CN114350654A - 一种rna提取试剂盒及rna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于血液RNA提取的裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法。利用该裂解结合液直接对血样样本中的RNA进行提取，无需裂解离心分离红细胞，获得的RNA质量较高，满足各种实验需要，可直接用于RT‑qPCR等实验或保存于‑70℃。

Description

一种RNA提取试剂盒及RNA提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA提取试剂盒及RNA提取方法。

背景技术

随着分子生物学技术的发展，以RNA为靶标进行的组织及细胞的分子生物学研究更为广泛，其中分离出纯度高且完整的RNA是进行基因表达分析及RNA结构功能研究的基础。在所有RNA实验中，最关键的步骤是分离得到纯度高且完整的RNA。血液中含有核白细胞，因此从血液中抽提RNA比较方便，但是血液中的红细胞富含核糖核酸酶，所以从血液中分离RNA有其特殊的难度。

常见的RNA提取方法有苯酚法、阴离子去污剂法、热硼酸法或改良热硼酸法、LiCl-尿素法、改良的Gomez法、异硫氰酸胍法、TRIzol试剂快速提取法、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法。

随着生物技术的不断发展，很多生物技术公司着手RNA提取的研究并取得丰硕成果，将科研人员从繁琐的提取、纯化工作中解放出来。目前，RNA提取中常用的试剂盒主要分为3种：TRIzol试剂一步法、TRIzol LS试剂一步法和PAXgene试剂盒法，前两者均使用苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液，而PAXgene法需根据试剂生产商说明书操作。

Trizol法不可避免会使用氯仿，然而氯仿是一种有毒试剂，不利于实验操作人员的身体健康。而其它试剂盒方法中均需要先对红细胞进行裂解，然后离心取沉淀的细胞再进行下一步的提取，这些试剂盒方法操作繁琐耗时较长，不适合大批量提取。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RNA提取试剂盒及RNA提取方法，该方法无需裂解离心分离红细胞，可直接对血样样本中的RNA进行提取，获得RNA满足各种实验需要，可直接用于RT-qPCR等实验或保存于-70℃。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种用于血液RNA提取的裂解结合液，包括DEPC水和如下浓度的组分：

作为优选，所述裂解结合液包括DEPC水和如下浓度的组分：

一些具体实施例中，所述裂解结合液包括DEPC水和如下浓度的组分：

一些具体实施例中，所述裂解结合液包括DEPC水和如下浓度的组分：

本发明还提供了所述的裂解结合液在提取血液RNA中的应用。

本发明还提供一种提取血液RNA的试剂盒，包括本发明所述的裂解结合液，以及清洗液、洗脱液和磁珠。

作为优选，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液。

其中，所述第一清洗液包括以下组分：

0.1-2M盐酸胍；

0.1-2M氯化钠；

1-5vol％Triton X-100；

10-50vol％异丙醇；

第二清洗液为80％乙醇。

作为优选，所述洗脱液为DEPC水。

作为优选，所述磁珠为超顺磁性二氧化硅磁珠。

本发明还提供一种提取血液RNA的方法，利用本发明所述的试剂盒提取血液样本中的RNA。

作为优选，本发明提供的提取血液RNA的方法，包括如下步骤：

1)将磁珠进行羧基改性后悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；

3)在血液样本中加入裂解结合液得到第二混合液；

4)第一混合液与第二混合，得到含有核酸-磁珠的第三混合液；

5)利用磁力吸附第三混合液的中核酸-磁珠，去除上清液；收集磁珠，依次用第一清洗液和第二清洗液洗涤，干燥，DNaseⅠ消化；消化结束后加入第二清洗液洗涤，磁吸去上清液；

7)将洗涤后的磁珠与洗脱液混合，收集洗脱液，获得血液RNA。

作为优选，所述第一混合液中，磁珠的浓度为10-100mg/mL。

本发明中，所述DNaseⅠ购自Omega、诺唯赞、罗氏、生工；优选为DNaseⅠ-Omega。

本发明提供了一种用于血液RNA提取的裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法。利用该裂解结合液直接对血样样本中的RNA进行提取，无需裂解离心分离红细胞，获得的RNA质量较高，满足各种实验需要，可直接用于RT-qPCR等实验或保存于-70℃

附图说明

图1示本发明血液RNA提取的试剂盒的操作流程图；

图2示不同磁珠对提取的RNA的影响；2-a为电泳分析结果，从左到右依次为SC磁珠、PC磁珠和70108磁珠的结果；2-a为Agilent 4150TapeStation检测分析的70108磁珠实验组的RNA电泳图，代表RNA条带的片段分布与完整性；

图3示不同DNaseⅠ对提取的RNA的影响；3-a为电泳分析结果，从左到右依次为DNaseⅠ-Omega、DNaseⅠ-诺唯赞、DNaseⅠ-罗氏和DNaseⅠ-生工的结果；3-b为Agilent4150TapeStation检测分析DNaseⅠ-Omega实验组的RNA电泳图，代表RNA条带的片段分布与完整性；

图4示不同反应温度下的DNaseⅠ消化对RNA提取的影响；4-a为电泳分析结果，从左到右依次为生工DNaseⅠ37℃、生工DNaseⅠRT、诺唯赞DNaseⅠ37℃和诺唯赞DNaseⅠRT的结果；4-b为Agilent 4150TapeStation检测分析诺唯赞DNaseⅠRT实验组的RNA电泳图，代表RNA条带的片段分布与完整性；

图5示不同磁珠加入量对提取的RNA的影响；5-a为电泳分析结果，从左到右依次为SC20210714-0.25mg、SC20210714-0.5mg、SC20210714-1mg、70108-0.25mg、70108-0.5mg和70108-1mg的结果；5-b为Agilent4150TapeStation检测70108-1mg实验组的RNA电泳图，代表RNA条带的片段分布与完整性；

图6示实施例7的裂解液对RNA提取的检测结果；6-a为电泳分析结果，从左到右依次为1#和2#样本检测结果；6-bAgilent 4150TapeStation检测分析新鲜兔血实验组的RNA电泳图，代表RNA条带的片段分布与完整性。

具体实施方式

本发明提供了一种用于血液RNA提取的裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1裂解结合液及试剂盒

试剂盒组成：

第一清洗液(0.1-2M盐酸胍；0.1-2M氯化钠；1-5％Triton X-100；10-50％异丙醇；

第二清洗液为80％乙醇；

洗脱液为DEPC水；

裂解结合液由如下组分组成：

1M硫氰酸胍；

1M盐酸胍；

0.5vol％吐温-20；

1vol％Triton X-100；

0.5M氯化钠；

1wt％聚乙烯醇PEG 2000；

1wt％聚乙烯醇PEG 6000；

40vol％异丙醇；

DEPC水。

RNA提取包括以下步骤，具体步骤参见图1：

1)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过羧基改性；

2)改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液(超顺磁性二氧化硅磁珠的含量为50mg/mL)；

3)在0.2mL血液样本中加入0.4mL裂解结合液得到第二混合液；

4)第一混合液与第二混合得到第三混合液；

5)通过磁力对第三混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤；

6)洗涤后的磁珠进行干燥

7)磁珠干燥后加入DNaseⅠ对DNA进行消化

8)磁珠消化完毕后加入第二清洗液洗涤并磁性吸附去除上清液

9)洗涤后的磁珠进行干燥并与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的血液RNA。

实施例2不同磁珠对RNA提取的影响

采用实施例1的试剂盒和提取方法提取血液样本的RNA。新采购来的血液样本(未冷冻，EDTA抗凝剂)，200μL样本，100μL洗脱。

测试三种磁珠：SC、PC、70108磁珠的效果。实验结果如图2和表1所示：

表1

结果分析：

1.血液样本不是新鲜样本，根据上次使用O品牌试剂盒提取结果也可知样本中RNA已有部分降解。

2使用70108磁珠效果最好，提取的RNA浓度可达Omega品牌提取量的90％左右。

3.SC磁珠与70108磁珠两组安捷伦4150检测的RNA峰形一致，浓度略低。

实施例3不同品牌DNaseⅠ对RNA提取的影响

采用实施例1的试剂盒和提取方法提取血液样本的RNA。新采购来的血液样本(未冷冻，EDTA抗凝剂)，200μL样本，100μL洗脱。

测试四种DNaseⅠ：Omega、诺唯赞、罗氏、生工。

实验结果如图3和表2：

表2

结果分析：

DNaseⅠ-Omega提取获得的RNA浓度和质量明显高于其他三种酶。

实施例4不同反应温度下的DNaseⅠ消化对RNA提取的影响

采用实施例1的试剂盒和提取方法提取血液样本的RNA。新采购的血液样本(未冷冻，EDTA抗凝剂)，200μL样本，50μL洗脱。磁珠为70108磁珠。

测试采用两种DNaseⅠ：生工、诺唯赞。

酶反应体系为：酶加入量10U(1U/μL)，10×Buffer加入量10μL，补水至100μL。

测试温度：室温(RT，约25℃)、37℃。

反应时间：静置10min。

实验结果如图4和表3：

表3

结果显示，在室温和37℃下进行DNaseⅠ消化对RNA的浓度和质量没有明显影响。

实施例5血液RNA提取试剂盒裂解结合液

血液样本(未冷冻，EDTA抗凝剂)，200μL样本，50μL洗脱。

酶反应体系为：诺唯赞DNaseⅠ加入量10U(1U/μL)，10×Buffer加入量10μL，补水至100μL。酶反应温度时间：室温(约24℃)静置15min。

测试磁珠70108、SC20210506磁珠。

裂解液组成：

1M硫氰酸胍；

1M盐酸胍；

0.5％吐温-20；

2％TritonX-100；

0.5M氯化钠；

1％聚乙烯醇PEG 2000；

1％聚乙烯醇PEG 6000；

30％异丙醇；

DEPC水。

试剂盒其他组分与实施例1相同，提取方法同实施例1。

结果显示，洗涤过程不发生团聚现象，磁珠呈分散状态不团聚

实施例6不同磁珠加入量对RNA提取的影响

目的：测试不同的磁珠加入量对血液RNA提取试剂盒的影响，减少磁珠量是否会改善洗涤过程团聚的现象、

采用实施例5的试剂盒和提取方法提取血液样本的RNA。血液样本为新采购的EDTA抗凝血(4℃保存了约2周)，200μL样本，60μL洗脱。

酶反应体系为：诺唯赞DNaseⅠ加入量10U(1U/μL)，10×Buffer加入量10μL，补水至100μL。

酶反应温度时间：室温(约24℃)静置15min。

测试磁珠70108、SC20210714磁珠。

Qubit检测浓度结果见图5和表4。

表4

结果分析：磁珠加入量1mg/样时，RNA的提取效果较优；70108磁珠提取效果较SC磁珠更好。

实施例7裂解结合液及试剂盒的制备

裂解液组成如下，其他试剂盒组分同实施例1：

2M硫氰酸胍；

2M盐酸胍；

1％吐温-20；

1％TritonX-100；

0.5M氯化钠；

1％聚乙烯醇PEG 2000；

1％聚乙烯醇PEG 6000；

50％异丙醇；

DEPC水。

然后进行血液样本的提取：

RNA提取包括以下步骤：

1)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过羧基改性；

2)改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液(每个血液样本加入1mg超顺磁性二氧化硅磁珠)；

3)在0.2mL血液样本中加入0.4mL裂解结合液得到第二混合液；

4)第一混合液与第二混合得到第三混合液；

5)通过磁力对第三混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤；

6)洗涤后的磁珠进行干燥；

7)磁珠干燥后加入DNaseⅠ对DNA进行消化；

8)磁珠消化完毕后加入第二清洗液洗涤并磁性吸附去除上清液；

9)洗涤后的磁珠进行干燥并与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的血液RNA。

取新鲜兔血加入采血管EDTA抗凝剂混匀，然后使用上述试剂盒按照上述方法进行提取，其中，样本加入量为200μL，100μL洗脱液洗脱。

使用不同仪器检测提取的RNA浓度、片段情况。

结果如表5～6和图6所示:

表5

表6

注：1#、2#表示两个平行试验，RIN值表示RNA完整情况，10.0为最好。“/”是因为浓度低于10ng/μL时，仪器检测不输出RIN值。

结果显示，采用该裂解结合液组成的试剂盒提取获得的RNA浓度符合要求，DNA残留未检出，片段大小符合要求，RNA的RIN值为10.0，说明RNA没有降解，RNA完整性符合要求，提取效果理想。

对比例1裂解结合液及试剂盒

裂解结合液组成如下，其他试剂盒组成同实施例1：

5M硫氰酸胍；

0.5M盐酸胍；

2％吐温-20；

5％TritonX-100；

0.5M月桂基酰胺酸钠；

0.5％十二烷基硫酸钠

1％聚乙烯醇PEG 6000；

40％异丙醇；

DEPC水。

然后进行血液样本的提取：

血液样本(未冷冻，EDTA抗凝剂，按照实施例1的方法进行提取，其中；

200μL样本，50μL洗脱。

酶反应体系为：诺唯赞DNaseⅠ加入量10U(1U/μL)，10×Buffer加入量10μL，补水至100μL。酶反应温度时间：室温(约24℃)静置15min。

测试磁珠为70108、SC20210506磁珠。

实验结果见表7：

表7

结果分析：该裂解结合液下，提取的RNA浓度偏低，提取效果不理想。

Claims (10)

1.一种用于血液RNA提取的裂解结合液，包括DEPC水和如下浓度的组分：

2.根据权利要求1所述的裂解结合液，其特征在于，包括DEPC水和如下浓度的组分：

3.根据权利要求1所述的裂解结合液，其特征在于，包括DEPC水和如下浓度的组分：

4.权利要求1～3任一项所述的裂解结合液在提取血液RNA中的应用。

5.一种提取血液RNA的试剂盒，包括权利要求1～3任一项所述的裂解结合液，以及清洗液、洗脱液和磁珠。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；

所述第一清洗液包括以下组分：

0.1-2M盐酸胍；

0.1-2M氯化钠；

1-5vol％TritonX-100；

10-50％vol异丙醇；

第二清洗液为80％乙醇；

所述洗脱液为DEPC水。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠为超顺磁性二氧化硅磁珠。

8.一种提取血液RNA的方法，其特征在于，利用权利要求5～7任一项所述的试剂盒提取血液样本中的RNA。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将磁珠进行羧基改性后悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；

3)在血液样本中加入裂解结合液得到第二混合液；

4)第一混合液与第二混合，得到含有核酸-磁珠的第三混合液；

5)利用磁力吸附第三混合液的中核酸-磁珠，去除上清液；收集磁珠，依次用第一清洗液和第二清洗液洗涤，干燥，DNaseⅠ消化；消化结束后加入第二清洗液洗涤，磁吸去上清液；

7)将洗涤后的磁珠与洗脱液混合，收集洗脱液，获得血液RNA。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一混合液中，磁珠的浓度为10-100mg/mL。

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