CN101389757A - 核酸提取方法及核酸提取装置 - Google Patents

Abstract

一种提取核酸的方法，该方法包括：通过将含核酸的样品溶液与核酸吸附性固体载体接触，从而使核酸被吸附到所述的核酸吸附性固体载体上；在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固体载体上时，通过将洗涤液与所述的核酸吸附性固体载体接触，从而洗涤该核酸吸附性固体载体；通过将回收液与所述的核酸吸附性固体载体接触，从而使所述核酸从所述的核酸吸附性固体载体上解吸附，其中在所述洗涤液的分注及允许停留的时间以及所述回收液的分注及允许停留的时间这二者中，至少有一个时间被控制为预定时间。

Description

核酸提取方法及核酸提取装置

技术领域

本发明涉及这样一种核酸提取方法，该方法使用装配有过滤材料的核酸提取柱来自动地提取样品溶液中的核酸；本发明还涉及核酸提取装置。

背景技术

关于提取核酸的相关方法，存在这样一些方法，其中要施加离心力、使用磁珠、使用过滤器等。例如有这样一种方法：使用固相(例如二氧化硅、二氧化硅聚合物或硅酸镁)来吸附核酸，然后通过随后的操作(例如洗涤和解吸附)来纯化核酸(例如，参见日本专利公报No.07/051,065)。

发明内容

然而，尽管上述提取核酸的相关方法在分离性能方面表现良好，但是，它们在简便性、快速性和自动化适应性方面还存在不足。还存在的其它问题是：难以进行具有相同性能的吸附介质的工业化大规模生产；不便于处理；并且难以模制成各种形状；等等。

本发明是考虑到上述情况而完成的，并且本发明的目的是提供一种核酸提取方法，其中在核酸分离纯化过程中，通过使用核酸吸附性固体载体来吸附含有核酸的样品溶液中的核酸，随后通过洗涤等使核酸解吸附，从而以如下优点来处理含核酸的样品溶液：高效、简便、快速、良好的自动化适应性和良好的重复性；本发明的目的还在于提供核酸提取装置。

通过以下内容可以实现本发明的目的。

(1).一种提取核酸的方法，该方法包括：

通过使含核酸的样品溶液与核酸吸附性固体载体接触，从而将核酸吸附到所述的核酸吸附性固体载体上；

在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固体载体上时，通过使洗涤液与所述的核酸吸附性固体载体接触，从而对所述的核酸吸附性固体载体进行洗涤；以及

通过将回收液与所述的核酸吸附性固体载体接触，从而使所述核酸从所述的核酸吸附性固体载体上解吸附；

其中，在所述洗涤液的分注及允许停留的时间以及所述回收液的分注及允许停留的时间这二者中，至少有一个所述时间被控制为预定时间。

(2).上述(1)中所述的方法，

其中将所述洗涤液的允许停留时间控制为50秒到1,000秒。

(3).上述(1)中所述的方法，

其中将所述洗涤液的允许停留时间控制为100秒到300秒。

(4).上述(1)到(3)中的任意一项所述的方法，

其中将所述回收液的允许停留时间控制为20秒到300秒。

(5).上述(1)到(3)中的任意一项所述的方法，

其中将所述回收液的允许停留时间控制为25秒到60秒。

(6).上述(1)到(5)中的任意一项所述的方法，

其中所述的核酸吸附性固体载体是通过基本不涉及离子键的相互作用来吸附核酸的核酸吸附性固体载体。

(7).(1)到(6)中的任意一项所述的方法，

其中用于制备含核酸的样品溶液的方法包括：

将含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、蛋白酶和核酸稳定剂中的化合物的预处理溶液与试验样品混合，从而得到混合后的溶液；以及

向所述的混合溶液中加入水溶性有机溶剂。

(8).上述(7)中所述的方法，

其中所述的核酸稳定剂为巯基化合物。

(9).上述(7)或(8)中所述的方法，

其中所述的离液盐为胍盐。

(10).上述(7)到(9)中所述的方法，

其中所述的水溶性有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

(11).上述(1)到(10)中的任意一项所述的方法，

其中所述的核酸吸附性固体载体被容纳于核酸提取柱的、具有至少两个开口的容器的内部；以及

其中所述方法包括：

在将所述的含核酸的样品溶液分注到所述的核酸提取柱中之后，通过压力差使所述的样品溶液中的所述核酸吸附到所述的核酸吸附性固体载体上；

在将所述的洗涤液分注到所述的核酸提取柱中之后，通过压力差除去杂质；以及

在将所述的回收液分注到所述的核酸提取柱中之后，通过压力差使吸附到所述的核酸吸附性固体载体上的所述核酸从该核酸吸附性固体载体上分离出来，从而与所述回收液一起回收所述核酸。

(12).一种用于实施上述(11)中的所述方法的核酸提取装置，

其中所述的核酸吸附性固体载体为过滤材料。

(13).上述(12)中所述的核酸提取装置，

其中所述的核酸提取装置通过加压自动地实施提取操作；以及

其中所述的提取操作包括：

在将所述的含核酸的样品溶液分注到核酸提取柱中之后，样品溶液中的核酸被吸附到所述的过滤材料上；

在将洗涤液分注到所述的核酸提取柱中之后，除去杂质；以及

在将回收液分注到所述的核酸提取柱中之后，使吸附到所述的过滤材料上的所述核酸从该过滤材料上分离出来；从而与所述回收液一起回收所述核酸。

(14).上述(12)或(13)中所述的核酸提取装置，该装置包括：

压缩空气供给机构，其通过加压嘴将压缩空气引入到所述的核酸提取柱中；以及

分注机构，该机构包括：第一分注嘴，用于将洗涤液分注到所述的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用于将回收液分注到所述的核酸提取柱中。

(15).上述(12)到(14)中的任意一项所述的核酸提取装置，该装置包括：

保持机构，用于保持多个经排布的核酸提取柱和多个经排布的回收容器，所述回收容器用于接收所述的含核酸的回收液；

压缩空气供给机构，用于将压缩空气由单个加压嘴引入到所述的多个经排布的核酸提取柱中；

分注机构，该机构包括：第一分注嘴，用于将洗涤液分注到所述的多个经排布的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用于将回收液分注到所述的多个经排布的核酸提取柱中；以及

移动装置，用于使所述的压缩空气供给机构的所述的单个加压嘴和所述的保持机构这两者之一相对于另一者进行相对移动。

根据如此构造，就能够通过简单的装置进行核酸提取操作，其中核酸提取柱和接收含核酸的回收液的回收容器分别被排布在多个位置上，并由保持机构保持；压缩空气供给机构的单个加压嘴和分注机构的分注嘴可相对移动，从而将压缩空气引入核酸提取柱中，并且对洗涤液和回收液进行分注；并且，核酸提取柱中的过滤材料所吸附的核酸被分离和回收。

(16).上述(12)到(15)中的任意一项所述的核酸提取装置，

其中，所述的多个经排布的核酸提取柱被支承在固定侧；以及

其中，所述的压缩空气供给机构的所述的单个加压嘴以在所述的多个经排布的核酸提取柱的排布方向上可移动的方式受到支承。

根据如此构造，当加压嘴沿核酸提取柱的排布方向进行移动时，就可以依次向多个核酸提取柱中供入气体。

(17).上述(12)到(16)中的任意一项所述的核酸提取装置，

其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴中的至少一者与所述的单个加压嘴被设置成一体化的可移动件。

根据如此构造，当加压嘴与分注嘴被设置成一体化的可移动件时，可以简单地设置压缩空气供给机构和分注机构。

(18).上述(12)到(17)中的任意一项所述的核酸提取装置，

其中，所述的压缩空气供给机构的所述的单个加压嘴被支承在固定侧；以及

其中，所述的多个经排布的核酸提取柱以在该多个经排布的核酸提取柱的排布方向上可移动的方式受到支承。

根据如此构造，当固定分注嘴而移动核酸提取柱时，大量核酸提取柱都能够依次受到加压、分注、洗涤、分注和回收这些处理中的每一步处理，并且当已处理的核酸提取柱和回收容器接着换成未处理的核酸提取柱和回收容器时，就可以以连续的方式进行大量处理。

(19).上述(12)到(18)中的任意一项所述的核酸提取装置，

其中，以相同的排布间距来设置所述的多个核酸提取柱；以及

其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴分别与所述的单个加压嘴的排布距离均为所述的多个核酸提取柱的所述的相同的排布间距的整数倍。

根据如此构造，以相同的排布间距来设置核酸提取柱，并且分注嘴与加压嘴之间的排布距离是核酸提取柱的排布间距的整数倍，因此，在这种情况下，就可以同时对多个不同的核酸提取柱进行分注处理和加压处理，从而使处理时间缩短。

附图说明

图1示出核酸提取装置的一个实施方案，并且是示出移去盖子后的状态的斜视图。

图2是核酸提取装置的移动头的结构轮廓图。

图3是核酸提取装置的结构轮廓框图。

图4A是提取柱的斜视图，而图4B是沿该提取柱的IVB-IVB截取的剖面图。

图5A到5G是提取操作的步骤图。

图6A到6C是示出由移动头向提取柱供入压缩空气的方式的示意图。

图7A到7B是示出从移动头向提取柱分注洗涤液的方式的示意图。

图8A到8B是示出从移动头向提取柱分注回收液的方式的示意图。

图9是示出核酸提取装置的另一个实施方案的结构轮廓图。

图10是示出本发明的核酸提取步骤的工艺流程图。

图11是示出核酸收率与洗涤液注入后的允许停留时间之间的关系的图。

图12是示出核酸收率与回收液注入后的允许停留时间之间的关系的图。

2表示装置主体，3表示保持机构，4表示压缩空气供给机构，5表示分注机构，6表示台架，7表示移动装置，11表示提取柱(核酸提取柱)，11b表示核酸吸附性多孔膜，12表示废液容器，13表示回收容器，21表示柱支架，22表示容器保持立架，40表示移动头(可移动件)，41表示加压嘴，43表示气泵，45表示开关阀，46表示压力传感器，51w和51r分别表示分注嘴，52w和52r分别表示供给泵，56w和56r分别表示瓶子，70表示控制部分，72表示存储部分，100表示核酸提取装置，S表示样品溶液，W表示洗涤液，R表示回收液。

本发明的最佳实施方案

下文中，将给出本发明的核酸提取装置的实施方式的详细描述，该提取装置适用于实施本发明的核酸提取方法。

图1示出核酸提取装置的一个实施方案，并且是示出移去盖子后的状态的斜视图；图2是核酸提取装置的移动头的结构轮廓图；图3是核酸提取装置的结构轮廓框图。

通过设置以下部分而构成本发明的核酸提取装置100，所述部分为：保持机构3，其中，多个核酸提取柱(下文简称为“提取柱”)以及回收容器13分别被保持并排布在容纳部件中，所述的提取柱中装有过滤材料，所述的回收容器用于接收含核酸的回收液；压缩空气供给机构4，其中压缩空气由单个加压嘴41引入提取柱11中；分注机构5，其具有将洗涤液和回收液分别注入到提取柱11中的分注嘴51；移动装置7，其可以使保持机构3和压缩空气供给机构4的加压嘴41相对移动。关于过滤材料，可以使用核酸吸附性固体载体，例如核酸吸附性多孔物质(本文中为核酸吸附性多孔膜)。

在其中实施本发明的核酸提取方法的核酸提取装置100中，相继实施以下步骤：步骤(1)，使含核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，从而用所述的多孔膜吸附核酸；步骤(2)，在核酸被吸附的状态下来洗涤所述的核酸吸附性多孔膜；以及步骤(3)，使回收液通过所述的核酸吸附性多孔膜，从而使核酸从所述的多孔膜上分离。

在说明本实施方案的核酸提取装置100的机构组成之前，先说明使用这种核酸提取装置来提取核酸的步骤。

图4A是提取柱的斜视图，图4B是沿该提取柱的IVB-IVB截取的剖面图；而图5A到5G包括了示出提取操作的各个步骤的图。

核酸提取装置100使用图4A所示的提取柱11来提取样品溶液中的核酸。提取柱11的构成方式为：使得核酸吸附性多孔膜11b被保持在圆柱形主体11a(其顶端是开放的)的底部，圆柱形主体11a在核酸吸附性多孔膜11b以下的部分被成形为漏斗状的形状，细管口形状的出口11c以预定的长度从底端的中心突出来，并且在圆柱形主体11a的两侧形成纵向突出体11d。在从提取柱11的顶端开口11e分注样品溶液之后、分注洗涤液之后以及分注回收液之后(这些溶液将在下文中提到)，均从顶端开口11e引入压缩空气，而各种溶液则通过核酸吸附性多孔膜11b，向下流动，并由开口11c排放到废液容器12或回收容器13(各种容器将在下文中提到)中。顺便提及，在图中所示的情况下，圆柱形主体11a具有这样的结构：圆柱形主体11a被分为上部和下部，并通过将上部和下部接合而使之连接在一起。如图4B所示的沿IVB-IVB截取的剖面图，顶端开口11e具有斜面11f，其中内表面被切削成锥形，并且斜面11f的形成方式为：使得其与加压嘴41(将在下文提到)的前端的倾斜的外表面基本吻合。

基本上来说，核酸提取装置100通过图5A到5G所示的提取步骤来进行核酸的提取。首先，在图5A步骤中，将含核酸(经溶解处理)的样品溶液S倒入位于废液容器12之上的提取柱11中。然后，在图5B所示的步骤中，压缩空气被引入提取柱11中，以施加压力并通过核酸吸附性多孔膜11b，从而使得样品溶液S通过核酸吸附性多孔膜11b，而核酸被吸附在该多孔膜上，通过多孔膜的液体成分则被排放到废液容器12中。

接着，在图5C所示的步骤中，洗涤液W被自动地分注到提取柱11中，在图5D所示的步骤中，压缩空气被引入到提取柱11中，在核酸仍保留在核酸吸附性多孔膜11b上时，进行洗涤和除去其它杂质的操作，而通过多孔膜的洗涤液W则被排放到废液容器12中。图5C所示的步骤和图5D所示的步骤可以重复几次。

接着，在图5E所示的步骤中，将提取柱11下部的废液容器12换为回收容器13，之后，在图5F所示的步骤中，将回收液R自动地分注到提取柱11中，在图5G所示的步骤中，压缩空气被引入到提取柱11中以便进行加压，从而使得核酸吸附性多孔膜11b与核酸之间的结合力变弱，以释放被吸附的核酸，而含核酸的回收液R则被排放到回收容器13中以实现回收。

基本上来说，位于上述提取柱11中的核酸吸附性多孔膜11b是多孔物质，液体能够通过其中，并且该多孔物质的表面具有通过化学键作用力的方式来吸附样品溶液中的核酸的性质。所述的核酸吸附性多孔膜被构造成这样的方式：在使用洗涤液进行洗涤时，核酸保持吸附，而在使用回收液进行回收时，核酸的吸附力变弱从而使其被释放。详细情况将在下文中提到。

如图1到图3所示，在核酸吸附性装置100的主体2中，该装置设置有以下部分：柱支架21，用于保持多个提取柱11；容器保持立架22，用于保持废液容器12和回收容器13；压缩空气供给机构4，通过该机构将压缩空气引入提取柱11中；分注机构5，通过该机构将洗涤液W和回收液R分注提取柱11中；等等。柱支架21和容器保持立架22构成了保持机构3。以下，将详细说明机构3到机构5中的各个机构。

保持机构

保持机构3包括柱支架21和容器保持立架22。容器保持立架22中具有位于装置主体2的前侧下部的台架6，用于保持废液容器12和回收容器13。随着容器交换用电动机32(直流电动机)的驱动，运作部件31(参见图3)发生移动，由此来进行台架6中的容器的交换移动(向前移动和向后移动)操作，所述运作部件31设置于容器保持立架22的底部。这种向前和向后移动的结果是：将回收容器13定位于柱支架21的下方或将废液容器12定位于柱支架21的下方。根据定位传感器33a和33b的检测结果，来控制上述容器交换用电动机32的运转。

柱支架21是通过将前、后板件粘合而构成的分体式(twodivided)结构，所以柱支架21设有在横向方向上延伸的保持件21a和21b。在保持件21a和21b上形成了多个保持孔21c，提取柱11从上方插入，而在圆柱形主体11a的两侧形成的突出体11d(参见图4A和4B)的下端与柱支架21中的连接件(图中未示出)连接，并由该连接件保持。该连接件能够被移动，并且在移动时，其与所述突出体11d的连接被解除，使所有的提取柱11同时下落并被扔掉。

在台架6位于图1所示的下降的位置时，提取柱11(由柱支架21所保持)的出口11c的底端定位于台架6中所设置的废液容器12和回收容器13的上方。当随着诸如脉冲电动机之类的升降用电动机47(参见图3)的驱动而使容器保持立架22升起和下降、同时通过光传感器48a到48c的检测结果来控制台架6升起和下降的时候，在台架6升起时，提取柱11的出口11c就会以预定的量插入废液容器12或回收容器13中。

台架6的上表面上设有废液容器保持孔和回收容器保持孔，这两种保持孔在横向方向上延伸为平行的两列，并且多个废液容器12中的每一个废液容器和多个回收容器13中的每一个回收容器分别被位于后侧的废液容器保持孔和位于前侧的回收容器保持孔保持成列。将废液容器保持孔和回收容器保持孔排布成与柱支架21的保持孔21c的位置相同并且间距(距离)相同的方式，并且进行这样的设定，使得废液容器12和回收容器13分别位于相应的被保持的提取柱11的下方。关于废液容器12和回收容器13，优选使用具有不同尺寸和形状等的容器，以免混淆。

压缩空气供给机构

如图1到3所示，压缩空气供给机构4设有以下部分：作为可移动件的移动头40，其与上述保持机构3中的台架6相反地升起和下降；单个加压嘴41，被固定在移动头40上；气泵43，可产生压缩空气；安全阀44，该阀用于打开和关闭设定在加压嘴41这一侧的气体供应通路；压力传感器46，被设定在加压嘴41这一侧；以及加压嘴升降装置，其可以使加压嘴41升起和下降。关于加压嘴升降装置，通过加压嘴升/降用电动机81(例如脉冲电动机)和与之相连的螺柱-螺母式(bold-nut)机构来完成升起和下降的操作。如此构造的结果是：压缩空气被依次供入到提取柱11中。气泵43、安全阀44和加压嘴41各自的操作都是根据控制部分70的控制命令来实施的。

上述移动头40设有以下部分：移动头移动用电动机26(参见图3)(例如脉冲电动机)，其作为移动装置被定位于装置主体2的中间框架23与上框架24之间；位于驱动侧的皮带轮27，是由移动头移动用电动机26驱动而旋转的；位于空转侧的皮带轮28，其自由旋转并进行张力调节；以及同步皮带29，其悬挂在驱动侧的皮带轮27和空转侧的皮带轮28之间。顺便提及，移动头移动用电动机26是根据光传感器25a到25c的检测结果来控制而被驱动的，并且移动头移动用电动机26沿提取柱11的排布方向来移动移动头40。

以可上、下移动的方式将加压嘴41安装在移动头40中，并使其可以更多地向下移动，此外，位于加压嘴41的下部前端的外边缘被制成圆锥形。如此构造的结果是：当加压嘴41向下移动、并使加压嘴41的前端与提取柱11(设置在柱支架21中)的顶端开口接触时，提取柱的被切削成锥形的斜面11f紧紧地贴附在加压嘴41的前端的圆锥形表面上，因此提取柱11的内部被紧紧地密封。在这种紧密密封的状态下，就可以将压缩空气供入提取柱11中，而不会泄露。

当要排放位于气泵43和开关阀45之间的通路中的空气时，将安全阀44打开通向大气，并进行排放。空气环路这样构建：使得开关阀45选择性地开启，并使压缩空气从气泵43通过加压嘴41而引入到提取柱11中。如此构造的结果是：形成了从气泵43到提取柱11的气流供应通路。

分注机构

分注机构5设有以下部分：洗涤液分注嘴51w和回收液分注嘴51r，并且分注嘴51w和分注嘴51r一起被设置于上述的可移动的移动头40中，所述移动头40能够在柱支架21上沿横向方向移动；洗涤液供给泵52w(参见图3)，其中洗涤液瓶56w所容纳的洗涤液W被提供并输送到洗涤液分注嘴51w中；回收液供给泵52r(参见图3)，其中回收液瓶56r所容纳的回收液R被提供并输送到回收液分注嘴51r中；废液器皿57，被安装在中间框架23上；等等。

通过移动头移动用电动机26(参见图3)的驱动，使移动头40在各个提取柱11处停下，而在复位状态下，使移动头40停在废液器皿57上；以这样的方式对驱动加以控制，以便使每个提取柱上方的空间不受遮拦。当每个提取柱上方的空间不受遮拦时，工作性能会大大提高。

洗涤液分注嘴51w和回收液分注嘴51r的前端向下弯曲，洗涤液分注嘴51w通过阀55w与洗涤液供给泵52w连接，洗涤液供给泵52w与洗涤液瓶56w连接，回收液分注嘴51r通过阀55r与回收液供给泵52r连接，回收液供给泵52r与回收液瓶56r连接。洗涤液瓶56w和回收液瓶56r分别被设置在装置主体2的前面，由此使操作性能提高。洗涤液供给泵52w和回收液供给泵52r都由管式泵构成，并且它们各自的驱动都是受控的，从而可以由泵用电动机53w和53r(脉冲电动机)根据传感器54w和54r的位置检测结果而分别注入预定量的洗涤液W和回收液R。这些泵用电动机53w、53r和阀55w、55r都是根据控制部分70的指令来工作的。

当要分注洗涤液W或回收液R时，开启阀55w或55r，并开动泵用电动机53w或53r，使得洗涤液供给泵52w的转动部件或回收液供给泵52r的转动部件转动并工作。如此构造的结果是：通过洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r吸入洗涤液W或回收液R，并经过阀55w或55r从洗涤液分注嘴51w或回收液分注嘴51r排出洗涤液W和回收液R。在进行这种排放操作时，将洗涤液分注嘴51w或回收液分注嘴51r移动到提取柱11的上方。结果，将预定量的洗涤液W或回收液R分注到提取柱11中。

洗涤液瓶56w和回收液瓶56r各自具有容器主体56wb或56rb以及盖56wu或56ru；盖56wu和56ru中分别设有细管状的吸管58w和58r，所述吸管58w和58r的下端开口分别接近容器瓶主体56wb和56rb的底部，从而随着洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r的操作，分别抽吸洗涤液W或回收液R。

上述机构3到5分别是由其各自连接的控制部分70根据控制板(图中未示出)的输入操作来控制的，该控制板设置于装置主体2的上部。换言之，驱动和控制是根据存储部分72(与控制部分70连接)中预先存储的程序来实施的。

以下将详细说明使用上述核酸提取装置100进行的提取操作。首先，将提取柱11设置在位于保持机构3的台架6中的柱支架21中，将废液容器12和回收容器13分别设置在台架6中，并将台架6安装在装置主体2的容器保持立架22中，由此做好准备。然后，使用移液管等将经过溶解处理的样品溶液S依次注入到每一个提取柱11中。在注入样品溶液S的时候，将移动头40放置于废液器皿57的正上方，从而使提取柱上方的空间不受遮拦。顺便提及，还可以在把提取柱11设置到尚未安装到核酸提取装置100上的台架6中之前或之后，将样品溶液S预先注入到提取柱11中。

然后，通过对操作控制板进行操作使该装置工作，其中，如图6A所示，移动头40被转移到提取柱11正上方的位置。将加压嘴41放置在该图左端的提取柱C1(示作实例)的正上方，并通过开动压缩空气供给机构4的加压嘴升/降用电动机81，使移动头40的加压嘴41向下移动(图6B)。结果，加压嘴41的前端外表面紧紧地贴附在提取柱11的斜面11f上。同时，升降用电动机47驱动容器保持立架22向上移动，使提取柱11的底端出口11c以预定的量插入到废液容器12中，从而防止了排出的溶液因滴溅等泄露到外部而造成的污染。

然后，进行压缩空气的供入操作。控制部分70发出指令，结果，在开关阀45处于关闭状态时驱动气泵43，再将开关阀45打开。压缩空气立即从气泵43经加压嘴41以预定的量供入到第一提取柱11(C1)中。

然后，在关闭开关阀45后，通过加压嘴升/降用电动机81使加压嘴41升起，再开动移动头移动用电动机26，使移动头40移动与柱11的排布间距相等的距离。而后，将预定量的压缩空气以相同的方式供入到相邻的第二提取柱11(C2)(图6C)中。

在施加压力使样品溶液S通过核酸吸附性多孔膜11b后，样品溶液S中的核酸被吸附和保留在多孔膜11b上，同时，其它液体成分由底部的出口11c排放到废液容器12中。当所有的样品溶液S都通过核酸吸附性多孔膜11b之后，压力降低到液体排放结束时的压力以下，因此通过压力传感器46来检测提取柱11已完成提取。所述步骤重复进行的次数为提取柱11的个数。

接着进行洗涤处理。在上述的压缩空气供入操作之后，将移动头40升起，并返回到第一提取柱(C1)的上方。然后将移动头40的洗涤液分注嘴51w停在第一提取柱(C1)的上方，并注入预定量的洗涤液W，再将移动头40移动到下一个提取柱(C2)的上方，并相继注入洗涤液W。当将洗涤液W分注到所有的提取柱11中的操作已完成后，将移动头40返回到第一提取柱(C1)的上方。

然后，如图6A到6C所示，使移动头40的加压嘴41下降，并且，在将加压嘴41的底端部分压附于提取柱11的顶端开口上以将其封闭之后，按照上述相同的方式打开开关阀45，使压缩空气供入到提取柱11中。受压力作用的洗涤液W进行洗涤，并在通过核酸吸附性多孔膜11b的同时除去除核酸以外的杂质；洗涤液W由底端开口11c排放到废液容器12中。当所有提取柱11中的所有洗涤液W都已通过核酸吸附性多孔膜11b而排出时，将移动头40返回到起始位置。顺便提及，当洗涤处理被重复进行两次或多次时，上述操作均被重复。

接着进行回收处理。首先，在洗涤处理之后，在移动头40进行上述的返回操作的同时，通过升降用电动机47使台架6下降，从而使提取柱11底端的出口11c与废液容器12分离，在此之后，通过容器交换用电动机32的驱动使得保持机构3的运作部件31移动，从而使台架向后移动。由此，通过把回收容器13定位于提取柱11之下，而使容器发生交换。

在此之后，使用升降用电动机47将台架6升高，并保持使提取柱11的底端插入到回收容器13中的状态。然后，如图8A所示，移动移动头40，由此使回收液分注嘴51r停在第一提取柱(C1)的上方，以便注入预定量的回收液R，随后将移动头40移动到下一个提取柱(C2)，并相继进行回收液R的注入操作(图8B)。当将回收液R分注到所有的提取柱11中的操作已完成后，按照上述相同的方式将压缩空气供入每一个提取柱11中，如图6A到6C所示。

在按照上述相同的方式供入压缩空气后，在压力的作用下，回收液R通过核酸吸附性多孔膜11b、释放出被多孔膜吸附的核酸，然后核酸与回收液R一起由底端出口11c排放到回收容器13中。在所有提取柱11中的所有回收液R都被排放到回收容器13中之后，将移动头40移动到废液器皿57正上方的最初的空位处，至此完成一系列操作。

开动升降用电动机47，使完成了提取操作的台架6下降，将提取柱11和废液容器12各自从柱支架21和台架6中取出并扔掉，而从台架6中取出回收容器13，如果需要可将其盖上并进行随后的核酸分析处理。

在本实施方案中，示出了这样的结构，其中多个提取柱11被支承在固定侧，而压缩空气供给机构4的加压嘴41则以可沿提取柱11的排布方向自由移动的方式受到支承。然而，本发明并不限于这一种实施方案，如图9的核酸提取装置的结构轮廓中所示的结构也是合乎需要的，其中压缩空气供给机构4的加压嘴41被支承在固定侧，而多个提取柱11、废液容器12和回收容器13分别以可沿各自的排布方向自由移动的方式受到支承。根据图9所示的结构，可以按这样一种方式连续地进行大量核酸的处理，所述方式为：将各提取柱11、废液容器12和回收容器13连续提供给固定加压嘴41、洗涤液分注嘴51w和回收液分注嘴51r，并且回收完成核酸提取操作后得到的物质。

由气泵43供给提取柱11的空气可以是任何其它气体，只要它不会影响样品溶液、洗涤液和回收液的性质等即可。

与其中多个提取柱11被一起抽吸的结构相比而言，核酸提取装置100可以控制气体的供入时间和气体的供入量等，使这些条件针对每个提取柱11都达到最佳。此外，即使在样品溶液的液体量和粘度等不均衡时，也很难受其影响，并且本发明的装置可以加快核酸提取处理的节奏，核酸的目标提取物可更为广泛，并且装置的适用性可以得到增强。例如，在向多个提取柱同时供入气体的结构中，即使向其中部分提取柱供入压缩空气的操作已经完成，在向其它提取柱供入压缩空气的操作没有完成的情况下，也不可以结束压缩空气的供入。因此，只有在多个提取柱11都结束同一操作后，才可以进入下一步操作。然而，在根据本实施方案的核酸提取装置100中，各个提取柱相继受到处理，因此不会受其它提取柱的任何影响，从而可以在最短的时间内进行最佳的处理。

此外，因为仅向一个提取柱11供入气体，所以与向多个提取柱11同时供入气体的情况相比，前者就可以降低气泵43的供给量。因此，甚至可以使用小尺寸的气泵43，其安装所需的空间小，并且可实现紧凑的结构。

此外，将提取柱11以均匀的排布间距进行排布，并且分注嘴51r和51w与加压嘴41之间的排布距离分别为提取柱11的排布间距的整数倍，以上事实的结果是：可以同时对多个不同的提取柱11进行分注处理和加压处理，因此可以使处理时间缩短。顺便提及，提取柱11、废液容器12和回收容器13除了排布成直线状以外，还可以排布成曲线状(例如圆弧形)。当它们排布成(例如)圆弧形时，可以使用其支承轴为该圆弧的圆心的臂状物，将压缩空气供给并充入位于圆弧上的各个位置处的提取柱中。

在本发明的核酸提取方法和核酸提取装置中，洗涤液的分注及允许停留的时间以及回收液的分注及允许停留的时间这二者中，至少一者被控制为预定的时间。

图10是示出本发明的核酸提取步骤的工艺流程图。在核酸提取步骤(将在下文中提到)中，将使用上述的核酸提取装置100。

如图10所示，首先将含核酸的样品溶液S注入到提取柱11中(步骤S101)。将压缩空气引入到其中容纳有样品溶液S的提取柱11中(步骤S102)，并且将洗涤液W注入其中(步骤S103)。在分注洗涤液W之后，使洗涤液照原样停留然后再将压缩空气引入到提取柱中，从而使洗涤液W停留预定的时间，其中，核酸被浸泡在所述的洗涤液中(步骤S104)。在所述的预定时间结束后，洗涤液W被排放到废液容器12中(步骤S105)。

优选的是，将洗涤液W的允许停留时间控制为50秒到1,000秒，更优选的是，控制为100秒到300秒。

在分注洗涤液W之后，在将压缩空气引入到提取柱中之前，使洗涤液W(核酸被浸泡在所述的洗涤液中)停留预定的时间，由此可以使回收处理后的核酸提取量增加。

在此之后，分注回收液R(步骤S106)。在分注回收液R之后，在将压缩空气引入到提取柱11中之前，使回收液R停留预定的时间，其中，核酸被浸泡在所述的回收液中(步骤S107)。在所述的预定时间结束后，回收液R被排放到回收容器13中(步骤S108)。

优选的是，将回收液R的允许停留时间控制为20秒到300秒，更优选的是，控制为25秒到60秒。

在分注回收液R之后，在将压缩空气引入到提取柱中之前，使回收液R(核酸被浸泡在所述的回收液中)停留预定的时间，由此可以使回收处理后的核酸提取量增加。

将洗涤液W的注入及允许停留的时间或回收液R的注入及允许停留的时间控制为预定的时间，会得到这样的效果：可提取的核酸的量增加。在洗涤液W的注入及允许停留的时间以及回收液R的注入及允许停留的时间分别被控制为各自的预定时间的情况下，就可以进一步增加可提取的核酸的量。

例如，在仅仅使洗涤液W停留预定时间的情况下，就省略使回收液R停留的步骤(如图10中步骤S107所示)。另一方面，在仅仅使回收液R停留预定时间的情况下，就省略使洗涤液W停留的步骤(如图10中步骤S104所示)。

参照图3来说明这样一种机构，该机构用于将洗涤液的注入及允许停留的时间以及回收液的注入及允许停留的时间分别控制为预定的时间。

如图3所示，控制部分70控制气泵43、安全阀44和加压嘴41，使得在洗涤处理过程中分注洗涤液W之后，不向提取柱11供入压缩空气。然后，使核酸在提取柱11内的洗涤液W中浸泡预定的时间，通过控制部分70控制气泵43、安全阀44和加压嘴41，使压缩空气再次输入，由此使洗涤液W从提取柱11中排出。顺便提及，在回收处理过程中，在分注回收液R之后，控制部分70控制气泵43、安全阀44和加压嘴41，使得压缩空气不被输送到提取柱11中。核酸在提取柱内的回收液R中浸泡预定的时间，通过控制部分70控制气泵43、安全阀44和加压嘴41，使压缩空气再次输入，由此使回收液R从提取柱中排出。在这种实施方案中，控制部分70起到了用于控制允许停留时间的装置的作用。

在这种实施方案中，使用了一种机构，该机构通过控制部分70将洗涤液W的分注及允许停留的时间以及回收液R的分注及允许停留的时间分别控制为预定的时间，但对这种机构没有限制。例如，可以安装进气制动器，该制动器与气泵43、安全阀44和加压嘴41协作来终止压缩空气的供入，从而在洗涤液W和回收液R被分注后，使它们分别能在提取柱中停留预定的时间。

下面，将详细说明上述提取柱11中所安装的核酸吸附性多孔膜(核酸吸附性多孔材料)11b。

上述提取柱11所容纳的核酸吸附性多孔膜11b基本为核酸能够通过的多孔物质。其表面的特征在于：样品溶液中的核酸可通过化学键作用力的方式被吸附，并且其被构造成这样的方式：在使用洗涤液进行洗涤时，仍保持吸附状态，而在使用回收液进行回收时，核酸的吸附力变弱而被释放。

上述提取柱11所容纳的核酸吸附性多孔膜11b优选为以基本不涉及离子键的相互作用来吸附核酸的多孔膜。这意味着在使用多孔膜的条件下，没有发生“离子化”，并且可以推测：由于周围极性改变，核酸和多孔膜相互吸引。因此，可以以优异的分离性能和优良的洗涤效率来分离和纯化核酸。优选的是，核酸吸附性多孔膜是具有亲水性基团的多孔膜，并且可以推测：当周围极性改变时，核酸的亲水性基团和多孔膜的亲水性基团相互吸引。

本文中，术语“具有亲水性基团的多孔膜”是指这样的多孔膜，其中构成多孔膜的材料其本身具有亲水性基团，或者是这样的多孔膜，为了在多孔膜中引入亲水性基团，通过对多孔膜构成材料进行处理或涂敷而得到该多孔膜。多孔膜构成材料可以是有机或无机材料。例如，可以使用这样的多孔膜，其中多孔膜构成材料本身是具有亲水性基团的有机材料；可以使用这样的多孔膜，为了将亲水性基团引入其中，通过处理由不含亲水性基团的有机材料所制成的多孔膜而得到该多孔膜；可以使用这样的多孔膜，其中通过用具有亲水性基团的材料涂敷由不含亲水性基团的有机材料所制成的多孔膜，由此引入亲水性基团而得到该多孔膜；可以使用这样的多孔膜，其中多孔膜构成材料本身是具有亲水性基团的无机材料；可以使用这样的多孔膜，其中为了将亲水性基团引入其中，通过处理由不含亲水性基团的无机材料所制成的多孔膜而得到该多孔膜；并且可以使用这样的多孔膜，其中通过用具有亲水性基团的材料涂敷由不含亲水性基团的无机材料所制成的多孔膜，由此引入亲水性基团而得到该多孔膜。为了处理方便，优选使用有机材料(例如有机聚合物)作为构成多孔膜的材料。

亲水性基团是指能与水发生相互作用的极性基团(原子)，包括所有参与吸附核酸的基团(原子)。作为亲水性基团，优选那些与水表现出约为中等水平的相互作用的亲水性基团(参见由共立出版株式会社出版的《化学大词典》中所述的关于“亲水性基团”中的“亲水性不太强的基团”)，其实例包括羟基、羧基、氰基和羟乙基，优选羟基。

关于能够在本发明中使用的具有亲水性基团的多孔膜，可以举出含有酰氨基的有机材料的多孔膜。聚酰胺可优选用作含有酰氨基的有机材料。聚酰胺的实例为：纤维蛋白、聚氨基酸、多肽、聚丙烯酰胺、尼龙46、尼龙66、尼龙610、尼龙612、尼龙6、尼龙7、尼龙11和尼龙12，但是对此没有限定。还可以使用改性尼龙，例如，N-甲基改性尼龙、N-烷氧基甲基改性尼龙和N-烷硫基甲基改性尼龙。关于聚酰胺多孔膜，可以为通过用(例如)美国专利No.2,783,894、3,408,315、4,340,479、4,340,480、4,450,126和德国专利No.3,138,525以及日本专利申请公开No.58/037,842中所述的材料及所述的方法制成的那些，但是对此没有限制。

关于能够在本发明中使用的含有羟基的有机材料的多孔膜，其实例包括由以下物质形成的多孔膜：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和多糖(例如聚氧化亚乙基和具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物)，并且特别优选使用具有多糖结构的有机材料的多孔膜。

关于用于多孔膜的有机材料，还可以使用：乙烯基酰化物的聚合物的皂化产物；以及两种或多种单体的皂化共聚物，该皂化共聚物优选含有至少为乙烯基酰化物的单体单元。所述的乙烯基酰化物的聚合物的皂化产物的皂化率、以及所述的两种或多种单体的皂化共聚物(该皂化共聚物含有至少为乙烯基酰化物的单体单元)的皂化率均优选为1％或更高。还优选的是，上述乙烯基酰化物的酰基选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、庚酰基、辛酰基、癸酰基、十二酰基、十三酰基、十六酰基和十八酰基中的至少一种。

可优选使用纤维素、半纤维素、葡聚糖、淀粉酶、淀粉精、淀粉、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、葡甘露聚糖、地衣淀粉、异地衣淀粉、昆布糖、角叉菜胶、木聚糖、果聚糖、褐藻酸、透明质酸、软骨素、甲壳素和壳聚糖作为具有多糖结构的有机材料。但是，对此没有限制，并可以使用任何具有多糖结构或其衍生物的有机材料。此外，可优选使用任何上述多糖的酯衍生物。此外，可优选使用任何上述多糖的酯衍生物的皂化产物。

优选使用选自羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯中的一种或多种作为任何上述多糖的酯衍生物的酯。此外，更优选使用羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯的各自的皂化产物。

优选使用选自烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯中的一种或多种作为任何上述多糖的羧酸酯。此外，更优选使用任何上述多糖的烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯的各自的皂化产物。

优选使用选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、庚酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十六烷酰基和十八烷酰基中的一种或多种作为任何上述多糖的烷基羰基酯的酯基。此外，更优选使用具有一个或多个选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、庚酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十六烷酰基和十八烷酰基中的酯基的任何上述多糖的皂化产物。

优选使用一种或多种丙烯酰基和甲基丙烯酰基作为任何上述多糖的烯基羰基酯的酯基。此外，更优选使用具有一个或多个选自丙烯酰基和甲基丙烯酰基中的酯基的任何上述多糖的皂化产物。

优选使用一种或多种苯酰基和萘酰基(naphthaloyl)作为任何上述多糖的芳香基羰基酯的酯基。此外，更优选使用具有一个或多个含苯酰基和萘酰基的酯基的任何上述多糖的皂化产物。

优选使用硝酸纤维素、硝酸半纤维素、硝酸葡聚糖、硝酸琼脂糖、硝酸糊精、硝酸淀粉酶、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支链淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸异地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜胶、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明质酸、硝酸软骨素、硝酸甲壳素和硝酸壳聚糖作为任何上述多糖的硝酸酯。

此外，更优选使用硝酸纤维素、硝酸半纤维素、硝酸葡聚糖、硝酸琼脂糖、硝酸糊精、硝酸淀粉酶、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支链淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸异地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜胶、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明质酸、硝酸软骨素、硝酸甲壳素和硝酸壳聚糖的各自的皂化产物。

优选使用硫酸纤维素、硫酸半纤维素、硫酸葡聚糖、硫酸琼脂糖、硫酸糊精、硫酸淀粉酶、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支链淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸异地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜胶、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明质酸、硫酸软骨素、硫酸甲壳素和硫酸壳聚糖作为任何上述多糖的硫酸酯。

此外，更优选使用硫酸纤维素、硫酸半纤维素、硫酸葡聚糖、硫酸琼脂糖、硫酸糊精、硫酸淀粉酶、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支链淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸异地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜胶、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明质酸、硫酸软骨素、硫酸甲壳素和硫酸壳聚糖的各自的皂化产物。

优选选自烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯中的一种或多种作为任何上述多糖的磺酸酯。此外，更优选使用任何上述多糖的烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯的各自的皂化产物。

优选使用磷酸纤维素、磷酸半纤维素、磷酸葡聚糖、磷酸琼脂糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支链淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸异地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜胶、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明质酸、磷酸软骨素、磷酸甲壳素和磷酸壳聚糖作为任何上述多糖的磷酸酯。

此外，更优选使用磷酸纤维素、磷酸半纤维素、磷酸葡聚糖、磷酸琼脂糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支链淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸异地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜胶、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明质酸、磷酸软骨素、磷酸甲壳素和磷酸壳聚糖的各自的皂化产物。

优选使用膦酸纤维素、膦酸半纤维素、膦酸葡聚糖、膦酸琼脂糖、膦酸糊精、膦酸淀粉酶、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支链淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸异地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜胶、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明质酸、膦酸软骨素、膦酸甲壳素和膦酸壳聚糖作为任何上述多糖的膦酸酯。

此外，更优选使用膦酸纤维素、膦酸半纤维素、膦酸葡聚糖、膦酸琼脂糖、膦酸糊精、膦酸淀粉酶、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支链淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸异地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜胶、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明质酸、膦酸软骨素、膦酸甲壳素和膦酸壳聚糖的各自的皂化产物。

优选使用焦磷酸纤维素、焦磷酸半纤维素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸琼脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸淀粉酶、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支链淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸异地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜胶、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明质酸、焦磷酸软骨素、焦磷酸甲壳素和焦磷酸壳聚糖作为任何上述多糖的焦磷酸酯。

此外，更优选使用焦磷酸纤维素、焦磷酸半纤维素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸琼脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸淀粉酶、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支链淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸异地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜胶、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明质酸、焦磷酸软骨素、焦磷酸甲壳素和焦磷酸壳聚糖的各自的皂化产物。

可以使用甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羧乙基-氨基甲酰乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、氰乙基纤维素和氨基甲酰乙基纤维素作为任何上述多糖的醚类衍生物，但是其醚类衍生物并不限定于此。优选使用羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

还可以优选使用其中的羟基被以任意程度卤化取代的任何上述多糖。

以下将说明上文中所述的纤维素酯衍生物。纤维素(为上述纤维素酯衍生物的原料)的实例为：天然纤维素(例如棉籽绒和木浆(阔叶树木浆和针叶树木浆)、大麻、以及乙酸菌培养过程中产生的纤维素)；以及上述纤维素经酸水解、机械破碎、爆破处理或高温挤出处理来调节聚合度而得到的那些纤维素。可以使用由任何原料纤维素制成的任何纤维素酯衍生物，并且在某些情况下，可将这些纤维素酯衍生物混合后使用。这种纤维素原料的详细描述可以在(例如)文献“Plastic Materials(17)，Cellulose-Type Resins”(Marusawa和Uda著，由Nikkan Kogyo Shimbunsha株式会社在1970年出版)中找到。

如上所述，纤维素的分子量范围很宽。例如，天然纤维素的分子量为600,000到1,500,000(聚合度：约3,500到10,000)，纯棉绒的分子量为80,000到500,000(聚合度：约500到3,000)，木浆的分子量为80,000到1,340,000(聚合度：约500到2,100)。在本发明中，分子量在很大程度上影响着纤维素或其衍生物的机械强度，并且当分子量变小时，机械强度会从一个特定的聚合度开始突然下降，但是这样的纤维素仍可用作本发明的核酸吸附性多孔膜的材料，而不会产生任何问题。

作为上述核酸吸附性多孔膜的实例，可以使用通过纤维素的酯化反应而制成的纤维素酯衍生物的多孔膜。然而，上述特别优选的纤维素不能以原样使用，而是以棉绒或木浆通过纯化作用而制成的纯棉绒或纯的高级木浆的形式来使用。棉绒是棉籽的棉纤维中纤维长度较短的短纤维，其含有高含量(例如88重量％到92重量％)的α-纤维素，并且其纯度很高，几乎不含杂质。天然棉绒经过除尘、碱蒸煮、漂白、酸处理、脱水和干燥处理后可制成纯棉绒。详细情况在文献“Plastic Materials(17)，Cellulose-Type Resins”(第25页到第28页)(Marusawa和Uda著，由Nikkan Kogyo Shimbunsha株式会社在1970年出版)中有所描述，其中的表2到表3提到了纯棉绒的性质。更优选的纯棉绒是由本发明制成的。

在上述同一本书的第28页到第32页，还提到了纯木浆，其中的表2到表4还提到了纯木浆的性质，并且由所述方法纯化的木浆还可以优选地作为纤维素酯衍生物的原料。在本发明中，将经纯化的棉花绒与木浆混合使用也是优选的，虽然对它们的混合比没有特别限定，但是优选为5/95到95/5，更优选为10/90到90/10。混合的结果是：溶解性增强，由此可改善纤维素酯衍生物多孔膜的表面性质和动力特性。

其中，可以对作为浆粕纯度指标的α-纤维素的含量加以选择，例如，α-纤维素的含量为80重量％到100重量％，在浆粕为木浆的情况下，α-纤维素的含量通常为约85％到98％。在本发明中，还可以使用(例如)其中α-纤维素的含量为80％到96％(特别是92％到96％)这样的低纯度浆粕。在这样的浆粕中，通常使用木浆。

此外，在本发明的核酸吸附性多孔膜中，虽然葡萄糖是浆粕或棉花中的中性的构成糖(constituting saccharide)成分中的主要成分，但是还可含有甘露糖和木糖。虽然对甘露糖/木糖的比例没有特别限定，但是甘露糖/木糖的摩尔比为0.35/1到3.0/1，优选为0.35/1到2.5/1，更优选为0.35/1到2/1。在生产三醋酸纤维素时，甘露糖和木糖的总量为0.01摩尔％到5摩尔％，优选为0.1摩尔％到4摩尔％。顺便提及，“甘露糖”和“木糖”是浆粕中所含的半纤维素(木聚糖、葡甘露聚糖等)的主要构成糖。原料浆粕的构成糖成分和所得的纤维素酯衍生物(三醋酸纤维素)可以通过日本专利申请公开No.11/130,301中所述的方法来进行具体分析。

关于纤维素多孔膜，可优选使用再生纤维素的多孔膜。再生纤维素的实例为：将醋酸纤维素固体的表面或其全部通过皂化处理而形成纤维素的产物；由纤维素的铜氨溶液制成的产物；由纤维素的粘胶溶液制成的产物；以及由纤维素的碱溶液制成的产物。这些纤维素在晶态等方面与天然纤维素不同。纤维素中存在着晶型I、II、III和IV，本发明中可优选使用任何晶型，或者所包含的晶型I、II、III和IV可分别为任意比例。关于由醋酸纤维素多孔膜制成的再生纤维素多孔膜，可以使用由日本专利公报No.45/4,633、日本专利申请公开No.56/100,604等中所述的材料和方法而制成的那些，但是对此没有限定。关于由纤维素的铜氨溶液制成的再生纤维素多孔膜，可以使用由(例如)日本专利申请公开No.58/089,625、58/089,626、58/089,627、58/089,628、59/045,333、59/045,334、59/199,728、61/274,707、62/001,403、63/161,927和07/330,945中所述的材料和方法而制成的那些，但对此没有限定。还可以以相同的方式由粘胶溶液制成再生纤维素多孔膜，所述的粘胶溶液由纤维素与碱和二硫化碳发生反应而生成(其中，改变了原料成分和凝聚方法)，其产物可用在本发明中。关于由纤维素的碱溶液制成的再生纤维素多孔膜，也可以使用由(例如)日本专利申请公开No.62/240,328、62/240,329和01/188,539中所述的材料和方法制成的再生纤维素多孔膜，但是对此没有限定。

在本发明的核酸吸附性多孔膜中，上述纤维素酯衍生物的粘均聚合度优选为200到3,000。上述纤维素酯衍生物的重均分子量与上述纤维素酯衍生物的数均分子量之比优选为0.8到2。上述纤维素酯衍生物含有酸解离指数为1.93到4.5的酸或其盐是优选的。

在上述的纤维素酯衍生物中，乙酸的残留量或C_3-22脂肪酸优选为0.5重量％或更少。所述的纤维素酯衍生物优选含有1ppb到10,000ppm的碱金属和/或碱土金属中的至少一种。所述的纤维素酰化物优选含有1ppb到1,000ppm的下列物质中的至少一种，所述物质为：铝、铋、硅和重金属(例如铬、镁、铁、钴、镍、铜、锌、砷、银、镉、锡、锑、金、铂、汞和铅)。

关于特别优选的纤维素酯衍生物的多孔膜，可举出含有多种乙酰值不同的醋酸纤维素的有机大分子物质的多孔膜。关于具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物，可优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物、三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物、三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。特别优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。优选的是，由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素构成的混合物中二者的混合比(重量比)为99:1到1:99，更优选为90:10到50:50。

关于上述纤维素酯衍生物，还优选使用在日本专利申请公开No.10/045,803、11/269,304、08/231,761、08/231,761、10/060,170、09/040,792、11/005,851、11/269,304、09/090,101、57/182,737、04/277,530、11/292,989、12/131,524、12/137,115等中所提到的纤维素酯衍生物。对与本发明中的核酸吸附性多孔膜相关的这些材料没有特别限定。

关于评价纤维素结构的方法，还可以使用X射线分析法。根据该方法，有这样描述：纤维素分子排布在与纤维轴向平行的方向上，其通过氢键相互吸引，并形成了由5个纤维素分子的纤维二糖单元构成的晶胞。根据X射线方法，天然纤维素的结晶度为约70％，并且这样的纤维素可用于制备本发明中的纤维素酯衍生物。

关于其它可以在本发明中使用的纤维素，人们已经对其进行了各种分析，并且ASTM Standard Part 15、TAPPI Standard(TechnicalAssociation of the Pulp and Paper Industry)、JIS P 8101等中详细提到了这些分析方法。待测项目的实例为灰分、氧化钙和氧化镁的含量、α-纤维素值、β-纤维素值和铜值。

在本文中，皂化处理是指使醋酸纤维素与皂化处理液(例如氢氧化钠溶液)接触。结果，与皂化处理液接触的醋酸纤维素酯衍生物的酯基被水解，并且引入羟基，从而形成再生纤维素。由此制备的再生纤维素与初始纤维素在晶型方面是不同的。为了改变表面皂化率，通过改变氢氧化钠的浓度或氢氧化钠的处理时间来实施皂化处理。通过NMR、IR或XPS(例如检测羰基峰减弱的程度)来确定表面皂化率。

具有多糖结构的有机材料多孔膜的实例为：日本专利申请公开No.2003/128,691中所述的醋酸纤维素的表面皂化产物。醋酸纤维素的表面皂化产物是这样的产物：其中，对具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理，并且优选使用的是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物、三醋酸纤维素和二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物、以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物。优选的是，由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素构成的混合物中二者的混合比(重量比)为99:1到1:99。更优选的是，由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素构成的混合物中二者的混合比为90:10到50:50。在这种情况下，可以通过氧化处理的程度(皂化率)来控制固相表面上的羟基的量(密度)。为了提高核酸的分离效率，则羟基的量(密度)越高越好。例如，在醋酸纤维素(例如三醋酸纤维素)的情况下，皂化率(表面皂化率)优选为约5％或更高，更优选为10％或更高。为了使具有羟基的有机大分子物质的表面积更大，优选的是，对醋酸纤维素多孔膜进行皂化处理。在这种情况下，当使用其表面和背面对称的多孔膜时，优点是：在所述膜的表面和背面上皂化产物可能没有差别；而当使用其表面和背面不对称的多孔膜时，优点是：可以减少多孔膜被堵塞的不利情况；由此优选使用不对称的多孔膜。

向含有有机材料(不含羟基)的多孔膜引入羟基的方法是：把在聚合物主链或侧链上具有羟基的接枝聚合物链连接到多孔膜上。

用于使接枝聚合物链与有机材料多孔膜连接的方法有(例如)以下两种：使多孔膜和接枝聚合物链化学连接的方法；以及用多孔膜作为起始物使具有双键(能发生聚合反应)的化合物进行聚合，从而形成接枝聚合物链的方法。

首先，在使多孔膜和接枝聚合物链化学连接的方法中，使用在聚合物的末端或侧链上具有能够与多孔膜发生反应的官能团这样的聚合物，所述聚合物通过该官能团与多孔膜的官能团之间的化学反应而被接枝。对能与多孔膜发生反应的官能团没有特别限定，只要其能与多孔膜的官能团反应即可，并且其实例包括硅烷偶联基(例如烷氧基硅烷)、异氰酸基、氨基、羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯酰基等。

特别有用的在聚合物末端或侧链上具有反应性官能团的化合物的实例包括：在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有环氧基的聚合物以及在其末端具有异氰酸基的聚合物。对在此使用的聚合物没有特别限定，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可，其示例性实例包括聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸和它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐、聚氧化亚乙基以及类似物。

通过使用多孔膜作为起始点、使具有可聚合双键的化合物进行聚合而形成接枝聚合物链的方法通常被称为表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是指这样一种方法：其中通过等离子体辐射、光辐射、加热或类似的方法，在基材表面上形成活性部位，并且使得与多孔膜接触设置的、具有双键的可聚合化合物通过聚合反应而连接到所述的多孔膜上。

用于形成与基材相连的接枝聚合物链的化合物必须具有可聚合的双键和参与核酸吸附的亲水性基团这两种特征。作为这种化合物，具有亲水性基团的聚合物、具有亲水性基团的低聚物和具有亲水性基团的单体中的任何一种都可以使用，只要在其分子内具有双键即可。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。

作为特别有用的具有亲水性基团的单体的示例性实例，可以举出以下单体。例如，丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、单甲基丙烯酸甘油酯以及类似的含羟基的单体是特别适用的。此外，丙烯酸、甲基丙烯酸以及类似的含羧基的单体、或者它们的碱金属盐和胺盐也是适用的。

作为另一种用于把亲水性基团引入到不具有亲水性基团的有机材料多孔膜中的方法，可以用具有亲水性基团的材料进行涂敷。对用于涂敷的材料没有特别限定，只要其具有参与核酸吸附的亲水性基团即可，但是为了使操作简单，优选为有机材料聚合物。这类聚合物的实例包括聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯及其盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐、聚氧化亚乙基、醋酸纤维素以及具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物等，但是具有多糖结构的聚合物是合乎需要的。

可供选用的另一种方式是：可将醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物涂敷到不具有亲水性基团的有机材料多孔膜上，然后对经涂敷的醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在这种情况下，皂化率优选为约5％或更高。皂化率更优选为10％或更高。

作为具有亲水性基团的无机材料的多孔膜，可举例为含有二氧化硅化合物的多孔膜。作为含有二氧化硅化合物的多孔膜，可举例为玻璃滤膜。还可举出的是日本专利No.3,058,3442所述的二氧化硅多孔薄膜。这种二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制备：把能够形成双分子层的阳离子两性物质的展开液铺在基材上，通过除去液体膜中的溶剂，而在基材上制成两性物质的多层双分子层薄膜，使多层双分子层薄膜与含有二氧化硅化合物的溶液接触，然后取出并移走所述的多层双分子层薄膜。

关于向不具有亲水性基团的无机材料多孔膜中引入亲水性基团的方法，存在着如下方法：一种方法是使多孔膜和接枝聚合物链化学连接；以及另一种方法是使用多孔膜作为起始点，使用分子内具有双键的并含有亲水性基团的单体进行聚合而形成接枝聚合物链。

在通过化学键合作用使多孔膜和接枝聚合物链连接起来时，可向无机材料中引入能够与接枝聚合物链的末端官能团发生反应的官能团，并且使接枝聚合物链被化学连接到该官能团上。此外，当接枝聚合物链是使用多孔膜作为起始点、并且使用分子内具有双键的并含有亲水性基团的单体而聚合形成的时候，在含有双键的化合物进行聚合时作为起始点的官能团被引入到无机材料中。

作为具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有双键并含有亲水性基团的单体，适合使用的是在上述关于向不具有亲水性基团的有机材料多孔膜中引入亲水性基团的方法中所述的具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有双键并含有亲水性基团的单体。

向不含亲水性基团的无机材料的多孔膜中引入亲水性基团的另一种方法是在其上涂敷具有亲水性基团的材料。涂敷所用的材料不受限制，只要其具有参与核酸吸附的羟基即可；但为了易于操作，优选为有机材料的聚合物。该聚合物的实例包括聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯及其盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯及其盐、聚氧化亚乙基、醋酸纤维素以及乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物。

不含亲水性基团的无机材料的多孔膜的实例包括：由铝和类似的金属、玻璃、水泥、陶和类似的陶瓷制成的多孔膜，或者由新型陶瓷、硅和活性炭等经逐步加工(stepping)而制成的多孔膜。

对于不含亲水性基团的无机材料的多孔膜，将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物涂敷于其上，并且可以将经涂敷的醋酸纤维素和乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物皂化。在这种情况下，表面皂化率优选为5％或更高。表面皂化率更优选为10％或更高。

在上述制备核酸吸附性固体载体的步骤中，根据用途的不同，可以加入各种添加剂(例如，增塑剂、抗静电剂、防劣化剂、防紫外线剂、表面活性剂、剥离剂、着色剂、增强剂和交联剂)。关于添加剂的加入时间，虽然添加剂可以在浆液制备步骤中的任何时间加入，但是还可以在浆液制备步骤中的最后制备步骤中增加用于向制剂中加入添加剂的步骤。

如果需要，上述核酸吸附性固体载体可以含有增塑剂，并且可优选使用以下增塑剂：例如，日本专利申请公开No.2002/265,636所述的磷酸酯和羧酸酯；日本专利申请公开02/006,826所述的多元醇；日本专利申请公开No.05/194,788、60/250,053、04/227,941、06/016,869、05/271,471、07/286,068、05/005,047、11/080,381、07/020,317、08/057,879、10/152,568、10/120,824和11/124,445所述的(二)季戊四醇酯；日本专利申请公开No.11/246,704所述的甘油酯；日本专利申请公开No.2000/063,560所述的双甘油酯；日本专利申请公开No.11/092,574所述的柠檬酸酯；日本专利申请公开No.11/090,946所述的被取代的苯基磷酸酯；和日本专利申请公开No.56/100,604所述的增塑剂。在这些专利文献的描述中，不仅存在着很多针对增塑剂的优选的说明，还存在着很多针对其使用方法或其特性的优选的说明，并且这些说明也可优选地适用于本发明中的核酸吸附性固体载体中。

为了防止多孔膜在处理过程中带电，可以向上述核酸吸附性固体载体中加入抗静电剂。关于抗静电剂，可优选使用离子导电物质和导电性细颗粒。本文中，离子导电物质是指这样一种物质，该物质表现出导电性，并且含有用作携带电荷的载体的离子；其实例为离子型大分子化合物。离子导电物质的实例为：日本专利公报No.49/23,826、49/23,827和47/28,937中所述的阴离子大分子物质；日本专利公报No.55/734、日本专利申请公开No.50/054,672以及日本专利公报No.59/14,735、57/18,175、57/18,176和57/56,059中所述的在其主链中具有解离基团的紫罗烯型聚合物；以及日本专利公报No.53/13,223、57/15,376、53/45,231、55/145,783、55/65,950、55/67,746、57/11,342、57/19,735和58/56,858、日本专利申请公开No.61/027,853以及日本专利公报No.62/9,346中所述的在其侧链中具有阳离子解离基团的阳离子侧基型聚合物。在这些物质中，优选的是这样一种物质：其中导电物质是细颗粒，并且被充分分散并加入到上述的核酸吸附性固体载体中；关于优选使用的导电物质，优选为包括以下物质：含有金属氧化物或其复合氧化物的导电细颗粒、日本专利申请公开No.09/203,810所述的紫罗烯类导电聚合物或具有分子间交联结构的季铵类阳离子导电聚合物颗粒。优选的粒径为5nm到10μm，而更优选的粒径则取决于所用的细颗粒的类型。关于构成导电细颗粒的金属氧化物的实例，优选为ZnO、TiO₂、SnO₂、Al₂O₃、In₂O₃、SiO₂、MgO、MoO₂、V₂O₅等及其复合氧化物，并且特别优选的是ZnO、TiO₂和SnO₂。关于其中含有杂原子的实例，有效的是：向ZnO中加入Al和In等，向TiO₂中加入Nb和Ta等，或向SnO₂中加入Sb、Nb和卤素等。这种杂原子的加入量优选为0.01摩尔％到25摩尔％，并且特别优选为0.1摩尔％到15摩尔％。优选的是，核酸吸附性固体载体含有0.01体积％到20体积％的这种具有特定结构的金属氧化物导电粉末，其中，所述导电粉末的体积粘度不高于107Ωcm，或者，特别是不高于105Ωcm，其原生粒径为100

到0.2μm，并且其高次结构的长轴直径为30nm到6μm。作为可分散的颗粒聚合物交联型阳离子导电聚合物的特征在于：因为颗粒中的阳离子部分能够保持高浓度和高密度，所以该交联型阳离子导电聚合物具有优异的导电性，此外，即使在相对湿度较低的情况下，也不会表现出导电性下降，并且，虽然所述颗粒被充分分散成分散状态，但是在成膜情况下，在流动之后的成膜过程中，颗粒间的粘附力仍然很强，从而使膜具有高强度和优异的耐化学性。交联型阳离子导电聚合物类的可分散的颗粒聚合物，其粒径通常为约10nm到1,000nm，并且优选使用的粒径为20nm到300nm。本发明使用的可分散的颗粒聚合物通过裸眼观察，其外观为透明或稍微浑浊的溶液，但是在电子显微镜下则表现为颗粒分散体。还可以利用有机电子导电类的有机化合物。其实例为聚噻吩、聚吡咯、聚苯胺、聚乙炔和聚磷嗪。它们与聚苯乙烯磺酸和高氯酸等形成复合物而被优选用作酸供体。

可以向上述核酸吸附性固体载体中加入防劣化剂(例如，抗氧化剂、过氧化物降解剂、自由基抑制剂、金属失活剂、除酸剂和胺)和防紫外线剂。关于这种防劣化剂和防紫外线剂，可优选使用在日本专利申请公开No.60/235,852、03/199,201、05/190,707、05/194,789、05/271,471、06/107,854、06/118,233、06/148,430、07/011,056、07/011,055、07/011,056、08/029,619、08/239,509、07/011,056、2000/204,173、05/197,073、05/194,789、06/107,854、60/235,852、12/193,821、08/029,619、06/118,233、06/148,430、2002/265,636、05/197,073等。特别优选的防劣化剂的实例为二丁基羟基甲苯(BHT)。

防劣化剂的加入量优选为所要制备的溶液(浆液)重量的0.01％到1％，更优选为0.01％到0.08％。当防劣化剂的加入量少于0.01重量％时，则其效果不明显。当防劣化剂的加入量高于1重量％时，可能会发生这样一些情况：防劣化剂明显扩散(渗出)到固体载体的表面上。本发明优选的防劣化剂为：在25℃时为液体并且沸点为200℃的防劣化剂，或者是熔点为25℃到250℃的固体防劣化剂。更优选的防劣化剂为：在25℃时为液体并且沸点为250℃或更高的防劣化剂，或者是熔点为25℃到200℃的固体防劣化剂。当防劣化剂为液体时，其通常通过真空蒸馏来进行纯化，并且真空度越高，纯化效果越好。例如，真空度优选为100Pa或更低。此外，特别优选的是，使用真空蒸馏装置进行纯化。当增塑剂为固体时，通常通过重结晶(使用溶剂溶解、过滤、洗涤和干燥)来进行纯化。

还可以向上述核酸吸附性固体载体中加入表面活性剂。关于表面活性剂，可优选使用日本专利申请公开No.2002/265,636、日本专利公报No.55/031,418、以及文献“Tables of Surfactants，etc.”(2001年)(Japan Surfactant Industry Association出版)、以及文献“Applicationsof Surfactants”(Takao Kariyone著，1980年9月1日由Saiwai Shobo出版)等中所述的那些，但是对此没有限定。对本发明中优选的表面活性剂的类型和用量没有特别限定，可以使用任何量，只要能得到目标表面活性剂即可。

如果需要，核酸吸附性固体载体可以含有剥离剂，从而使得生产时剥离力变小。关于这种剥离剂，表面活性剂就合乎需要，并且可以使用磷酸酯类、磺酸酯类、羧酸酯类、非离子型、阳离子型等，但是没有特别限定。这些剥离剂在(例如)日本专利申请公开No.61/243,837和2000/099,847中被提及。酸解离系数pK_a为1.93到4.50[优选为2.0到4.4，更优选为2.2到4.3(例如，2.5到4.0)，特别优选为2.6到4.3(例如，2.6到4.0)]的酸或其盐是优选的剥离剂。所述的酸可以是任何无机酸和有机酸。酸的pK_a可以参见“Kagaku Binran(Handbook ofChemistry)，Fundamental Part II”(第三次修订版，由日本化学学会编著，由丸善株式会社出版)。也可以优选使用日本专利申请公开No.2002/265,636中所述的剥离剂。在这些文献的描述中，不仅存在着很多针对剥离剂的优选的说明，还存在着很多针对其使用方法或其特性的优选的说明，并且这些说明也可优选地适用于本发明中的核酸吸附性固体载体中。

可以向上述核酸吸附性固体载体中加入着色剂。关于着色剂，可以将已知的有机、无机以及有机-无机复合着色剂以所需的浓度单独或联合使用，或者以所需的浓度与分散剂(例如表面活性剂或保护性聚合物)一起使用，但对此没有限定，已知的着色剂可为例如：色料、染料、颜料、氧化着色颜料、还原着色颜料、pH指示剂、荧光颜料、偶合颜料、紫外线吸收颜料、红外线吸收颜料、近红外线吸收颜料、压敏颜料、光变色颜料、热变色颜料、电变色颜料、有机着色颜料、食品颜料、有机非线性光学颜料、化学发光颜料、药物颜料、医疗诊断用颜料、化妆品颜料、半导体激光用颜料、升华转印颜料、熔融转印颜料、热敏颜料、隐色颜料、电磁吸附性颜料、光导电性颜料和可带电的颜料。

为了增强膜的强度，可向上述核酸吸附性固体载体中加入增强剂。关于增强剂，可优选使用的实例为玻璃纤维、碳纤维、硅纤维、纤维素纤维、浆粕纤维、钛酸钾纤维、碳化硅晶须、氮化硅晶须、氧化锌晶须、硼酸铝晶须、碱性硫酸镁、纤维状的硬硅钙石、钛酸钙晶须、碳化硅(SiC)晶须和晶须状的碳酸钙，但对此没有限定，只要其是纤维状的或者是针状的晶体，则任何增强剂都可以使用。还可以加入用于增强抗弯曲性能的合成聚合物，尽管可优选使用日本专利申请公开No.54/011,081中所述的聚氨酯，但对其没有限定。

可以向上述的核酸吸附性固体载体中加入交联剂。关于交联剂，可以使用已知的那些，并且优选的是，根据固体载体材料的官能团来选择合适的类型。当所述的官能团是羟基时，可优选使用日本专利申请公开No.07/256,066、03/058,431等中所述的交联剂，但对其没有限定。

可以向核酸吸附性固体载体中加入湿润剂。关于湿润剂，可优选使用日本专利申请公开No.63/256,066、日本专利公报No.03/068,431等中所述的湿润剂，但对其没有限定。

溶液可从其内部通过、并且其厚度为10μm到500μm的核酸吸附性多孔膜是优选的。更优选的是，核酸吸附性多孔膜的厚度为50μm到250μm。为了容易洗涤，核酸吸附性多孔膜的厚度优选为较薄。

溶液可从其内部通过、并且最小孔径为0.22μm或更大的核酸吸附性多孔膜是优选的。更优选的是，核酸吸附性多孔膜的最小孔径为0.5μm或更大。此外，优选使用最大孔径与最小孔径之比为2或更大的多孔膜。结果，可得到足够的用于吸附核酸的表面积，并且孔不容易被堵。最大孔径与最小孔径之比更优选为5或更大。

溶液可从其内部通过、并且孔隙率为50％到95％的核酸吸附性多孔膜是优选的。孔隙率更优选为65％到80％。此外，泡点为0.1kgf/cm²到10kgf/cm²的核酸吸附性多孔膜是优选的。泡点更优选为0.2kgf/cm²到4kgf/cm²。

溶液可从其内部通过、并且压力损失为0.1kPa到100kPa的核酸吸附性多孔膜是优选的。结果，核酸吸附性多孔膜在加压状态下，可获得均匀的压力。压力损失更优选为0.5kPa到50kPa。在本文中，术语“压力损失”是指水每通过100μm的膜厚所需的最小压力。

溶液可从其内部通过、并且水的渗滤量(水在1kg/cm²的压力、25℃下通过时的渗滤量)为每1分钟每1cm²的膜1mL到5000mL的核酸吸附性多孔膜是优选的。水的渗滤量(水在1kg/cm²的压力、25℃下通过时的渗滤量)更优选为每1分钟每1cm²的膜5mL到1000mL。

溶液可从其内部通过、并且核酸吸附量为每1mg的多孔膜0.1μg或更多的核酸吸附性多孔膜是优选的。核酸吸附量更优选为每1mg的多孔膜0.9μg或更多。

溶液可从其内部通过、并且其所含的纤维素衍生物具有下述特征的核酸吸附性多孔膜是优选的，所述纤维素衍生物的特征为：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)不溶解，但是在48小时以内(不含48小时)溶解。此外，具有下述特征的纤维素衍生物是优选的，所述特征为：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)溶解，但是在将所述膜浸在5mL二氯甲烷中时，该纤维素衍生物在24小时以内(不含24小时)不溶解。其中更优选的是这样的纤维素衍生物：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)溶解，但是在将所述膜浸在5mL二氯甲烷中时，该纤维素衍生物在24小时以内(不含24小时)不溶解。

在核酸混合物溶液通过核酸吸附性多孔膜时，优选的是，使核酸混合物溶液从多孔膜的一侧流到另一侧，从而使溶液与多孔膜均匀接触。在核酸混合物溶液通过核酸吸附性多孔膜时，为了使孔不容易被堵，优选的是，使核酸混合物溶液以从较大孔径向较小孔径的方式通过核酸吸附性多孔膜。

当核酸混合物溶液通过核酸吸附性多孔膜时，流速优选为：每单位膜面积(cm²)2μL/秒到1500μL/秒，从而使溶液与多孔膜达到合适的接触时间。如果溶液与多孔膜的接触时间太短，则不能得到充分的分离和纯化的效果；而如果时间太长，则从可操作性来说不是优选的。流速优选为：每单位膜面积(cm²)5μL/秒到700μL/秒。

此外，溶液可从其内部通过的核酸吸附性多孔膜可以以一层的方式使用，但也可以以多层的方式使用。核酸吸附性多孔膜的多层可以彼此相同或互不相同。

优选使用这样的核酸分离柱：该核酸分离柱在具有至少两个开口的容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可通过该多孔膜。此外，优选使用这样的核酸分离柱：该核酸分离柱在具有至少两个开口的容器内容纳有多层核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可通过该多孔膜。在这种情况下，具有至少两个开口的容器所容纳的多层核酸吸附性多孔膜可相同或不同。

多层核酸吸附性多孔膜可以是无机材料核酸吸附性多孔膜和有机材料核酸吸附性多孔膜的组合。其实例是玻璃滤膜与再生纤维素多孔膜的组合。多层核酸吸附性多孔膜还可以是无机材料核酸吸附性多孔膜和有机材料核酸非吸附性多孔膜的组合。其实例是玻璃滤膜和尼龙(或聚砜)多孔膜的组合。

根据柱的形状的不同，可以将上述核酸吸附性多孔膜制成除膜以外的其它形式。例如，可将其制成片状或块状。

核酸分离纯化柱除了在具有至少两个开口的容器内容纳有核酸吸附性多孔膜(如上所述，溶液能够通过该膜)以外，不应该包含其它组件。可使用的容器材料的实例包括塑料，例如，聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯。此外，优选使用可生物降解的材料。此外，容器可以是透明的或有颜色的。

可使用这样一种核酸分离纯化柱，该柱具有用于区分各个核酸分离纯化柱的装置。用于区分各个核酸分离纯化柱的装置可包括条形码、二维条形码、磁条和IC卡。

还可使用具有这样一种结构的核酸分离纯化柱，所述结构使得可以很容易地从所述具有至少两个开口的容器中取出核酸吸附性多孔膜。

本发明所使用的试验样品不受限制，只要试验样品中含有核酸即可，例如，其在诊断领域中包括：作为试验样品收集的体液(例如全血、血浆、血清、尿、排泄物、精液和唾液)，或者植物(或其一部分)、动物(或其一部分)、细菌、病毒、培养的细胞以及由生物材料(例如上述样品的裂解产物和匀浆)制成的溶液。

使用含有试剂的水溶液处理这些试验样品，所述试剂能分解细胞膜和核膜，并溶解核酸，所以被称为核酸溶解试剂。由此可以使细胞膜和核膜分解，并且使核酸分散到水溶液中，从而得到核酸混合物溶液。

含有核酸的样品可以是含有单独一种核酸的样品，或者可以是含有多种不同核酸的样品。待回收的核酸不受种类的限制，其可以是DNA或RNA，可以是单链的或双链的，以及直链的或环状的。样品数可以为一个或多个(使用多个容器平行处理多个样品)。对待回收的核酸的长度也没有特别的限定，可以使用(例如)从几bp到几Mbp之间的任何长度的核酸。为了使操作方便，待回收的核酸的长度通常为约几bp到约几百kbp。本发明用于分离和纯化核酸的方法能够使试验人员迅速回收到比使用常规的用于分离和纯化核酸的简单方法得到的核酸相对更长的核酸，并且可以用来回收长度优选为50kbp或更长、更优选为70kbp或更长、进一步优选为100kbp或更长的核酸。为了回收较长的DNA，优选进行温和的搅拌和吸液。

通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤将在下文描述。在本发明中，核酸溶解试剂通过使细胞膜和核膜裂解，而用来使核酸溶解，核酸溶解试剂的实例包括含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、蛋白酶和核酸稳定剂这类化合物的溶液。

作为通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的方法，以下说明一种方法，该方法包括以下步骤：

(I)向容器中加入含细胞或病毒的样品；

(II)向容器中加入含离液盐或表面活性剂的核酸溶解试剂，并将样品与核酸溶解试剂的溶液混合；

(III)温育所得到的混合溶液；

(IV)向经温育的混合溶液中加入水溶性有机溶剂。

在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，通过均质处理样品可提高其对自动化处理的适应性。例如，这种均质处理可通过超声波处理、使用尖锐突出物处理、高速搅拌处理、通过细孔挤出处理或使用玻璃珠处理来实施。

此外，在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，通过使用含有蛋白酶的核酸溶解试剂，可提高核酸的回收量和回收率，从而可使含有核酸的样品的用量减少并使分析加速成为可能。

可优选使用至少一种选自丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等中的蛋白酶作为这种蛋白酶。此外，可优选使用多种蛋白酶的混合物。

没有特别限定丝氨酸蛋白酶，例如，可优选使用蛋白酶K。没有特别限定半胱氨酸蛋白酶，例如，可优选使用木瓜蛋白酶和组织蛋白酶。

没有特别限定金属蛋白酶，例如，可优选使用羧肽酶。

蛋白酶的使用量可以优选为在添加后达到每毫升全部反应体系有0.001IU到10IU、更优选为0.01IU到1IU的蛋白酶。

此外，可优选使用不含核酸酶的蛋白酶作为这种蛋白酶。此外，可优选使用含有稳定剂的蛋白酶。可优选使用金属离子作为稳定剂。具体地说，优选镁离子，例如，可以以氯化镁的形式添加。在蛋白酶中加入稳定剂可以使回收核酸所需的蛋白酶的量降至微量，从而减少核酸回收所需的费用。基于反应体系的总量，蛋白酶所用稳定剂的量优选为1毫摩尔/L到1000毫摩尔/L、更优选为10毫摩尔/L到100毫摩尔/L。

蛋白酶通过预先与其它试剂(例如离液盐和表面活性剂)混合，可以作为一种试剂使用，而用于回收核酸。

作为可供选择的另一种方式，蛋白酶可以与其它试剂(例如离液盐和表面活性剂)分开使用。

在后一情况下，样品首先与含有蛋白酶的试剂混合，然后把混合物与含有离液盐和表面活性剂的试剂混合。或者，在首先把样品与含有离液酸(chaotropic acid)和表面活性剂的试剂混合后，再混入蛋白酶。

此外，可以从容纳蛋白酶的容器逐滴直接加入到样品或样品与含有离液盐和表面活性剂的试剂形成的混合物中，就像滴眼药水一样。在此情况下，可简化操作。

核酸溶解试剂还可以优选为以干燥态供给。此外，例如，可以使用含有预先通过冷冻-干燥而得到的干燥态蛋白酶的容器。还可以通过同时使用以干燥态供给的核酸溶解试剂和预先含有干燥蛋白酶的容器，得到一种含有核酸的样品溶液。

核酸溶解试剂中离液盐的浓度优选为0.5摩尔/L或更高，更优选为0.5摩尔/L到4摩尔/L，甚至更优选为1摩尔/L到3摩尔/L。关于离液盐，已知的离液盐都可以使用，而没有特别限定。例如，可以使用胍盐、异硫氰酸钠、碘化钠和碘化钾。特别优选为胍盐。胍盐的实例包括盐酸胍、异硫氰酸胍和胍的硫氰酸盐(硫氰酸胍)，并且特别优选的是盐酸胍或胍的硫氰酸盐。这些盐可单独使用，或者将其中的两种或多种组合使用。

可以使用诸如脲之类的离液物质来代替离液盐。

表面活性剂(例如)包括非离子型表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂。

在本发明中，可优选使用非离子型表面活性剂和阳离子表面活性剂。

非离子型表面活性剂包括聚氧亚乙基烷基苯基醚类表面活性剂、聚氧亚乙基烃基醚类表面活性剂和脂肪酸烷醇酰胺，并且优选为聚氧亚乙基烃基醚类表面活性剂。在聚氧亚乙基(POE)烃基醚类表面活性剂中，更优选的是，POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亚烷基癸醚、POE脱水山梨糖醇单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、四油酸聚氧化亚乙基山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇。

阳离子表面活性剂包括溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵和氯化十六烷基吡啶鎓。

这些表面活性剂可以单独使用，或者将其中的两种或多种组合使用。在核酸溶解试剂中，表面活性剂的浓度优选为0.1重量％到20重量％。

当回收除RNA以外的核酸(例如DNA)时，优选的是，在使核酸溶解、从而由试验品制成含核酸的样品溶液的步骤中，向核酸溶解试剂溶液中加入RNA降解酶。在这种情况下，能够减少与待回收核酸共存的RNA的干扰。还优选加入DNA降解酶抑制剂。反之，在回收除DNA之外的核酸(例如RNA)的情况下，优选的是向核酸溶解试剂溶液中加入DNA降解酶。在这种情况下，能够减少与待回收核酸共存的DNA的干扰。还优选加入RNA降解酶抑制剂。能够特异性地抑制RNA降解酶的那些RNA降解酶抑制剂是优选的。对RNA降解酶没有特别限定，并且可优选使用能够特异性地降解RNA的酶(例如核糖核酸酶H)(RNase H)。对DNA降解酶没有特别限定，并且可优选使用能够特异性地降解DNA的酶(例如DNase I)。可以按常规使用的浓度来使用核酸降解酶和核酸降解酶抑制剂。还可以对它们进行常规的温热处理。优选的是将温热处理与蛋白降解酶处理一起进行。

作为核酸稳定剂，可举出这样的试剂：其可以发生反应使核酸酶的活性失活。根据试验样品的不同，存在这样的情况：其中含有核酸酶(能够使核酸降解)，结果当核酸被均化时，核酸酶与核酸发生反应，从而导致回收量显著降低。为了达到避免这种情况发生的目的，可以使具有使核酸酶失活的功能的稳定剂与核酸溶解溶液共存。结果，核酸的回收率和回收效率提高，而使得试验样品的用量最少化并使操作加速。

作为具有使核酸酶活性失活的功能的核酸稳定剂，可使用通常被用作还原剂的化合物。还原剂的实例包括：氢化化合物，例如，氢原子、碘化氢、硫化氢、氢化铝锂和硼氢化钠；高正电性金属，例如，碱金属、镁、钙、铝和锌，或它们的汞合金；有机氧化物，例如，醛类、糖类、甲酸和草酸；以及巯基化合物。在这些物质当中，巯基化合物是优选的。巯基化合物的实例包括N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇和烷基硫醇或类似的化合物。巯基化合物可以单独使用，或者将其中的两种或多种组合使用。

在核酸溶解试剂中，核酸稳定剂的浓度优选为0.1重量％到20重量％，并且更优选为0.3重量％到15重量％。在核酸溶解试剂中，巯基化合物的浓度优选为0.1重量％到10重量％，并且更优选为0.5重量％到5重量％。

在细胞膜和核膜被分解并且使核酸溶解、从而由试验品制成含核酸的样品溶液的上述步骤中，优选的是，含核酸的样品溶液中含有防沫剂(消泡剂)。

作为消泡剂，可举出如下试剂：硅类消泡剂(例如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液、改性聚硅氧烷和有机硅复合物等)、醇类消泡剂(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亚烷基二醇等)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇等)、脂肪油类消泡剂(例如，动物油和植物油等)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸、油酸和棕榈酸等)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝和硬脂酸钙等)、脂肪酸酯类消泡剂(例如，天然蜡和磷酸三丁酯等)、磷酸盐酯类消泡剂(例如，辛基磷酸钠等)、胺类消泡剂(例如，二戊基胺等)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺等)和其它消泡剂(例如，硫酸铁和矾土等)。这些消泡剂可以单独使用或者将其中的两种或多种组合使用。特别优选的是，将硅类消泡剂和醇类消泡剂这两种化合物组合在一起使用。

在核酸溶解试剂中，消泡剂的浓度优选为0.1重量％到10重量％。

核酸稳定剂优选为以干燥态供给。此外，还可以使用预先装有干燥态(例如通过冷冻干燥)的蛋白酶的容器。也可以通过同时使用上述干燥态的核酸溶解试剂和预先装有干燥态的蛋白酶的容器，而得到含核酸的试验样品。在通过上述方法获得含核酸的试验样品时，核酸溶解试剂和蛋白酶具有良好的储存稳定性，并且可以在不改变经分离和纯化的核酸的收率的情况下使操作简化。

对混合样品和核酸溶解试剂溶液的方法没有特别限定。

混合时，优选使用搅拌器在30到3000rpm下混合3分钟，由此可以提高所分离和纯化的核酸的收率。此外，还优选用上下翻转(end-over-end)的混合操作方式混合5到30分钟。此外，还可以通过反复吸液操作10到50次来实施混合。在此情况下，通过简单操作可以提高经分离和纯化的核酸的收率。

通过在蛋白酶的最佳温度下以最佳反应时间来温育样品和核酸溶解试剂溶液的混合物，可以提高经分离和纯化的核酸的收率。温育温度通常为20℃到70℃，这优选为蛋白酶的最佳温度，温育时间通常为1分钟到18小时，这优选为蛋白酶的最佳温育时间。对温育方法没有特别限定，并且可以用浸入热浴或放入加热室的方式来实施。

在上述细胞膜和核膜被分解并且使核酸溶解、从而由试验品制成含核酸的样品溶液的上述步骤中，被加入到经温育的混合溶液中的水溶性有机溶剂的实例为醇类、丙酮、乙腈和二甲基甲酰胺。特别优选使用的是醇类。任何伯醇、仲醇和叔醇都可以作为醇类使用。优选使用的是甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体之类的醇。更优选使用的是乙醇。这些水溶性有机溶剂中的每一种都可以单独使用或者可将其中的多种组合使用。在核酸溶解试剂溶液中，这种水溶性有机溶剂的浓度优选为1重量％到20重量％。在含核酸的样品溶液中，这种水溶性有机溶剂的最终浓度优选为5重量％到90重量％。

在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，核酸溶解试剂溶液的pH优选为5到10，更优选为6到9，进一步更优选为7到8。

在上述细胞膜和核膜被分解并且使核酸溶解、从而由试验品制成含核酸的样品溶液的上述步骤中，所得到的含核酸的样品溶液的表面张力优选为0.05J/m²或更低，其粘度优选为1mPa到10,000mPa，而其比重优选为0.8到1.2。

下文将对洗涤步骤进行说明。实施洗涤操作的结果是，可以提高核酸的回收量和回收纯度，并且使含核酸的试验品的需求量较少。关于洗涤步骤，为了达到快速的目的，可进行一次洗涤步骤，而如果纯度更重要时，则优选为重复洗涤多次。

在洗涤步骤中，使用试管、移液管、自动注入装置或具有类似功能的供料装置，将洗涤液提供给容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱。将洗涤液从核酸分离纯化柱的第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)供入，并且使用与所述第一个开口连接的压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵和电动移液管等)。由此使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并从不同于所述第一个开口的另一个开口排出洗涤液。此外，洗涤液可由第一个开口供入并由该第一个开口排出。此外，洗涤液可由不同于所述第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入，并由该同一开口排出。在这些方式中，非常优选的方式如下：洗涤液由核酸分离纯化柱的第一个开口供入、通过核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一个开口的另一个开口排出，这是因为该方式具有优异的洗涤效率。

在洗涤操作中，洗涤液的量优选为2μL/mm²或更多。当使用大量的洗涤液时，可改善洗涤效果，但为了保持可操作性并防止样品被排出，其用量优选为200μL/mm²或更少。

当在洗涤步骤中供入洗涤液、然后使其停留50秒或更长时，可以显著提高核酸的回收量。当洗涤液停留更长的时间时，可预料到会使回收量达到稳定，但是为了加快操作，选择1,000秒或更短的时间。

在本发明中，在自动提取装置供入洗涤液之后开始计时，因此允许停留时间是自动控制的。

在洗涤过程中，在使洗涤液通过核酸吸附性多孔膜时，流速优选为：每单位膜面积(cm²)2μL/秒到1500μL/秒，更优选为：每单位膜面积(cm²)5μL/秒到700μL/秒。通常，降低通过速度以延长时间，从而使洗涤进行得更充分。但是，优选的是，通过使用本发明的上述范围，可以使分离和纯化RNA的步骤快速地实施，而不会降低洗涤效率。

在洗涤步骤中，洗涤液的温度优选为4℃到70℃。此外，更优选的是，洗涤液温度为室温。在进行洗涤步骤的同时可对核酸分离纯化柱通过超声波或机械振动进行搅动。另一方面，可通过实施离心操作来进行洗涤。

通常，在洗涤步骤中，虽然洗涤液中不含诸如核酸降解酶之类的酶，但是其中可以含有降解诸如蛋白质之类的污染物的酶。在某些情况下，洗涤液中也可以含有DNA降解酶、RNA降解酶等。使用含DNA降解酶的洗涤液的结果是，只能够选择性地回收试验品中的RNA。反之，使用含RNA降解酶的洗涤液的结果是，只能够选择性地回收试验品中的DNA。

在洗涤步骤中，洗涤液优选为这样的溶液：其含有水溶性有机溶液和水溶性盐中的至少一种。洗涤液必须具有的能力是能够洗出核酸混合物溶液中的杂质，该杂质是与核酸一起被吸附到核酸吸附性多孔膜上的。在这一方面，洗涤液必须具有这样的成分：该成分仅使杂质从核酸吸附性多孔膜上解吸附，但不会使核酸解吸附。为达到所述目的，由于核酸极难溶于水溶性有机溶剂(例如醇类)，因此水溶性有机溶剂适合于保留核酸而使其它物质解吸附。此外，加入水溶性盐可以增强核酸的吸附效果，因此可以使除去杂质和不需要物质的操作的选择性得以提高。

关于洗涤液中所含的水溶性有机溶剂，可以使用甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、丁醇、丙酮等，在这些有机溶剂中，优选使用乙醇。洗涤液中所含的水溶性有机溶剂的量优选为20重量％到100重量％，更优选为40重量％到80重量％。

另一方面，对于洗涤液中所含的水溶性盐来说，卤盐是优选的，并且在卤盐中，氯化物是更优选的。水溶性盐还优选为一价阳离子或二价阳离子的盐，特别优选碱金属盐或碱土金属盐。在这些金属盐中，钠盐和钾盐是最优选的。当洗涤液中含有水溶性盐时，其浓度优选为10毫摩尔/L或更高，并且对浓度上限没有特别限定，只要该上限不影响杂质的溶解性即可，其浓度优选为1摩尔/L或更低，更优选为0.1摩尔/L或更低。在上述所有情况中，水溶性盐为氯化钠并且氯化钠浓度为20毫摩尔/L或更高是特别优选的。

此外，洗涤液的特征在于其中不含离液物质。结果，可减小洗涤步骤后离液物质混入回收步骤中的可能性。在回收步骤中，当离液物质混入其中时，该物质通常会抑制诸如PCR反应之类的酶反应，因此，考虑到之后的酶反应，理想的情况是洗涤液中不含离液物质。此外，因为离液性物质具有腐蚀性和危害性，所以为了操作的安全性，不需要时就不使用离液性物质对实验人员极为有利。

在本文中，离液物质是指上文所述的脲、氯化胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸钠、碘化钠和碘化钾等。

由于洗涤液对柱或者类似的容器具有高度的润湿性，所以在核酸分离纯化过程中的洗涤步骤期间，洗涤液常常保留在容器中，结果洗涤步骤之后的回收步骤受到洗涤液污染，从而导致核酸纯度降低并使随后步骤中的反应性降低。因此，在本发明的第一种方法和第二种方法中，当使用柱或类似的容器进行核酸的吸附和解吸附时，重要的是，在吸附或洗涤中使用的溶液、特别是洗涤液不能留在柱内，这样它就不会对下一步骤产生影响。

因此，为了防止洗涤步骤中使用的洗涤液对随后步骤中使用的回收液造成污染，并由此保持柱内的洗涤液残留量为最小，洗涤液的表面张力小于0.035J/m²是理想的。当表面张力小时，可改善洗涤液对柱的润湿性能并且可控制残留溶液的体积。

然而，为了提高洗涤效率，可增加水的比例，但在这种情况下，洗涤液的表面张力增大并且残留溶液的量增多。当洗涤液的表面张力为0.035J/m²或更大时，可通过增强柱的斥水性从而控制残留溶液的量。通过增强柱的斥水性，而形成液滴，并且可通过液滴的向下流动来控制残留溶液的量。用于增强斥水性的方法的实例包括：在柱表面上涂敷防水剂(例如硅)；在柱成形时，混入防水剂(例如硅)；以及类似的方法，但不限于此。

在使用本发明中的核酸吸附性多孔膜时，可以简化洗涤步骤。由此，(1)洗涤液通过核酸吸附性多孔膜的次数在这种情况下仅为一次；(2)能在室温下实施洗涤步骤；(3)在洗涤后，在这种情况下可以直接将回收液注入到提取柱内；(4)可以是上述(1)、(2)和(3)中的任何一个或两个或多个步骤。其原因在于，在常规方法中，为了快速地除去洗涤液中所含的有机溶剂，因此通常需要干燥步骤，但是由于本发明中的核酸吸附性多孔膜是薄膜，所以可以省略干燥步骤。

在常规的核酸分离和纯化的步骤中，存在以下问题：在洗涤步骤期间，洗涤液经常溅散并附着在其它部位上，从而造成样品玷污(污染)。通过改善废液容器和核酸分离纯化柱的形状，可以抑制洗涤步骤中的这类污染，其中，在所述柱内，核酸吸附性多孔膜被容纳在具有两个开口的容器中。

下面，将说明核酸从核酸吸附性多孔膜上解吸附并回收的步骤。在回收步骤中，使用自动注入装置或具有类似功能的供料装置将回收液供给装有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱。将回收液由核酸分离纯化柱的第一个开口(含有核酸的样品溶液已通过该开口注入)供入，并在使用与所述第一个开口连接的压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成真空的状态下，使回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且可从不同于所述第一个开口的另一个开口排出。也可以将回收液由所述第一个开口供入并由同一开口排出。还可以使回收液由不同于核酸分离纯化柱的所述第一个开口(含有核酸的样品溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入，并且也从该开口排出。然而，以下方法具有优异的回收效率，因而是更优选的，所述方法为：回收液由核酸分离纯化柱的第一个开口供入、通过核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一个开口的另一个开口排出。

当在回收步骤中供入回收液、然后使其停留20秒或更长时，可以显著提高核酸的回收量。当回收液停留更长的时间时，可预料到会使回收量达到稳定，但是为了加快操作，选择300秒或更短的时间。

在本发明中，在自动提取装置供入回收液之后开始计时，因此可以自动控制回收液的允许停留时间。

调节回收液的体积与含核酸的样品溶液(由试验品制备得到)的体积之比，由此可实现核酸的解吸附。含有经分离和纯化的核酸的回收液的体积取决于当时所使用的试验品的量。尽管回收液的常规用量为几十微升到几百微升，但是当样品的量极少，或者反之，当大量核酸待分离和纯化时，回收液的用量可在1微升到几十毫升之间变化。

关于回收液，可优选使用经纯化的蒸馏水、Tris/EDTA缓冲液以及类似的溶液。此外，当使回收的核酸进行PCR(聚合酶链式反应)时，可使用PCR用的缓冲液(例如，含有最终浓度为50毫摩尔/L的KCl、10毫摩尔/L的Tris-HCl和1.5毫摩尔/L的MgCl₂的水溶液)。

优选的是，回收液的pH为pH2到pH11，更优选为pH5到pH9。此外，离子强度和盐浓度会对被吸附核酸的洗脱产生特别影响。优选的是，回收液的离子强度为290毫摩尔/L或更低，盐浓度为90毫摩尔/L或更低。其结果是，核酸的收率提高，并且可回收更多的核酸。被回收的核酸可以是单链的，也可以是双链的。

当参照含核酸的样品溶液的初始体积来减小回收液的体积时，可以得到含有浓缩核酸的回收液。优选的是，可以使(回收液的体积)：(样品溶液的体积)为1:100到99:100，更优选的是，可以使(回收液的体积):(样品溶液的体积)为1:10到9:10。其结果是，在这种情况下可以容易地浓缩核酸，而无需在核酸分离纯化之后的步骤中实施浓缩操作。根据这种方法，可提供一种用于制备核酸溶液的方法，其中，该溶液中的核酸浓度比试验品中的高。

另一种方法是，在回收液的体积大于含核酸的样品溶液的初始体积的条件下使核酸解吸附，由此可制备出含有所需浓度的核酸的回收液，并且可制备出适合于下步操作(例如PCR)的含核酸的回收液。优选的是，可以使(回收液的体积):(样品溶液的体积)为1:1到50:1，更优选的是，可以使(回收液的体积):(样品溶液的体积)为1:1到5:1。其结果是得到这样的优点：在核酸分离纯化之后，不再需进行繁琐的浓度调整操作。此外，使用足量的回收液的结果是，能够提高从多孔膜回收的核酸的回收率。

对回收液注入的次数没有限定，注入次数可以是一次或多次。通常，在方便快捷地分离和纯化核酸时，可通过一次回收操作的方式来进行，但是在要回收大量核酸时，可以多次注入回收液。

在回收步骤中，可将核酸的回收液配制成在后续步骤中可以使用的组合物。经分离和纯化的核酸经常要通过PCR(聚合酶链式反应)方法进行扩增。在此情况下，经分离和纯化的核酸溶液必须使用适合于PCR方法的缓冲液来进行稀释。当适合于PCR方法的缓冲液被用于本发明的回收步骤的回收液中时，就可以方便快捷地转入随后的PCR步骤。

并且，在回收步骤中，可加入用于阻止RNA(被回收在RNA回收液中)降解的稳定剂。作为稳定剂，可加入抗细菌剂、抗真菌剂、核酸降解抑制剂以及类似的试剂。作为核酸酶抑制剂，可举例为EDTA及类似的试剂。此外，作为另一种实施方案，也可以预先向回收容器中加入稳定剂。

并且，对回收步骤中所使用的回收容器没有特别限定，可使用由在260nm处没有吸收的原料制成的回收容器。在此情况下，无需把回收的RNA溶液转移到其它容器就可测量该溶液的浓度。作为在260nm处没有吸收的原料，可使用(例如)石英玻璃和类似的原料，但该原料不限于此。

可使用容纳有核酸吸附性多孔膜(各溶液能按上文所述的方式通过该膜)的核酸分离纯化柱、并按照以下步骤来分离和纯化核酸。可列出以下步骤：(a)向在具有至少两个开口的容器内容纳有核酸吸附性多孔膜(溶液可以通过该膜)的核酸分离纯化柱的第一个开口注入含核酸的样品溶液；(b)使用与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接的压力差产生装置，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，使被注入的含核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜、并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；(c)向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入洗涤液；(d)使用与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接的压力差产生装置，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，使被注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜、并从另一个开口排出，由此在核酸仍吸附在核酸吸附性多孔膜上的状态下，洗涤该膜；(e)向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入回收液；以及(f)使用与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接的压力差产生装置，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，使被注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜、并从另一个开口排出，由此使核酸从核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且将解吸附的核酸排放到核酸分离纯化柱的外部。

在上述步骤(b)、(d)和(f)中的每一步中，含核酸的样品溶液、洗涤液或回收液都是在加压状态下通过核酸吸附性多孔膜。更优选的是，在上述步骤(b)、(d)和(f)中的每一步中，含核酸的样品溶液、洗涤液和回收液都被注入到在具有至少两个开口的容器内容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，并且都使用与该柱的所述第一个开口连接的压力差产生装置使该柱的内部形成加压状态，由此每种被注入的溶液都从所述柱流过并由另一个开口排放。含核酸的样品溶液、洗涤液或回收液在加压状态下通过上述多孔膜的结果是，所述装置能够以紧凑的方式自动操作，因此是优选的。实施加压的程度优选为约10kpa到200kpa，更优选为40kpa到100kpa。

在上述分离和纯化核酸的步骤中，从最开始注入含核酸的样品溶液，直到在核酸分离纯化柱的外部得到核酸，该过程可以在10分钟之内完成，或者，在合适的环境下，该过程可以在2分钟之内完成。在按照上述步骤分离纯化核酸之后，还可以制备出收率为试验品所含核酸的总量的50重量％或更高的核酸，在合适的环境下，其收率为90重量％或更高。

在上述分离和纯化核酸的步骤中，可以回收分子量范围宽达为1kpb到200kpb(特别是20kpb到140kpb)的核酸。与使用玻璃滤膜的离心柱的常规方法相比，本发明能够回收链更长的核酸。

此外，在上述分离和纯化核酸的步骤中，可回收得到这样的核酸：在含有DNA的情况下，可回收得到其纯度与紫外光-可见光分光光度计的吸光度测量值(260nm/280nm)为1.6到2.0相对应的核酸；在含有RNA的情况下，可回收得到其纯度与紫外光-可见光分光光度计的吸光度测量值(260nm/280nm)为1.8到2.2相对应的核酸，并且可以稳定地得到几乎不含杂质污染物的高纯度核酸。此外，可回收得到紫外光-可见光分光光度计的吸光度测量值(260nm/280nm)为约1.8的DNA和吸光度测量值(260nm/280nm)为约2.0的RNA。

实施例

实施例1

以下对通过采用本发明的核酸提取方法而进行的核酸提取步骤所收集的核酸的收率进行测量试验。在本试验中，使用上述实施方案中所说明的核酸提取装置。

(1)核酸分离纯化容器的制作

关于用作本实施例的提取柱的核酸分离纯化容器，用高抗冲聚苯乙烯制成这样的核酸分离容器：其内径为7mm，其中容纳有用于吸附核酸的固相，并具有两个开口。底端开口的直径为2.5mm。

(2)核酸分离纯化单元

关于核酸吸附性多孔膜，使用通过将三醋酸纤维素多孔膜进行皂化处理而制备的多孔膜(膜厚：80μm)，并将其装在上述(1)所制作的核酸分离柱的核酸吸附性多孔膜的容纳部分中。

(3)RNA溶解试剂和洗涤液的制备

按照以下配方来制备RNA溶解试剂和洗涤液。

(RNA溶解试剂的配方)

盐酸胍(由Life Technology公司生产)         382g

Tris(由Life Technology公司生产)           12.1g

Triton X-100(由ICN公司生产)       10g

蒸馏水                            1,000mL

(洗涤液的配方)

10毫摩尔/L Tris-HCl(pH7.5)  30％的乙醇

(回收液的配方)

1毫摩尔/L Tris-HCl(pH6.5)

(4)核酸的纯化操作

制备经温育的人骨髓瘤细胞(HL60)溶液。收集经温育的溶液，使其含有1×10⁶个细胞，将得到的细胞溶液在300×5g的条件下离心沉淀，并除去上清液从而得到细胞。向上述HL60细胞(1×10⁶个)中加入200μL的上述RNA溶解试剂，然后进行搅动，向其中加入200μL的乙醇，并对混合物进行搅动从而得到含RNA的样品溶液。将含RNA的样品溶液注入到核酸纯化单元(在上述(1)和(2)中制备)的第一个开口中，其中，所述的核酸纯化单元具有有机大分子物质的多孔膜，并且所述的有机大分子物质含有具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物；然后将压力差产生装置与所述第一个开口连接，使核酸分离纯化单元的内部形成加压状态，从而使被注入的含RNA的样品溶液通过上述多孔膜以便与多孔膜接触，然后从核酸分离纯化单元的另一个开口排放出样品溶液。之后，将洗涤液注入到上述核酸分离纯化单元的所述第一个开口，将压力差产生装置与所述第一个开口连接，使核酸分离纯化单元的内部形成加压状态，从而使被注入的洗涤液通过上述多孔膜、并从另一个开口排出。接着，将回收液注入到上述核酸分离纯化单元的所述第一个开口，将压力差产生装置与核酸分离纯化单元的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使被注入的回收液通过所述多孔膜、并从另一个开口排出，同时回收排出的溶液。

(5)经分离和纯化的RNA的确认

测量回收液在260nm处的吸收光谱，从而确定RNA的收率，并对RNA的收率与本实施例的核酸提取步骤中的洗涤液允许停留时间和回收液允许停留时间的关系进行评价。作为本实施例的结果，核酸的收率与注入洗涤液之后使其停留的时间这两者之间的关系显示在图11中。此外，核酸的收率与注入回收液之后使其停留的时间这两者之间的关系显示在图12中。

如图11和图12所示，可以发现：当对注入洗涤液之后使其停留的时间和注入回收液之后使其停留的时间进行控制、从而使它们达到预定的时间时，RNA的收率显著提高。更具体地说，如图11所示，可以发现：当使被注入的洗涤液停留50秒或更长时，可以显著提高RNA的收率，并且当时是使洗涤液与RNA一起停留。如图12所示，可以发现：当使被注入的回收液停留20秒或更长时，可以显著提高RNA的收率，并且当时是使回收液与RNA一起停留。

工业适用性

根据本发明，在通过用核酸吸附性多孔膜吸附含核酸的样品溶液中的核酸、然后通过洗涤等使核酸解吸附的核酸分离纯化方法中，可以以紧凑和廉价的方式来制定核酸提取方法并构造核酸提取装置，用该方法和该装置来处理含核酸的样品溶液具有以下优点：高效、简便、快速、优异的自动化适应性和良好的重复性。

本申请要求的外国优先权所对应的各外国专利申请的全部公开内容都以引用方式并入本文，如同其全部内容在此描述一样。

Claims (19)

1.一种提取核酸的方法，该方法包括：

通过使含核酸的样品溶液与核酸吸附性固体载体接触，从而将核酸吸附到所述的核酸吸附性固体载体上；

在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固体载体上时，通过使洗涤液与所述的核酸吸附性固体载体接触，从而对所述的核酸吸附性固体载体进行洗涤；以及

通过将回收液与所述的核酸吸附性固体载体接触，从而使所述核酸从所述的核酸吸附性固体载体上解吸附；

其中，在所述洗涤液的分注及允许停留的时间以及所述回收液的分注及允许停留的时间这二者中，至少有一个所述时间被控制为预定时间。

2.根据权利要求1所述的方法，

其中将所述洗涤液的允许停留时间控制为50秒到1,000秒。

3.根据权利要求1所述的方法，

其中将所述洗涤液的允许停留时间控制为100秒到300秒。

4.根据权利要求1到3中的任意一项所述的方法，

其中将所述回收液的允许停留时间控制为20秒到300秒。

5.根据权利要求1到3中的任意一项所述的方法，

其中将所述回收液的允许停留时间控制为25秒到60秒。

6.根据权利要求1到5中的任意一项所述的方法，

其中所述的核酸吸附性固体载体是通过基本不涉及离子键的相互作用来吸附核酸的核酸吸附性固体载体。

7.根据权利要求1到6中的任意一项所述的方法，

其中用于制备含核酸的样品溶液的方法包括：

将含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、蛋白酶和核酸稳定剂中的化合物的预处理溶液与试验样品混合，从而得到混合后的溶液；以及

向所述的混合溶液中加入水溶性有机溶剂。

8.根据权利要求7所述的方法，

其中所述的核酸稳定剂为巯基化合物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，

其中所述的离液盐为胍盐。

10.根据权利要求7到9中的任意一项所述的方法，

其中所述的水溶性有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

11.根据权利要求1到10中的任意一项所述的方法，

其中所述的核酸吸附性固体载体被容纳于核酸提取柱的、具有至少两个开口的容器的内部；以及

其中所述方法包括：

在将所述的含核酸的样品溶液分注到所述的核酸提取柱中之后，通过压力差使所述的样品溶液中的所述核酸吸附到所述的核酸吸附性固体载体上；

在将所述的洗涤液分注到所述的核酸提取柱中之后，通过压力差除去杂质；以及

在将所述的回收液分注到所述的核酸提取柱中之后，通过压力差使吸附到所述的核酸吸附性固体载体上的所述核酸从该核酸吸附性固体载体上分离出来，从而与所述回收液一起回收所述核酸。

12.一种用于实施根据权利要求11的所述方法的核酸提取装置，

其中所述的核酸吸附性固体载体为过滤材料。

13.根据权利要求12所述的核酸提取装置，

其中所述的核酸提取装置通过加压自动地实施提取操作；以及

其中所述的提取操作包括：

在将含核酸的样品溶液分注到核酸提取柱中之后，使所述的样品溶液中的所述核酸吸附到所述的过滤材料上；

在将洗涤液分注到所述的核酸提取柱中之后，除去杂质；以及

在将回收液分注到所述的核酸提取柱中之后，使吸附到所述的过滤材料上的所述核酸从该过滤材料上分离出来，从而与所述回收液一起回收所述核酸。

14.根据权利要求12或13所述的核酸提取装置，该装置包括：

压缩空气供给机构，其通过加压嘴将压缩空气引入到所述的核酸提取柱中；以及

分注机构，该机构包括：第一分注嘴，用于将洗涤液分注到所述的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用于将回收液分注到所述的核酸提取柱中。

15.根据权利要求12到14中的任意一项所述的核酸提取装置，该装置包括：

保持机构，用于保持多个经排布的核酸提取柱和多个经排布的回收容器，所述回收容器用于接收所述的含核酸的回收液；

压缩空气供给机构，用于将压缩空气由单个加压嘴引入到所述的多个经排布的核酸提取柱中；

分注机构，该机构包括：第一分注嘴，用于将洗涤液分注到所述的多个经排布的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用于将回收液分注到所述的多个经排布的核酸提取柱中；以及

移动装置，用于使所述的压缩空气供给机构的所述的单个加压嘴和所述的保持机构这两者之一相对于另一者进行相对移动。

16.根据权利要求12到15中的任意一项所述的核酸提取装置，

其中，所述的多个经排布的核酸提取柱被支承在固定侧；以及

其中，所述的压缩空气供给机构的所述的单个加压嘴以在所述的多个经排布的核酸提取柱的排布方向上可移动的方式受到支承。

17.根据权利要求12到16中的任意一项所述的核酸提取装置，

其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴中的至少一者与所述的单个加压嘴被设置成一体化的可移动件。

18.根据权利要求12到17中的任意一项所述的核酸提取装置，

其中，所述的压缩空气供给机构的所述的单个加压嘴被支承在固定侧；以及

其中，所述的多个经排布的核酸提取柱以在该多个经排布的核酸提取柱的排布方向上可移动的方式受到支承。

19.根据权利要求12到18中的任意一项所述的核酸提取装置，

其中，以相同的排布间距来设置所述的多个核酸提取柱；以及

其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴分别与所述的单个加压嘴的排布距离均为所述的多个核酸提取柱的所述的相同的排布间距的整数倍。

Images