U／μlのR
NAsinを含む40μlのTEでNAを溶離した。溶出液の一部30
μlを中性１％アガロースゲルを支持体とする電気泳動
にかけた。結果は、DNA及びRNAが検出できることを示し
ている。

【０１０７】実施例B7：ヒトの血液からのDNA及びssRNA
の同時精製外因性RNA源をヒトの血液試料に加えた。哺乳動物の細
胞又は細菌を外因性RNA源として使用した。プロトコル
Ｙに基づいて試料からNAを単離し、RNAseA(40ng/μlの
溶離用緩衝液）の不存在下又は存在下において、50μlT
E＋0.5U/μlRNAsinで溶離した。50μlの血液試料に対し
て5×10５ラット10B細胞（Boom等、J.Gen.Virol.69,198
8,1179）を哺乳動物細胞として加え、50μlの血液に対
してプラスミドpCMV-Eを含むE.coli細胞株HB101の100μ
l一晩培養物の細胞ペレットを細菌として加えた。

【０１０８】結果は、哺乳動物のssRNA(18S及び28Sリボ
ソームRNA)も細菌性ssRNA（16S及び23SリボソームRNA）
もヒトの全血から精製され得ることを示している。更に
は、ゲノムDNA及びプラスミド（形態Ｉ）DNAが効率的に
回収される。

【０１０９】セクションＣ：ヒト尿からのDNA/RNA精製ヒトの尿ではNAは、例えばウイルスまたは細菌中や尿路
由来の細胞中に存在し得る。量は普通、エチジウムブロ
ミド／NA複合体のアガロースゲル電気泳動及びUV照射に
よる検出が不可能なほど少ない。ヒト尿からDNAを精製
し得ることを示すために、マイクログラム量の精製DNA
を尿に添加し、続いてプロトコルBに従ってDNAを単離し
た（実施例C1）。ヒト尿からDNAとRNAとを同時に精製し
得ることを示すために、培養した細菌（小プラスミド保
有）を尿に添加し、続いてNAをプロトコルYに従って単
離した（実施例C2）。

【０１１０】実施例C3は、プロトコルY*により核酸結合
性固相としてシリカと共に、GuSCNに替えてKI、NaI及び
NaSCNのような別のカオトロピック物質を用いてもヒト
尿からDNAを精製し得ることを示す。

【０１１１】実施例C1:ヒト尿からのDNA精製 3μlのLMWDNA(6μg)を、任意に選択した10の、様々な混
濁度の50μlヒト尿試料に添加した（試料第4号、第5
号、第6号及び第7号は澄明であり、試料第1号、第2号、
第3号及び第8号は僅かに混濁し、試料第9号及び第10号
は非常に混濁していた）。DNAをプロトコルBに従って単
離し、75μlのTE緩衝液で溶離した。各溶出物の1/3を1
％アガロースゲルに適用した。別の部分25μlを1.8UのT
4DNAリガーゼで（反応量30μlにおいて37℃で1時間）処
理し、やはり上記ゲルに適用した。マーカーレーンはLM
WDNA及びMMWDNAをそれぞれ含有する。マーカーレーン中
のLMWDNAの量(2μg)は、抽出効率100％で観察されるべ
き量を表す。

【０１１２】実験結果は、プロトコルBでヒト尿からDNA
を有効に精製し得、得られるDNAはT4DNAリガーゼのため
の優れた基質であることを示す。

【０１１３】尿試料第10号から単離したLMWDNAは明らか
に分解されていた。しかし、（この実験で用いたよう
な）裸のDNAは尿試料中にヌクレアーゼが豊富であれば
分解されるだろうと予想できた。従って、分解は精製時
にではなく、それ以前の尿／DNA混合物調製時に起こっ
たと考えられる。次の実施例(C2)は、（裸の場合に反し
て）細胞中に存在するDNAは、特にssRNAまでもが尿試料
第10号から有効に回収できることを示す。

【０１１４】実施例C2:ヒト尿からのDNAとssRNAとの同
時精製この実験では、実施例C1で用いたのと同じ10の尿試料
を、2.4kbのプラスミド(pCMV-E)を保有する細菌と混合
した。混合物からNAをプロトコルYに従って単離し、か
つ75μlのTE緩衝液中に0.5U／μlRNAsinを用いて溶離し
た。溶出物の1/3を1％アガロースゲルでの電気泳動に掛
けた。溶出物の別の部分25μlを10Uの、pCMV-Eを直鎖化
する制限酵素EcoRIで処理した（反応量30μlにおいて37
℃で1時間）。この処理は40ng／μlRNAseAの存在下に行
なった。電気泳動の結果は、23S及び16SリボソームRN
A、並びに共有結合で閉じた形態(CI)及び直鎖形態(CII
I)のプラスミドDNAを示す。

【０１１５】実施例C3:他のカオトロピック物質を用い
るDNA精製ヒト尿(50μl)を、400μlのカオトロピック物質、溶菌
(lysis)緩衝液L6*及び1μgのpGem3p24DNAと混合した。
得られた懸濁液を全部、プロトコルY*によりDNAを精製
するべく500μlのカオトロピック物質（表C3.1参照）及
び40μlのSiO２に混合添加した。尿から単離したDNAの
量を、アガロースゲル電気泳動を用いて解析した。DNA
回収効率を実施例A5に述べたようにして判定した結果を
表C3.1にまとめる。

【０１１６】

【表３】表C3.1は、CＩ型及びCII型プラスミドDNAのDNAバンドの
収率が同じであったことを示す。

【０１１７】実施例D1:ヒト糞便からのロタウイルスdsR
NA精製レオウイルス(Reovirdae)科のウイルスは、二重鎖RNAか
ら成るゲノムを有する。この科に属する重要な病原体
は、重症の下痢を惹起し得、従って糞便試料中に大量に
存在するロタウイルスである。ロタウイルスのゲノムは
11個のdsRNAセグメントから成り（HishinoinJ.Clin.Mic
robiol.21,1985,425参照）、これらのdsRNAセグメント
はプロトコルBによって糞便上清から単離可能である。
下痢試料を12000×gで2分間遠心分離して得た上清100μ
lを用いて単離を行なった。

【０１１８】ロタウイルスに感染したことが（Wellcome
ロタウイルスラテックス試験及びKallestadPath-finder
ロタウイルス直接抗原検出系によって）確認された6人
の異なる患者から採取した試料を用いた結果、dsRNAを
抽出できることが判明した。

【０１１９】最初の遠心分離ステップを省略し、糞便試
料を直接プロトコルBまたはYのためのインプット物質と
して直接用いても同様の結果（普通、ロタウイルスdsRN
A収率はより高い）が得られた。

【０１２０】実施例E1:ヒト血液、血清及び尿からのssD
NA精製臨床試料から一重鎖DNAも単離できることを示すため
に、1μg(4μl)の精製ファージM13DNA（Boehringer社の
M13mp9DNA）を50μlのヒト血清、ヒト血液またはヒト尿
に添加し、プロトコルBまたはプロトコルYによって精製
した。いずれの抽出作業も4回ずつ行なった。DNAを50μ
lのTE緩衝液中に溶離し、25μlを1％アガロースゲルで
の電気泳動に掛けた。マーカーレーンは500ngのM13ssDN
Aを含有する。

【０１２１】この実験の結果から、一重鎖DNAをヒト血
液、血清または尿からプロトコルYによって、また程度
はより低いがプロトコルBによっても単離できることが
判明した。

【０１２２】セクションＦ：NAのケイ藻土への結合ケイ藻土の組織はほぼ完全にSiO_２から成るので、ケイ
藻土が使用シリカとして有用であるかどうか調べた。5
種の異なる市販ケイ藻製品［JanssenBiochimica,Louvai
n,BelgiumのCelatomFW14、CelatomFW50、CelatomFW60、
Celite(AK)及びCelite521］各10gを50mlの2回蒸留水及
び500μlの37％HClと混合し、得られた懸濁液をオート
クレーブで20分間121℃に加熱した。実施例F1及びF2に
おいて、上記のように生成した懸濁液をプロトコルYに
よるNA抽出に用いた。

【０１２３】実施例F1:ヒト血液からのNA単離ヒト血液を、プラスミドpCMV-Eを保有するE.coliHB101
細菌と混合し、一晩経過した培養物100μlの細菌ペレッ
トを50μlの血液に添加した。50μl試料を、プロトコル
YによるNA抽出のためのインプット物質として用いた。4
0μlのSCに替えて、40μlの上記ケイ藻土懸濁液を用い
た。NAを75μlのTE緩衝液中に、RNAse阻害物質を用いず
に溶離し、20μlの溶出物を直接ゲルに付与した。別の2
0μlの溶出物を、9UのBamHIを伴ったRNAseA(40ng／μl)
で反応量25μlにおいて37℃で1時間処理してからゲルに
付与した。

【０１２４】マーカーレーンは1μgのMMWDNAを含有す
る。

【０１２５】得られた結果から、ケイ藻土懸濁液がSCに
類似のNA結合特性を有することが判明した。dsDNA(成分
Ｉ分子）とssRNA(23S及び16SrRNA)との両方が結合し
た。プラスミドDNAは、BamHIによって完全に直鎖化され
る（成分III）ほど十分に純粋であった。

【０１２６】実施例F2:グラム陰性菌からのNA精製ヒトにおいて疾病を惹起することが知られている9種類
の異なるグラム陰性菌種を固形寒天プレート上で培養し
た。上記各細菌種を5〜10μlずつプレートから掻き取っ
て、プロトコルYによるNA抽出のためのインプット物質
として用い、また40μlのSCかまたは40μlのCelite521
懸濁液をNAキャリヤーとして用いた。SCを用いた抽出は
最初の洗浄の間に停止しなければならなかったが、これ
は、たとえ（3分を越える）長時間渦形成を行なったと
してももはやNAシリカ複合体を均質化し得なくなったか
らである。他方、Celite521を用いた抽出は問題無く続
行することができたが、これはおそらくケイ藻土の粒径
がSC粒子の粒径より大きかったためであろう。NAを70μ
lのTE緩衝液で、RNAsinを用いずに溶離し、溶出物の一
部（20μl）を1％アガロースゲルでの電気泳動に掛け
た。

【０１２７】マーカーレーンは1μgのMMWDNAを含有す
る。

【０１２８】次のような細菌に関する結果を得た。

【０１２９】1:Campylobacterpylori 2:Yersiniaenterolyticatype3 3:Neisseriameningitidis 4:Neisseriagonorrhoeae 5:Haemophilusinfluenzaetypeb 6:Kelbsiellapneumoniae 7:Salmonellatyphimurium 8:Pseudomonasaeruginosa 9:EscherichiacoliK1-083 この方法で、HMW細菌DNA及びrRNAを検出することができ
た。

【０１３０】セクションＧ：EscherichiacoliJM101のDN
A/RNA精製グラム陰性菌からのNAの単離が、本発明により可能であ
る。細菌細胞中には、高レベルの高分子量DNA(HMWDNA)
及びリボソームRNAが存在する。実施例G1は、細菌細胞
からNAを、NA結合性固相としてシリカと共に様々なカオ
トロピック物質を用いて精製できることを示す。

【０１３１】実施例G1:NA結合性固相として様々なカオ
トロピック物質及びシリカを用いて行なう細菌細胞から
のNA単離／精製（内在）一晩経過した細菌培養物JM10150μlからNAを、900μlの
カオトロピック物質及び40μlのSiO_２の存在下に単離し
た。高レベルのHMWDNA及び内在リボソームRNA（16S及び
23S）が、エチジウムブロミドで染色したゲルのUV照射
によって単離NAを検出することを可能にする。単離はプ
ロトコルY*に従って行ない、溶出NAの25％（40μl部
分）をアガロースゲル上で解析した。

【０１３２】

【表４】凡例：アガロースゲル解析の結果を表G1にまとめる。HM
WDNA及びrRNA回収の定量を、シリカと共に用いるカオト
ロピック物質がGuSCNであった場合と比較した。表G1中
の“1”は、DNAまたはRNA回収の効率が同等であること
を表す。表G1中の“＞1”は回収効率がより高いことを
表す。

【０１３３】細菌細胞からの内在RNA単離のための基準
として、E.colirRNAマーカー(Boehringer)を用いた。

【０１３４】セクションＨ：カオトロピック物質としてグアニジニウムチオシアネー
トと、NAを結合させ得る別の固相とを用いるDNA精製 GuSCN及び幾つかのシリカ誘導体またはラテックス粒子
（“材料及び方法”参照）を用いてNA単離／精製を行な
い得ることを示すために、純粋なプラスミドを低塩緩衝
液(Tris10mM−EDTA1mM,pH8.0)に添加し、その後プロト
コルYに従って単離したが、その際ステップ7及び9は省
略した（TEでの溶離を行なわなかった）。結合したNAを
伴ったシリカ／ラテックス粒子をPCR反応混合物中に導
入した。単離したDNAはPCR法によって検出し得る。実施
例H1は、カオトロピック物質としてのGuSCNと共に別の
固相を用い、かつPCR法で検出を行なうことによってNA
を精製し得ることを示す。

【０１３５】実施例H1:GuSCN及び別の固相を用いるDNA
精製 50μlのTris10mM/EDTA1mM(pH8.0)中に存在する0.5μgの
pGem3p24を、80μlのシリカ懸濁液または80μlのラテッ
クス懸濁液（“材料及び方法”参照）及び900μlの溶菌
緩衝液L6と混合した。

【０１３６】プロトコルYにより洗浄し、かつ56℃で乾
燥した後（溶離ステップ省略）、ペレットを50μlの水
に再懸濁した。プラスミド−シリカ懸濁液の20μl部分
を、HIV特異的プライマー（“材料及び方法”参照）の
存在下にPCR混合物中に用い、5μlの10倍濃縮PCR緩衝液
と、1μlの10mMdNTPと、2単位のTaqDNAポリメラーゼ
と、最終量を50μlとする量の水とを添加して増幅反応
を開始させた（95℃で1分、37℃で1分、更に72℃で3分
を1周期とする）。

【０１３７】30周期後、反応混合物から10μlアリコー
トを取り分け、2％アガロースゲル上で解析した。ラテ
ックス粒子でNAを単離した場合、シリカで単離した場合
のようなペレットは得られなかった。

【０１３８】1mlの洗浄液L2を300μlの70％EtOHと混合
したところ、二つの液相間にラテックス含有バンドが見
いだされた。ラテックス粒子はその色によって検出可能
である。単離したラテックス含有画分を70％EtOHで2回
洗浄し、遠心分離すると、該画分はEppendorff管内で小
さいペレットを形成した。

【０１３９】

【表５】凡例：結果を表H1にまとめる。30周期後、予想した290b
pHIVアンプライマーフラグメントを総ての事例で観察し
た。フラグメントのサイズを、やはりゲル上に載置した
マーカーφx174RFDNAHaeIIIdigest(Pharmacia)と比較し
た。＋＋:固相として粗シリカを用いた場合（対照）と同じ
レベルのHIV特異的290bpフラグメントをアガロースゲル
上に検出したことを表す。＋:290bpフラグメントの検出レベルが対照の粗シリカの
場合より低いことを表す。

【０１４０】セクションＩ：NA結合フィルター及びGuSC
Nを用いる精製プロトコルY**による核酸の単離では、SiO_２の替わりに
NA結合フィルター（“材料及び方法”参照）を用い得
る。

【０１４１】低塩緩衝液(Tris10mM−EDTA1mM,pH8.0)中
では通常DNAの放出が起こらないが、場合によって生起
するこの問題点は、DNAを結合させたフィルターからDNA
を溶離する替わりに該フィルターをPCR反応混合物中に
插入することによって排除できる。実施例I1は、NA結合
フィルター及びカオトロピック物質としてのGuSCNを用
い、かつPCR法で解析することによってNAを精製し得る
ことを示す。

【０１４２】実施例I1:DNA結合フィルターを用い、かつ
PCR増幅による検出を行なうDNA単離／精製 Tris10mM/EDTA1mM(pH8.0)50μl中の純粋なpGem3p24DNA
（濃度1μg、0.01μg及び0.005μg)を、寸法1cm×1cmの
3個のDNA結合フィルター及び900μlのGuSCN(溶菌緩衝液
L6)に添加した。

【０１４３】（プロトコルY**による）洗浄（遠心分離
ステップ省略）及び56℃での乾燥の後、DNAを結合させ
たフィルターを直接PCR混合物中に導入した。HIV特異的
プライマーの存在下に、PCRサイクラーで増幅を行なっ
た。

【０１４４】反応混合物は更に、5μlの10倍濃縮PCR緩
衝液と、1μlの10mMdNTPと、2単位のTaqDNAポリメラー
ゼと、最終量を50μlとする量の水とを含有する。続い
て、増幅反応を開始させた。

【０１４５】30周期後、反応混合物から10μlアリコー
トを取り分け（実施例H1参照）、2％アガロースゲル上
で解析した。

【０１４６】

【表６】凡例：結果を表I1にまとめた。予想した290bpHIVアンプ
ライマーフラグメントを観察した。フラグメントを市販
φxHaeIIと比較した。＋＋:アガロースゲル上で、エチジウムブロミドで強度
に染色された290bpフラグメントを検出＋:290bpフラグメントを検出 0:290bpフラグメント検出せず比較として:PCR増幅混合物に添加した7ngの精製pGem3p2
4DNAは、“＋＋”として定量される290bpフラグメント
をもたらす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (72)発明者ヘンリエツテ・マリア・アレイダ・アドリアーンセオランダ国、6828・ベー・エヌ・アーネム、イル・イエー・ペー・フアン・マイルウエイクストラート・87 (72)発明者テイム・キエフイツオランダ国、2593・ヘー・エー・デン・ハーグ、スタイフエサントストラート・183 (72)発明者ペテル・フランクリン・レンスオランダ国、1015・ヘー・カー・アムステルダム、ブラウエルスフラフト・823

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を含有する出発材料から核酸を単離
するための方法であって、出発材料、カオトロピック物
質及び核酸結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を
液体から分離し、その後、こうして得られた固相−核酸
複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離
することからなり、ただし該出発材料が核酸含有複合生
物出発材料である場合には該核酸結合性固相がシリカ又
はその誘導体を含む核酸結合性固相ではないことを特徴
とする方法。
【請求項２】使用される出発材料が全血、血清、バフ
ィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織及
び細胞培養物のような、核酸を含有する生物材料である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】使用されるカオトロピック物質がグアニ
ジニウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イ
ソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み
合わせから構成される群から選択されることを特徴とす
る請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】グアニジニウム塩が（イソ）チオシアン
酸グアニジニウムであることを特徴とする請求項３に記
載の方法。
【請求項５】使用される核酸結合性固相がシリカ粒
子、ポリマー材料、フィルター材料、ポリスチレンビー
ズ又はニトロセルロース紙から構成される群から選択さ
れることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】 DNA及び／又はRNAを単離することを特徴
とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】実質的に0.05〜500μmの範囲の粒径を有
するシリカ粒子を使用することを特徴とする請求項１か
ら６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】実質的に0.1〜 200μmの範囲の粒径を有
するシリカ粒子を使用することを特徴とする請求項１か
ら６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】実質的に１〜200μmの範囲の粒径を有す
るシリカ粒子を使用することを特徴とする請求項１から
８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】得られた固相−核酸複合体を沈澱さ
せ、かつ上清を廃棄することにより液体から分離し、そ
の後、カオトロピック物質を含有する洗浄用緩衝液で複
合体を洗浄することを特徴とする請求項１から９のいず
れか一項に記載の方法。
【請求項１１】洗浄用緩衝液で洗った固相−核酸複合
体を更に１種以上の有機溶剤で洗浄し、その後、乾燥す
ることを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１２】洗浄及び乾燥した固相−核酸複合体中
に存在する核酸を溶離用緩衝液により溶離することを特
徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項１３】こうして得られた該固相−核酸複合体
を増幅用の複数の成分の混合物と接触させ、該固相に結
合しているか又は該固相から溶離した核酸を増幅するこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】出発材料、カオトロピック物質及び核
酸結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を液体から
分離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を
洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離すること
からなる核酸を含有する出発材料から核酸を単離する方
法を実施するための手段の組み合わせ。
【請求項１５】出発材料、カオトロピック物質及び核
酸結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を液体から
分離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を
洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離し、こう
して得られた該固相−核酸複合体を増幅用の複数の成分
の混合物と接触させ、該固相に結合しているか又は該固
相から溶離した核酸を増幅することからなる核酸を含有
する出発材料から核酸を単離する方法を実施するための
テストキット。
【請求項１６】請求項１に記載の方法で使用するのに
適したカオトロピック物質。