ES2874080T3 - Métodos para extraer ARN pequeños bioactivos de plantas y hongos - Google Patents

Abstract

Un método para aislar una fracción enriquecida en moléculas de ARN pequeño a partir de una muestra de hongos y/o plantas que comprende: a') incubar tejido o células de hongos y/o plantas con una disolución de bicarbonato de metal alcalino a una temperatura de 50-100 °C, separar el líquido de la fase sólida para obtener una fase líquida y b) añadir una disolución de alcohol a la fase líquida obtenida en la etapa a') para obtener una disolución; c) cargar la disolución obtenida en un soporte sólido capaz de unirse selectivamente a moléculas de ARN pequeño; d) eluir moléculas de ARN pequeño de dicho soporte sólido.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para extraer ARN pequeños bioactivos de plantas y hongos

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para aislar o extraer moléculas de ARN pequeño (ARNp) de una muestra de un hongo o una planta. Dichos ARNp comprenden ARN monocatenarios y/o ARN monocatenarios con alineación parcial, pero más preferiblemente ARN bicatenario con o sin complementariedad de secuencia perfecta. El ARNp obtenido se puede utilizar en preparaciones alimentarias y/o en los campos nutracéutico, cosmecéutico o farmacéutico.

Antecedentes de la invención

El documento WO2005012523 se refiere al uso de métodos y composiciones para el aislamiento de moléculas de ARN pequeño (100 nucleótidos o menos), tales como microARN y moléculas de ARNip.

El documento WO2011086195 se refiere a un método para aislar ARN pequeño de una muestra que comprende unir el ARN a partículas de sílice poniendo en contacto la muestra con a) al menos un alcohol, b) al menos una sal caotrópica que comprende un anión caotrópico seleccionado del grupo que consiste en tricloroacetato, perclorato y trifluoroacetato y c) partículas de sílice, y separar el ARN unido del resto de la muestra. También se proporcionan composiciones y kits para aislar eficazmente moléculas de ARN pequeño de muestras, en particular de muestras biológicas, tales como sangre, tejidos de productos sanguíneos y fluidos corporales. El documento WO2014033326 se refiere a un método para aislar ARN que incluye ARN pequeño que tiene un tamaño de 200 nt o menos de una muestra, que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una composición que comprende ARN y un agente caotrópico; b) agregar alcohol; c) incubar la mezcla durante al menos 2 min; d) añadir alcohol adicional a la mezcla para ajustar la concentración total de alcohol en la mezcla a >= 50 %; e) unir el ARN contenido en la mezcla a una fase sólida que se une al ácido nucleico; f) opcionalmente lavar el ARN unido; g) eluir opcionalmente el ARN de la fase sólida. Debido a la adición gradual de alcohol, se mejora el rendimiento general de ARN y el rendimiento del ARN pequeño.

El documento WO2007100934 se refiere a composiciones y métodos de extracción para el aislamiento rápido y eficaz de moléculas de ARN pequeño de una muestra biológica. En particular, las composiciones de extracción, cuando se ponen en contacto con una muestra biológica, liberan las moléculas de ARN pequeño de las otras moléculas en una muestra biológica, y las moléculas de ARN pequeño liberadas pueden aislarse.

El documento WO2010033652 se refiere a un método para la extracción y purificación de ARN pequeño de una disolución de muestra. Por consiguiente, primero se mezcla una muestra con un disolvente orgánico para formar una mezcla que contiene el disolvente. La mezcla se aplica a un primer soporte mineral para que el ARN grande se una. Se recoge el filtrado que contiene ARN pequeño no unido y se mezcla con un segundo disolvente orgánico para formar una segunda mezcla que contiene el segundo disolvente. Esta segunda mezcla se aplica a un segundo soporte mineral para que el ARN pequeño se una. Después de una etapa de lavado, se eluye el ARN pequeño. También se proporciona un método para el aislamiento de ARN grande, eluyendo el ARN grande del primer soporte mineral. Además, la proteína total está presente en el filtrado y puede aislarse mediante un método convencional.

El documento WO9506652 se refiere a composiciones y métodos para aislar ácidos nucleicos con longitudes superiores a aproximadamente 50 bases, a partir de células, geles, disoluciones y otros medios, en los que los ácidos nucleicos se encuentran in vivo o in vitro. Las composiciones de la invención son mezclas de los materiales de sílice gel de sílice y partículas de vidrio, particularmente microfibras de vidrio; tales mezclas combinadas con sales caotrópicas, tales como cloruro de guanidinio o tiocianato de guanidinio; y suspensiones de tales mezclas en disoluciones acuosas de sales caotrópicas. En los métodos de la invención, una disolución acuosa que comprende un ácido nucleico se mezcla con una disolución acuosa de sales caotrópicas y la disolución resultante se pone en contacto con una mezcla de materiales de sílice, después de lo cual el ácido nucleico de la disolución se une a los materiales de sílice. Las sales caotrópicas y los componentes distintos del ácido nucleico adsorbido sobre los materiales de sílice, de la disolución acuosa tratada por el método de la invención se lavan de los materiales de sílice. Finalmente, el ácido nucleico se puede obtener por elución de los materiales de sílice. Los métodos proporcionan ácido nucleico en agua o tampón, como tampón TE, libre de contaminación por cualquier sal o macromolécula que pudiera interferir con el procesamiento o análisis posterior.

El documento WO2007103485 se refiere a métodos, kits y composiciones para purificar moléculas de ARN pequeño. En particular, la presente invención proporciona métodos para purificar moléculas de ARN pequeño de una muestra que contiene tanto moléculas de ARN pequeño como moléculas de ARN más grande usando un agente de compactación y una matriz de unión a ARN, así como composiciones y kits para practicar tales métodos. En determinadas realizaciones, el agente de compactación comprende una pluralidad de moléculas de haluro de amina metálica.

Todos los métodos conocidos para el aislamiento de ARN pequeño de plantas u hongos se han desarrollado principalmente para ámbitos analíticos y no son adecuados para el aislamiento eficaz y seguro de moléculas de ARN pequeño seguras a partir de hongos y/o plantas que pueden usarse en la industria alimentaria. Por lo tanto, generalmente se emplean con pequeñas cantidades de tejidos (mg o gramos) y tienen como objetivo proporcionar el espectro completo de especies de ARN presentes en el tejido. Esto implica el uso de estrategias químicas y físicas para prevenir la degradación mediada por ARNasa de algunos tipos de ARN, más significativamente ARNm y otros ARNmc. Las estrategias utilizadas para prevenir la actividad de la ARNasa en la muestra incluyen el uso de agentes disolventes tóxicos (es decir, fenol), disolventes (cloroformo) o agentes caotrópicos (TFA, PCA y guanidina HCl). Todos estos métodos son engorrosos y no se pueden escalar o industrializar debido a la necesidad de separación de fases, centrifugación y/o el uso (y eliminación) de reactivos o disolventes costosos o tóxicos. En vista de la actividad inmunomoduladora no dependiente de secuencia de especies de ARNp recientemente demostrada (Plant microRNAs as novel immunomodulatory agents, Sci. Rep., 2016, 6:25761, Cavalieri et al.), existe la necesidad de perfeccionar un método para la extracción y aislamiento de ARNp a partir de grandes cantidades de tejidos de plantas u hongos y que esté diseñado para obtener la máxima extracción, particularmente de las especies de ARNbc (20-60 pb de longitud) que son responsables de la actividad inmunomoduladora del ARNp (Plant microRNAs as novel immunomodulatory agents, Sci. Rep., 2016, 6:25761, Cavalieri et al.). Además, dicho método no debería implicar el uso de disolventes tóxicos o costosos e idealmente no debe contener etapas técnicas complejas (es decir, centrifugación a alta velocidad) que lo hagan inadecuado o demasiado caro para su escalada.

Sumario de la invención

El método de aislamiento de una fracción enriquecida en moléculas de ARN pequeño (ARNp) a partir de una muestra fúngica o vegetal objeto de la presente invención permite obtener con éxito más de 100 mg de ARNp a partir de un kg de tejido vegetal o de hongo. El extracto de ARNp puede luego tratarse con ARNasas para eliminar selectivamente las especies de ARNmc y tratarse con una proteína que contiene un dominio de unión a ARNbc que reconoce selectivamente al ARNbc de entre 21 y 24 pb para purificar selectivamente las especies de ARNbc de 21 y 24 pares de bases. El extracto final se puede utilizar de forma segura como suplemento dietético o para la industria nutracéutica, farmacéutica o cosmecéutica.

Por tanto, un objeto de la invención es un método para aislar una fracción enriquecida en moléculas de ARN pequeño a partir de una muestra fúngica y/o vegetal que comprende:

a') incubar tejido o células de hongos y/o plantas con una disolución de bicarbonato de metal alcalino a una temperatura de 50-100 °C, separar el líquido de la fase sólida para obtener una fase líquida y

b) añadir una disolución de alcohol a la fase líquida obtenida en la etapa a') para obtener una disolución;

c) cargar la disolución obtenida en un soporte sólido capaz de unir moléculas de ARN pequeño;

d) eluir moléculas de ARN pequeño de dicho soporte sólido.

La disolución de bicarbonato es preferiblemente una disolución de bicarbonato de sodio diluida, más preferiblemente una disolución de NaHCO35-100 mM, incluso más preferiblemente NaHCO330 mM. Otras disoluciones de bicarbonato pueden ser bicarbonato de metal alcalino, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en bicarbonato de sodio, bicarbonato de potasio y mezclas de los mismos.

El método de la invención puede comprender además después de la etapa a'), una etapa a") en la que se descarta la fase líquida y se añade una disolución de bicarbonato diluida a una temperatura de 60-100 °C, y en el que la disolución de bicarbonato diluida es una disolución de NaHCO35-10 mM, preferiblemente una disolución de NaHCO38,75 mM, repitiéndose opcionalmente dicha etapa a”).

El líquido puede separarse de la fase sólida y luego someterse a la adición de isopropanol. La temperatura del bicarbonato diluido es preferiblemente de aproximadamente 95, 100 o 60 °C.

Antes de la etapa a'), el tejido o las células fúngicas y/o vegetales se incuban preferiblemente con una disolución diluida de bicarbonato a 0-10 °C, preferiblemente a 4 °C, en la que la disolución diluida de bicarbonato es una disolución de NaHCO35-10 mM, preferiblemente una disolución de NaHCO38,75 mM. La incubación puede durar de 10 a 20 h, preferiblemente 16 h. Luego se descarta la fase líquida. La planta o el tejido del hongo de partida pueden estar intactos o cortados en trozos grandes.

En el método según la invención, el alcohol es preferentemente isopropanol, etanol o cualquier alcohol capaz de reducir la actividad del agua y, por tanto, la solvatación de los ARNp y favorecer su unión al soporte sólido.

Más preferiblemente, la disolución de alcohol comprende isopropanol a una concentración final del 60 % en v/v.

Preferiblemente, las moléculas de ARN pequeño se eluyen del soporte sólido con agua libre de ARNasa.

En una realización preferida de la invención, las moléculas de ARN pequeño se eluyen del soporte sólido a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 100 °C, preferiblemente a 55 o 65 °C.

Preferiblemente, el soporte sólido es un soporte mineral o un soporte polimérico.

Más preferiblemente, el soporte mineral o el soporte polimérico es una columna que comprende sílice o gel de sílice o partículas de dióxido de silicio.

Más preferiblemente, el soporte mineral o polimérico es un conjunto de esferas fabricadas de un polímero absorbente, preferiblemente esferas de sílice.

El conjunto de esferas se recoge preferiblemente mediante centrifugación, filtración o captura magnética.

El método según la invención puede comprender además capturar las moléculas de ARN pequeño eluidas. En algunas realizaciones, por ejemplo, la muestra se filtra posteriormente después de pasar a través de una estructura de captura. La etapa de captura puede incluir filtración mediante un sistema impulsado por presión o un sistema basado en la gravedad (por ejemplo, centrifugación).

En otra realización, el método comprende además:

la etapa e) de eliminar selectivamente los ARNmc con un tratamiento con ARNasa de las moléculas de ARN pequeño eluidas y/o

la etapa f) de tratar las moléculas de ARN pequeño eluidas con un agente que se une con alta afinidad a los dúplex de ARNip de 21 -25 nt selectivamente, para enriquecer la fracción de ARNbc de 21 -24 pb. Preferiblemente, dicho agente es p19. En la etapa e) se puede utilizar ARNasa A o cualquier ARNasa capaz de degradar completamente el ARNmc.

Preferiblemente, las moléculas de ARN pequeño (y la fracción enriquecida de moléculas de ARN pequeño) incluyen miARN, ARNip, ARNnp, ARNonp y/o ARNt, más preferiblemente las moléculas de ARN pequeño constan como máximo de 100 nucleótidos, preferiblemente como máximo de 70 nucleótidos, o más preferiblemente como máximo 30 nucleótidos.

Las moléculas de ARN pequeño consisten preferiblemente en entre 21 y 24 nucleótidos, más preferiblemente entre 19 y 24 nucleótidos.

Dichas moléculas de ARN pequeño se encuentran preferiblemente en configuraciones monocatenarias y/o bicatenarias.

Dichas moléculas de ARN pequeño se caracterizan preferiblemente por la presencia de un grupo fosfato en los extremos 5' y/o un grupo metilo en los extremos 3'. Las moléculas de ARN pequeño son preferiblemente moléculas de miARN, miARN maduro y/o ARNip.

En la presente también se describen moléculas de ARN pequeño obtenidas por el método definido anteriormente y un alimento y/o aditivo alimentario y/o suplemento dietético y/o un producto nutracéutico que comprende las moléculas de ARN pequeño obtenibles con el método definido anteriormente, un método para producir un segundo alimento y/o un producto nutracéutico que comprende la adición a un primer alimento y/o producto nutracéutico de las moléculas de ARN pequeño obtenidas mediante el anterior método de la invención.

En la presente se describe también una composición farmacéutica o cosmética que comprende las moléculas de ARN pequeño que se pueden obtener con el método definido anteriormente.

La composición farmacéutica o cosmética como se definió anteriormente, el alimento y/o aditivo alimentario y/o suplemento dietético y/o un producto nutracéutico como se definió anteriormente, comprenden preferiblemente: a) lípidos, más preferiblemente al menos un liposoma, b) un exosoma, c) una nanopartícula polimérica, más preferiblemente una partícula basada en quitosano, o d) una partícula de p1,3-D-glucano.

El método anterior según la invención también se define en la presente como "método de extracción MRG". Por tanto, el presente método permite obtener una fracción enriquecida en moléculas de ARN pequeño (ARNp).

En el contexto de la presente invención, los ARNp comprenden ARN bicatenarios y/o monocatenarios y/o ARN monocatenarios con alineación parcial.

En el contexto de la presente invención, "fracción" significa, por ejemplo, una muestra, un extracto, un eluido.

En el contexto de la presente invención, el término "hongo" o "fúngico" comprende los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como el Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como se define en Hawksworth et al., en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Las células fúngicas pueden ser cualquier célula fúngica, es decir, cualquier célula presente dentro o derivada de un organismo que pertenece al reino Fungi. Los métodos de la invención son aplicables a todos los hongos y células fúngicas. En una realización de la invención, el hongo puede ser un moho, o más particularmente un hongo filamentoso. En otras realizaciones de la invención, el hongo puede ser una levadura (por ejemplo, Saccharomices o Pichia), o Aspergillus, Rhizopus, Neurospora. En una realización, el hongo puede ser un hongo ascomiceto, es decir, un hongo que pertenece al filo Ascomycota.

En realizaciones preferidas, pero no limitantes, de la invención, el hongo se elige del grupo que consiste en hongos comestibles: Agaricus bisporus y hongos de los géneros Agrocybe, Amanita, Armillaria, Artomyces, Astraeus, Aureoboletus, Auricularia, Boletus, Bovista, Butyriboletus, Calbovista, Calocybe, Calvatia, Lactarius camphoratus, Cantharellula, Cantharellus, Chalciporus, Chanterelle, Chroogomphus, Clavaria, Clavaríadelphus, Clavulina, Clitocybe, Clitopilus, Coprinellus, Coprinopsis, Coprinus, Ustilago maydis, Cortinarius, Craterellus, Cyanoboletus, Cystoderma, Cystodermella, Dacryopinax, Disciotis, Entoloma, Eritadenine, Exsudoporus, Fistulina, Floccularia, Geopora, Gliophorus, Gomphidius, Gomphus, Goossensia, Grifola, Guepinia, Gymnopus, Gyromitra, Gyroporus, Handkea, Harrya, Helvella, Hemileccinum, Hericium, Hydnum, Higrocybe, Higrophorus, Hypomyces, Hypsizygus, Imleria, Infundibulicybe, Laccaria, Laccocephalum, Lactarius, Lactifluus, Laetiporus, Lanmaoa, Leccinellum, Leccinum, Lentinula, Lepista, Leucopholiota, Lobaria, Lycoperdon, Mackintoshia, Marasmius, Melanoleuca, Meripilus, Morchella, Mycenastrum, Penicillium, Phallus, Phylloporus, Pleurocybella, Pleurotus, Pluteus, Polyozellus, Psathyrella, Pseudohydnum, Ramaria, Ramariopsis, Rhizopogon, Rhodocybe, Russula, Saccharomyces, Sarcodon, Sarcosphaera, Sparassis, Strobilurus, Stropharia, Suillellus, Suillus, Termitomyces, Tremella, Tricholoma, Tylopilus Verpa, Volvariella, Volvopluteus, Xerocomellus, Xerocomus, Xeromphalina.

En el contexto de la presente invención, el término "hongo" o "seta" son términos intercambiables.

La expresión "célula fúngica" abarca células fúngicas de todos los tipos y en todas las etapas de desarrollo, incluidas las células reproductoras especializadas como las esporas sexuales y asexuales. Como se usa en este documento, la célula fúngica abarca el hongo como tal y también otras formas de vida del hongo, tales como haustorios, conidios, micelio, pico de penetración, esporas, zoosporas, etc.

En el contexto de la presente invención, el término "planta" abarca cualquier miembro del reino vegetal según la definición de Linneo. Los ejemplos de plantas son plantas incluidas en los géneros Arabidopsis, como, por ejemplo, Arabidopsis thaliana, o Phaseolus, como, por ejemplo, Phaseolus vulgaris, o Nicotiana, como, por ejemplo, Nicotiana tabacum, o Glycine, como, por ejemplo, Glycine max, o Gossypium, como, por ejemplo, Gossypium arboreum, o Brassica, como, por ejemplo, Brassica napus, o Vitis, como, por ejemplo, Vitis vinifera, o Beta, como, por ejemplo, Beta vulgaris, o Triticum, como, por ejemplo, Triticum aestivum, o Solanum, como, por ejemplo, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum y Solanum melongena L., o Musa, como, por ejemplo, Musa acuminata y Musa balbisiana, o Fragaria, como, por ejemplo, Fragaria vesca, Fragaria viridis y Fragaria moschata, u Oryza, como, por ejemplo, Oryza sativa, u Hordeum, como, por ejemplo, Hordeum vulgare, u Olea, como, por ejemplo, Olea europaea, o Malus, como, por ejemplo, Malus domestica, o Allium, por ejemplo, Alluim cepa, o Pisum, por ejemplo, Pisum sativum, o Mentha o Cuminum, por ejemplo, Cuminum cyminum. El término planta también comprende liquenes y algas y frutos y cualquier parte de la planta.

La muestra fúngica o de planta se puede homogeneizar o fraccionar, por ejemplo, triturándola para formar un polvo fino. Los expertos en la técnica sabrán lo que significa un polvo fino.

La muestra de la planta puede comprender cotiledones, hojas (frescas o secas), brotes, raíces, flores, bulbos, semillas y/o frutos.

En la presente invención, la fracción enriquecida en moléculas de ARN pequeño puede comprender ARNp y otras moléculas de ARN.

El polvo se mezcla con un tampón de lisis (LB) para liberar el ARNp de las células fúngicas o vegetales. El LB se precalienta preferiblemente a una temperatura de 30 a 70 °C, más preferiblemente a aproximadamente 55 °C.

El tampón de lisis puede comprender un tampón Tris HCl o cualquier otro tampón adecuado, con un intervalo de concentración de 10-100 mM y un intervalo de pH de 7-9,5. Preferiblemente, el pH del LB es de 8,5. El tampón de lisis puede comprender NaCl o cualquier otro agente caotrópico adecuado, en un intervalo de concentración de 100-500 mM, preferiblemente de 0,2 M.

El tampón de lisis puede comprender EDTA o cualquier otro agente quelante adecuado, en un intervalo de concentración de 5 a 50 mM, preferiblemente de 10 o 20 mM.

El tampón de lisis puede comprender SDS o cualquier otro tensioactivo aniónico adecuado, en un intervalo de concentración del 0,5 % al 10 %, preferiblemente del 2 %.

En otra realización, el tampón de lisis puede ser una disolución 0,3 M de bicarbonato de sodio. Cuando se utiliza tejido fresco (triturado en nitrógeno líquido), la proporción entre el peso del polvo (FW (“fresh weight”, peso fresco)) y LB puede estar en el intervalo de 1:1 a 1:5. En el caso de tejido liofilizado (que luego se muele), la proporción entre DW (“dry weight”, peso seco) y LB puede estar en el intervalo de 1:5 a 1:25.

La incubación con LB se puede realizar a una temperatura de 20-60 °C, preferiblemente a TA. Preferiblemente, la incubación se realiza mediante mezclado. La incubación se lleva a cabo preferiblemente durante 5-15 minutos, más preferiblemente 10 minutos.

Después de la incubación con LB, la fase líquida puede separarse y descartarse la fase sólida. Puede añadirse carbón activado a la fase líquida resultante. Preferiblemente, el carbón activado está a una concentración de 10-20 mg/ml, más preferiblemente 30 mg/ml. A continuación, la disolución se puede mezclar durante 5-15 minutos, preferiblemente 10 minutos. A continuación, se eliminan el carbón y otras partículas, por ejemplo, por filtración.

Se añade, mezcla o incuba una disolución de alcohol con la disolución en las formas de realización de la invención. Una disolución de alcohol comprende al menos un alcohol. La disolución de alcohol puede ser de aproximadamente, ser de al menos aproximadamente, o ser como máximo de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 % de alcohol, o cualquier intervalo de las mismas. En ciertas realizaciones, se agrega a un polvo para hacer que la disolución final tenga una concentración de alcohol de aproximadamente, al menos aproximadamente o aproximadamente como máximo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ,40 , 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76,77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, o 90 %, o cualquier intervalo de las mismas. En realizaciones específicas, la cantidad de disolución de alcohol añadida al polvo le otorga una concentración de alcohol del 60 %. Los alcoholes incluyen, pero no se limitan a etanol, propanol, isopropanol y metanol, con isopropanol como preferido. También se puede usar una disolución de alcohol en etapas adicionales de los métodos de la invención para precipitar el ARN.

El isopropanol se añade preferiblemente a una concentración del 100 %.

La purificación del ARN pequeño de la disolución incluye el uso de un soporte sólido, como un soporte mineral o polimérico.

Como aspecto fundamental según la invención es el uso de un soporte sólido de unión de ácido nucleico (NA, “nucleic acid”), por ejemplo, partículas de sílice capaces de unirse al NA en presencia de una sustancia caotrópica. Por sílice se entienden cristales de SiO2 y otras formas de óxido de silicio, tales como esqueletos de diatomeas construidos a partir de SiO2, óxido de silicio amorfo y polvo de vidrio. También el alquilsílice, el silicato de aluminio (zeolita), el sílice activada con -NH2, las partículas de látex, ciertos materiales poliméricos que forman la pared interior de una cubeta o una placa de microtitulación, o materiales de filtro, por ejemplo, que consisten en nitrocelulosa, son adecuados como fase sólida de unión a ácidos nucleicos según a la invención.

Un "soporte sólido" o "soporte" se refiere a una estructura física que contiene un material que entra en contacto con la disolución y que no reacciona irreversiblemente a las macromoléculas en la disolución, particularmente con moléculas de ARN pequeño. En realizaciones particulares, el soporte sólido se une a moléculas de ARN pequeño; en casos adicionales, se une a moléculas de ARN pequeño, pero no se une a uno o más tipos distintos de macromoléculas en la muestra. El material en el soporte sólido puede incluir un mineral o polímero, en cuyo caso el soporte se denomina "soporte mineral o polimérico". Los soportes minerales o poliméricos incluyen soportes que incluyen sílice. Los soportes incluyen, entre otros, cuentas, columnas y filtros. En realizaciones adicionales, el soporte mineral o polimérico es un filtro o columna de sílice.

En una realización preferida, se añaden esferas de sílice magnética a la disolución, preferiblemente a una concentración de 1 a 5 mg/ml, más preferiblemente a una concentración de 2,5 mg/ml.

En una realización más preferida, las esferas de sílice magnética son sílice MagPrep básico [Merck Millipore], que tiene un diámetro de aproximadamente 1 |um, una composición de > 95 % de magnetita, un superficie específica de 16-22 m2/mg, una capacidad de unión de > 10 |ug de ADN o ARN por mg.

La incubación con esferas de sílice preferiblemente dura 10 minutos y se realiza mediante agitación suave. A continuación, las esferas magnéticas se capturan preferiblemente con un imán y el líquido se rechaza.

En una realización alternativa, la disolución se vierte a través de un filtro, preferiblemente un filtro de muselina, en una columna Perspex que comprende gel de sílice, preferiblemente a una concentración de 1,5 g/g de DW de tejido.

En particular, se resuspendió sílice amorfa Sigma 274739 (malla 50-70) con HCl al 10 % y se dejó reposar durante 24 h. El sobrenadante se aspiró y se descartó. El sedimento se resuspendió con 6 ml de HCl 0,1 M y luego se dividió en partes alícuotas y se conservó a 4 °C.

En una realización preferida, después de la adición de isopropanol, la fase líquida se vierte en una columna que contiene esferas de dióxido de silicio de 1 -5 |um de diámetro, preferiblemente a 5 mg/g de tejido. En una realización alternativa, se añaden esferas de dióxido de silicio de 1-5 |um de diámetro, preferiblemente a 100 mg/g de tejido, después de la adición de isopropanol, y preferiblemente se agitan durante 5-15 minutos, preferiblemente durante 10 minutos.

A continuación, se puede eliminar la fase líquida.

Como alternativa, en algunas realizaciones, el soporte mineral o polimérico puede incluir polímeros o no polímeros con grupos electronegativos. En algunas realizaciones, el material es o tiene poliacrilato, poliestireno, látex, poliacrilonitrilo, poli(cloruro de vinilo), metacrilato y/o metacrilato de metilo.

Después de aplicar o mezclar una disolución con un soporte sólido, el material puede lavarse con una disolución. En algunas realizaciones, un soporte mineral o polimérico se lava con una primera disolución de lavado que comprende alcohol, después de aplicar el lisado al soporte mineral o polimérico. Los métodos de la invención pueden implicar 1, 2, 3, 4, 5 o más lavados con la disolución de lavado. La disolución de lavado utilizada cuando se aplica más de un lavado puede ser la misma o diferente. En general, se entiende que las moléculas que atraviesan el material en un ciclo de lavado se descartan.

En una realización preferida, las esferas o columnas se lavan tres veces con una disolución de etanol al 80 % o al 85 %.

En una realización alternativa, la columna se lava con 10 volúmenes de una disolución de etanol al 80 %. A continuación, las esferas o la columna se secan preferiblemente para eliminar el etanol residual.

En otros métodos de la invención, las moléculas de ARN deseadas se eluyen del soporte sólido. En determinadas realizaciones, las moléculas de ARN pequeño se eluyen de un soporte sólido, tal como un soporte mineral o polimérico, a una temperatura de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 100 °C. Se contempla que la temperatura a la que se eluyen las moléculas de ARN es de aproximadamente o de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 °C o más, o cualquier intervalo de las mismas.

Las moléculas pueden eluirse con cualquier disolución de elución. En algunas realizaciones, la disolución de elución es una disolución iónica, es decir, incluye iones. En realizaciones particulares, la disolución de elución incluye hasta 10 mM de sal. Se contempla que tenga aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 0,1, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mM de sal. En determinadas realizaciones, la sal consiste en una combinación de Li+, Na+, K+ o NH4+ como catión, y Cl-, Br, I-, etilendiaminotetraacetato o citrato como anión.

En una realización preferida del método de la invención, el ARNp se eluye con agua libre de ARNasa, más preferiblemente a una temperatura de 65 °C. El intervalo de volumen del agua para las esferas es de 60 a 200 uL/mg de esferas (0,6-2:1 en v/p). Para el gel de sílice, el intervalo de volumen es de 1-5 ml/g de resina (1-5:1 en v/p). En una realización preferida, se usa agua a una concentración de 1 volumen o de 125 pl/mg de esferas.

Cuando la descripción se refiere a realizaciones relacionadas con ARNp o a compuestos que los contienen, tales realizaciones deben entenderse como ilustrativas únicamente y de ninguna manera definen la invención en sí.

Las moléculas de ARNp obtenidas mediante el presente método pueden usarse en el campo alimentario o nutracéutico. Los productos alimentarios o alimentos que pueden incluir dichas moléculas de ARNp son, por ejemplo, bebidas, por ejemplo, bebidas deportivas, zumos de frutas y bebidas alcohólicas, así como preparaciones líquidas para añadir al agua potable y alimentos líquidos. En otra realización, los productos alimentarios o composiciones alimentarias comprenden alimentos sólidos o semisólidos, por ejemplo, productos horneados, budines, productos lácteos, dulces, aperitivos o dulces congelados o artículos de novedad (por ejemplo, helados, batidos de leche), comidas congeladas preparadas, caramelos, tentempiés (por ejemplo, patatas fritas), alimentos líquidos como sopas, pastas para untar, salsas, aderezos para ensaladas, productos cárnicos preparados, queso, yogur y cualquier otro alimento que contenga grasa o aceite, e ingredientes alimentarios (por ejemplo, harina de trigo). La expresión productos alimentarios o composiciones alimentarias también incluye alimentos funcionales y productos alimentarios preparados, refiriéndose estos últimos a cualquier alimento preenvasado aprobado para el consumo humano.

Los productos alimentarios o composiciones alimentarias resultantes contienen una cantidad y/o concentración aumentada de moléculas de ARNp de plantas o hongos en comparación con los productos alimentarios o composiciones alimentarias sin la adición de dicho aditivo alimentario.

En una realización preferida, dichos productos alimentarios o composiciones alimentarias contienen una cantidad de ARNp o moléculas de ARNp de plantas o hongos que es al menos 10 % mayor que la cantidad en el producto alimentario o composición alimentaria sin la adición de dicho aditivo alimentario que comprende moléculas de ARNp, más preferiblemente la cantidad es al menos 20 %, 50 %, 100 % o 200 % mayor que en el producto alimentario o la composición alimentaria sin la adición de dicho aditivo alimentario.

Las composiciones alimentarias y los suplementos dietéticos se administran preferiblemente por vía oral. Los suplementos dietéticos se pueden administrar en cualquier formato adecuado, preferiblemente para la administración oral. Los ingredientes del suplemento dietético de esta invención son excipientes y/o vehículos aceptables para el consumo oral. El vehículo puede ser un líquido, gel, cápsula de gel, cápsula, polvo, comprimido sólido (recubierto o no recubierto), té o similar.

En otras realizaciones, el suplemento dietético se proporciona en forma de polvo o líquido adecuado para que el consumidor lo añada a un alimento o bebida. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el suplemento dietético se puede administrar a un individuo en forma de polvo, por ejemplo, para usar mezclándolo en una bebida, o revolviendo en un alimento semisólido, o agregándolo de otra manera a un alimento, por ejemplo, contenido en tapas de envases de alimentos o bebidas para su liberación inmediatamente antes del consumo.

La dosificación de la composición que comprende moléculas de ARNp de la invención como aditivo alimentario varía dependiendo de factores conocidos, tales como su modo y vía de administración; la edad, salud y peso del receptor; la naturaleza y grado de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; y el efecto deseado que puede ser determinado por los expertos en la materia con ensayos normales. Típicamente, las cantidades de dosificación de las moléculas de ARNp de plantas o hongos pueden variar desde 10-20 mg de moléculas de ARNp por aplicación hasta 1-2 mg de moléculas de ARNp para un uso/aplicación diario.

El suplemento dietético se puede administrar como una dosis única o en dosis múltiples.

Las vías de administración adecuadas de la composición farmacéutica de la invención incluyen, por ejemplo, administración oral, intranasal y parenteral.

La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar en forma de una unidad de dosificación, por ejemplo, comprimidos o cápsulas, o una disolución.

Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia convencional en este campo. La composición farmacéutica puede comprender además aditivos y adyuvantes, excipientes o diluyentes farmacéuticos convencionales, que incluyen, entre otros, agua, gelatina de cualquier origen, gomas vegetales, ligninsulfonato, talco, azúcares, almidón, goma arábiga, aceites vegetales, polialquilenglicoles, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizantes, agentes emulgentes, tampones, lubricantes, colorantes, agentes humectantes, cargas y similares.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar como una dosis única o en dosis múltiples.

Las composiciones según la presente invención pueden estar en cualquier forma galénica que sea adecuada para administrar al cuerpo animal, incluido el cuerpo humano, más en particular en cualquier forma que sea convencional para la administración oral, por ejemplo, en forma sólida, por ejemplo comprimidos, píldoras, gránulos, grageas, cápsulas y formulaciones efervescentes, tales como polvos y comprimidos, o en forma líquida, por ejemplo, en forma de disoluciones, emulsiones o suspensiones, por ejemplo como pastas y suspensiones oleosas. Las pastas se pueden introducir en cápsulas de cubierta dura o blanda, por lo que las cápsulas presentan, por ejemplo, una matriz de gelatina (de pescado, porcina, de aves de corral, de vaca), proteínas vegetales o sulfonato de lignina. Los ejemplos de otras formas de aplicación son formas de administración transdérmica, parenteral, tópica o inyectable. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de formulaciones de liberación controlada (retrasada). Una formulación tópica puede contener por ejemplo, ungüentos, cremas, geles, lociones, disoluciones. En la presente invención, la expresión “cantidad eficaz" significará una cantidad que logre un efecto deseado o efecto terapéutico, tal como lo entienden los expertos en la técnica. Para la inyección, que incluye, sin limitación, la inyección intravenosa, intramuscular y subcutánea, los compuestos de la invención pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como tampón de disolución salina fisiológica o disolventes polares que incluyen, sin limitación, una pirrolidona o dimetilsulfóxido.

Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis. Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de una forma soluble en agua, tales como, sin limitación, una sal del compuesto activo. Además, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos en un vehículo lipófilo. Los vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo y triglicéridos, o materiales tales como liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores y/o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstituir con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Para la administración oral, los compuestos se pueden formular combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten formular los compuestos de la invención como comprimidos, píldoras, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones espesas, disoluciones, suspensiones, disoluciones concentradas y suspensiones para diluir en el agua que bebe un paciente, premezclas para diluir en los alimentos de un paciente y similares, para la ingestión oral por parte de un paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden preparar usando un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir otros auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes útiles son, en particular, cargas, tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de patata y otros materiales como gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico. También se puede utilizar una sal, tal como el alginato de sodio.

Para la administración por inhalación, las moléculas de ARNp de la presente invención pueden administrarse convenientemente en forma de aerosol usando un paquete presurizado o un nebulizador y un propelente adecuado. Las moléculas de ARNp también se pueden formular en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases para supositorios convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, las moléculas de ARNp también se pueden formular como preparaciones de depósito de liberación lenta (“depot”). Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. Los compuestos de esta invención pueden formularse para esta vía de administración con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en una emulsión con un aceite farmacológicamente aceptable), con resinas de intercambio iónico, o como un derivado escasamente soluble, tal como, sin limitación, una sal poco soluble. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción de este documento.

La administración de tales moléculas de ARNp puede producirse mediante la formación de un complejo de la secuencia con un sistema de transporte adecuado, como la formación de un complejo con liposomas catiónicos o la inclusión en nanovesículas. A continuación, el sistema de transporte puede formularse para la administración oral (incluida la sublingual) como suplemento dietético o directamente integrado en la matriz de alimentos o bebidas para un uso regular. Las dosis diarias pueden estar en el intervalo de 1-5 mg de principio activo.

El sistema de transporte puede formularse para la administración tópica. Las dosis diarias pueden estar en el intervalo de 1-5 mg de principio activo.

El sistema de transporte puede formularse para la administración intravenosa con dosis superiores a 10 mg de principio activo.

Los ARNp definidos anteriormente de 15-60 pb de longitud extraídos de plantas o hongos pueden funcionalizarse para mejorar su biodisponibilidad y eficacia antiinflamatoria.

Cuando las verduras de la dieta se consumen a través de la dieta, una pequeña fracción de los microARN originalmente presentes en la matriz alimentaria pasa a través del tracto GI y se hace disponible en la corriente sanguínea (0,05 % -0,5 %).

Dicha biodisponibilidad reducida limita la eficacia antiinflamatoria hacia las células y órganos humanos de los miARN y ARNp absorbidos naturalmente a través de la dieta.

Además, los miARN desnudos o ARNp de la dieta biodisponibles pueden estar sujetos a degradación o modificación estructural dentro de la corriente sanguínea con la consiguiente pérdida de bioactividad.

Los inventores han descubierto que la formación de complejos de ARNp de 15-60 pb extraídos de plantas u hongos con liposomas, exosomas o nanopartículas permite su absorción eficaz por las células dendríticas del sistema inmunitario humano.

Además, la formación de complejos de dichos compuestos bioactivos conservará la integridad y reducirá la degradación en caso de:

° consumo oral: durante la masticación y paso por el tracto GI.

° aplicación tópica: durante la aplicación sobre la superficie de la piel y la penetración en la dermis

° aplicación intravenosa: para el movimiento dentro de la corriente sanguínea y la transferencia a las células y órganos receptores

En caso de consumo oral o aplicación tópica, la formación de complejos también facilitará su transferencia hacia la corriente sanguínea.

La formación de complejos con liposomas catiónicos se produce naturalmente por interacción físico-química. Los ARNp están cargados negativamente en disolución.

En una realización preferida, los ARNp descritos anteriormente se proporcionan dentro de un vehículo de transporte, en el que opcionalmente el vehículo de transporte se selecciona de liposomas, particularmente liposomas catiónicos, liposomas que comprenden lípidos o nanovesículas. Hay muchos métodos disponibles para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), y las patentes de EE. UU.

4.235.871,4.501.728, 4.837.028, y 5.019.369.

En una realización de la invención, al menos parte de los lípidos de los liposomas se seleccionan del grupo que consiste en fosfolípidos, esteroles y derivados de esteroles.

En una realización particular de la invención, el lípido de los liposomas comprende o constituye un miembro seleccionado del grupo que consiste en fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilinositol (PI), fosfatídico ácido (PA), DPG (bisfosfatidilglicerol), PEOH (alcohol fosfatidílico), colesterol, ergosterol y lanosterol.

En una realización adicional, el liposoma comprende fosfatidilcolinas seleccionadas del grupo que consiste en 1,2-dioleoil-fosfatidilcolina, 1,2-dipalmitoil-fosfatidilcolina, 1,2-dimiristoil-fosfatidilcolina, 1,2-diestearoil-fosfatidilcolina, 1 -oleoil -2-palmitoil-fosfatidilcolina, 1 -oleoil-2-estearoil-fosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina y 1-estearoil-2oleoil-fosfatidilcolina.

En una realización de la invención, el liposoma comprende fosfatidiletanolaminas seleccionadas del grupo que consiste en 1,2-dioleoil-fosfatidiletanolamina, 1,2-dipalmitoil-fosfatidiletanolamina, 1,2-dimiristoil-fosfatidiletanolamina, 1,2-diestearoil-fosfatidiletanolamina, 1 -oleoil-2-palmitoil-fosfatidiletanolamina, 1 -oleoil-2-estearoil-fosfatidiletanolamina, 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina, 1 -estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina y N-succinil-dioleoilfosfatidiletanolamina; las fosfatidilserinas se seleccionan del grupo que consiste en 1,2-dioleoil-fosfatidilserina, 1,2-dipalmitoil-fosfatidilserina, 1,2-dimiristoil-fosfatidilserina, 1,2-diestearoil-fosfatidilserina, 1 -oleoil-2-palmitoilfosfatidilserina, 1-oleoil-2-estearoil-fosfatidilserina, 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidilserina y 1-estearoil-2-oleoilfosfatidilserina; los fosfatidilgliceroles se seleccionan del grupo que consiste en 1,2-dioleoil-fosfatidilglicerol, 1,2-dipalmitoil-fosfatidilglicerol, 1,2-dimiristoil-fosfatidilglicerol, 1,2-diestearoil-fosfatidilglicerol, 1 -oleoil-2-palmitoilfosfatidilglicerol, 1 -olieoil-2-estearoil-fosfatidilglicerol, 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol y 1-estearoil-2-oleoilfosfatidilglicerol; los ácidos fosfatídicos se seleccionan del grupo que consiste en ácido di-palmitoil-glicerofosfatídico, ácido di-estearoil-glicerofosfatídico, ácido di-mirostoil-glicerofosfatídico, ácido di-oleoil-glicerofosfatídico, ácido palmitoil-oleoil-glicerofosfatídico.

En otra realización del liposoma de la invención, el lípido comprende o constituye fosfatidilglicerol (PG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA), DPG (bisfosfatidil glicerol), PEOH (alcohol fosfatidílico), colesterol, fosfatidilcolinas tales como 1,2-dioleoil-fosfatidilcolina, 1.2- dipalmitoil-fosfatidilcolina, 1,2-dimiristoil-fosfatidilcolina, 1,2-diestearoil-fosfatidilcolina, 1 -oleoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1 -oleoil-2-estearoil-fosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina y 1-estearoil-2-oleoilfosfatidilcolina; fosfatidiletanolaminas tales como 1,2-dioleoil-fosfatidiletanolamina, 1,2-dipalmitoilfosfatidiletanolamina, 1,2-dimiristoil-fosfatidiletanolamina, 1,2-diestearoil-fosfatidiletanolamina, 1 -oleil-2-palmitoilfosfatidlietanolamina, 1 -oleil-2-estearoil-fosfatidiletanolamina, 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina, 1 -estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina y N-succinil-dioleoil-fosfatidiletanolamina; fosfatidilserinas, tales como 1,2-dioleoilfosfatidilserina, 1,2-dipalmitoil-fosfatidilserina, 1,2-dimiristoil-fosfatidilserina, 1,2-diestearoil-fosfatidilserina, 1 -oleoil-2-palmitoil-fosfatidilserina, 1 -oleoil-2-estearoil-fosfatidilserina, 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidilserina y 1 -estearoil-2-oleoilfosfatidilserina; fosfatidilgliceroles, tales como 1,2-dioleoil-fosfatidilglicerol, 1,2-dipalmitoil-fosfatidilglicerol, 1,2-dimiristoil-fosfatidilglicerol, 1,2-diestearoil-fosfatidilglicerol, 1 -oleoil-2-palmitoil-gliceril-fosfatidilglicerol, 1,2-diestearoilfosfatidilglicerol, 1 -oleoil-2-palmotoil-fosfatidilglicerol, 1 -oleoil-2-estearoil-fosfatidilglicerol, 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatidilglicerol y 1 -estearoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol; 1,2-dioctadecanoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Ethyl PC); lípidos pegilados; fosfolípidos pegilados, tales como fosfatidiletanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-1000], fosfatidiletanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000], fosfatidiletanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-3000], fosfatidiletanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000]; ceramidas pegiladas, tales como N-octanoil-esfingosina-1-{succinil[metoxi(polietilenglicol)1000]}, N-octanoil-esfingosina-1 -{succinil [metoxi(polietilenglicol)2000]}, N-octanoilesfingosina-1-{succinil[metoxi(polietilenglicol)3000]}, N-octanoil-esfingosina-1-{succinil[metoxi(polietilenglicol)5000]}; liso-fosfatidilcolinas, liso-fosfatidiletanolaminas, liso-fosfatidilgliceroles, liso-fosfatidilserinas, ceramidas; esfingolípidos; glicolípidos, tales como gangliósido GMI; glucolípidos; sulfatidas; ácido fosfatídico, tal como ácido di-palmitoilglicerofosfatídico; ácidos grasos palmíticos; ácidos grasos esteáricos; ácidos grasos araquidónicos; ácidos grasos láuricos; ácidos grasos mirísticos; ácidos grasos lauroleicos; ácidos grasos fisetéricos; ácidos grasos miristoleicos; ácidos grasos palmitoleicos; ácidos grasos petroselínicos; ácidos grasos oleicos; ácidos grasos isolauricos; ácidos grasos isomirísticos; ácidos grasos isoesteáricos; esterol y derivados de esterol, tales como colesterol, hemisuccinato de colesterol, sulfato de colesterol y colesteril-(4-trimetilamonio)-butanoato, ergosterol, lanosterol; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno y alcoholes de ácidos grasos de polioxietileno; éteres de alcohol de ácidos grasos de polioxietileno; ésteres de ácidos grasos de sorbitano polioxietilados, oxiestearato de glicerol polietilenglicol; ricinoleato de glicerol polietilenglicol; esteroles de soja etoxilados; aceite de ricino etoxilado; polímeros de ácidos grasos de polioxietileno y polioxipropileno; estearatos de ácidos grasos de polioxietileno; di-oleoil-sn-glicerol; dipalmitoilsuccinilglicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol; 1 -alquil-2-acil-fosfatidilcolinas, tales como 1-hexadecil-2-palmitoilfosfatidilcolina; 1-alquil-2-acil-fosfatidiletanolaminas, tales como 1-hexadecil-2-palmitoil-fosfatidiletanolamina; 1-alquil-2-acil-fosfatidilserinas, tales como 1-hexadecil-2-palmitoil-fosfatidilserina; 1 -alquil-2-acil-fosfatidilgliceroles, tales como 1 -hexadecil-2-palmitoil-fosfatidilglicerol; 1 -alquil-2-alquil-fosfatidilcolinas, tales como 1-hexadecil-2-hexadecilfosfatidilcolina; 1-alquil-2-alquil-fosfatidiletanolaminas, tales como 1-hexadecil-2-hexadecil-fosfatidiletanolamina; 1-alquil-2-alquil-fosfatidilserinas, tales como 1 -hexadecil-2-hexadecil-fosfatidilserina; 1 -alquil-2-alquil-fosfatidilgliceroles, tales como 1-hexadecil-2-hexadecil-fosfatidilglicerol; y N-succinil-dioctadecilamina; palmitoilhomocisteína.

Una realización de la invención es un liposoma, en el que al menos parte de los lípidos es un lípido catiónico. Una realización de la invención es un liposoma, en el que los lípidos catiónicos se seleccionan del grupo que consiste en estearilamina (SA), bromuro de lauriltrimetilamonio; bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de miristiltrimetilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil] colesterol (DC-colesterol), 1.2- ditetradecanoil-3-trimetilamonio-propano (DMTAP), 1,2-dioctadecanoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) y derivados de DOTAP, tales como 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-3-trimetilamonio-propano y 1,2-dihexadecanoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-3-dimetilamonio-propano (DODAP) y derivados de DODAP, tales como 1,2-ditetradecanoil-3-dimetilamonio-propano, 1,2-dihexadecanoil-3-dimetilamonio-propano, y 1,2-dioctadecanoil-3-dimetilamonio-propano, 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA), 1,2-dioleoil-c-(4’-trimetilamonio)-butanoil-sn-glicerol (DOTB), dioctadecilamida-glicilespermina, SAINT-2, lípido policatiónico trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2-(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA) y GL67TM.

Una realización particular de la invención es un liposoma, en el que los lípidos catiónicos se seleccionan del grupo que consiste en estearilamina (SA), 1,2-dioctadecanoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) y 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-3-dimetilamonio-propano (DODAP), preferiblemente 1,2-dioctadecanoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).

Los lípidos catiónicos preferidos son DOTAP y derivados de DOTAP. Se pueden encontrar ejemplos adicionales de lípidos catiónicos y componentes lipídicos en la patente de EE. UU. n.° 4.804.539, o pueden prepararse según esta patente.

Una realización de la invención es un liposoma, en el que al menos parte de los lípidos son un lipopéptido catiónico seleccionado del grupo que consiste en un conjugado de poliarginina y lípido, un conjugado de TAT y lípido, un conjugado de polilisina y lípido, o un liposacárido o lipopolisacárido catiónico, tal como conjugado de lípido y quitosano.

En una realización preferida, los lípidos son capaces de formar un liposoma. En particular, los lípidos catiónicos son adecuados para este propósito.

Los lípidos catiónicos incluyen preferiblemente DOTAP, DOPE, DC-Chol/DOPE, DOTMA y DOTMA/DOPE.

Lípidos catiónicos: los lípidos catiónicos tienen una carga neta positiva a aproximadamente pH fisiológico. Los lípidos catiónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio ("DODAC"); cloruro de N-(2,3-dioleiloxil)propil-N,N-N-trietilamonio ("DOTMA"); bromuro de N,N-diestearil-N, N-dimetilamonio ("DDAB"); cloruro de N-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio ("DOTAP"); sal cloruro de 1,2-dioleiloxi-3-trimetilaminopropano ("DOTAP.Cl"); 3p-(N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol ("DC-Chol"), trifluoroacetato de N-(1-(2,3-dioleiloxil)propil)-N-2-(esperminacarboxamido)etil)-N,N-dimetilamonio ("DOSPA"), dioctadecilamidoglicilcarboxiespermina ("DOGS"), 1,2-dileoil-sn-3-fosfoetanolamina ("DOPE"), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano ("DODAP"), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi-propilamina ("DODMA") y bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio ("DMRIE"). Además, se pueden usar varias preparaciones comerciales de lípidos catiónicos, tales como, por ejemplo, LIPOFECTIN (que incluye DOTMA y DOPE, disponible de GIBCO/BRL) y LIPOFECTAMIn E (que comprende d Os Pa y DOPE, disponible de GIBCO/BRL). En realizaciones particulares, un lípido catiónico es un aminolípido. Otros lípidos catiónicos incluyen 1,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLinDMA) 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1-linoleoil-2-linoeiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA).

Una forma de realización de la invención es un liposoma o una vesícula, con un tamaño de partícula de entre 0,1 y 100 um.

En determinadas realizaciones, la proporción de lípidos totales a ARNp es de 5 a 35 (es decir, de 5 a 1 a 35 a 1, peso de lípidos a peso de ARNp). En determinadas realizaciones, la proporción de lípidos totales a ARNp es de 5 a 15 (es decir, de 5 a 1 a 15 a 1, peso de lípidos a peso de ARNp).

En una realización aún más preferida, se pueden usar exosomas. Dichos exosomas y su preparación se describen por ejemplo, en Montecalvo etal. (2012, Blood, 119:756-766; y Stoorvogel, 2012, Blood, 119: 646-648). Por ejemplo, se pueden usar exosomas cargados con uno o más extractos de ARNp de plantas o hongos o de ARNp, o composiciones que comprenden dos o más extractos de ARNp o ARNp de plantas o hongos. Por ejemplo, se pueden usar exosomas cargados con miARN de plantas.

Las nanopartículas poliméricas formadas por el autoensamblaje de policationes con ARNip se pueden utilizar para el transporte extracelular, la captación celular y el tráfico intracelular como una estrategia para mejorar el potencial terapéutico del ARNip. Sistemas de nanopartículas (o polyplex) basados en polímeros policatiónicos utilizados para el transporte específico de sitio, la captación celular y el tráfico intracelular de ARNip. Tales nanopartículas y, en particular, las partículas basadas en quitosano y sus preparaciones, se describen, por ejemplo, en 0stergaard et al., Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols, Humana Press, 2009. Por ejemplo, se pueden usar nanopartículas cargadas con uno o más extractos de ARNp o ARNp de plantas o hongos o composiciones que comprenden dos o más extractos de ARNp o ARNp de plantas o hongos.

Otra estrategia de transporte es a través de partículas de fi 1,3-D-glucano (GP), microesferas huecas y porosas derivadas de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero) que proporcionan un sistema eficiente para la encapsulación, protección y transporte oral o sistémico de macromoléculas dirigido a macrófagos, tales como ADN, ARNip y proteínas utilizando ya sea un método de síntesis polyplex o de capa por capa (LbL). Tales partículas y sus preparaciones se describen por ejemplo, en Soto y Ostroff, Nanomaterials for Biomedicine, 3, 57-79, 2012. En una realización particular, el ARNp de plantas o hongos se encapsula en partículas de fi 1,3-D-glucano de 2-4 gm huecas.

Por ejemplo, pueden usarse partículas de glucano cargadas con moléculas de ARNp de plantas o hongos de la invención.

El "método de extracción MRG" permite la extracción selectiva y la purificación de especies de ácido ribonucleico de bajo peso molecular (ARNp) de plantas y/o biomasa derivada de hongos que presentan propiedades antiinflamatorias (Plant microRNAs as novel immunomodulatory reagents, Scientific Reports, 2016, Cavalieri et al.). A diferencia de otros métodos existentes, que han sido todos diseñados con fines analíticos, el protocolo MRG tiene como objetivo la producción de extractos de ARNp para la industria alimentaria y no implica el uso de disolventes ni reactivos tóxicos y logra la extracción selectiva de ARNp a partir de extractos a través de la interacción iónica con gel de sílice activado.

Es importante señalar que el método MRG tiene como objetivo el enriquecimiento selectivo en los extractos de la fracción de microARN y ARNip que comprenden ARN pequeños de longitud entre 19 y 24 nt. Estas especies están presentes tanto en configuraciones monocatenarias como bicatenarias (ARNmc y ARNbc) y se caracterizan por la presencia de un grupo fosfato en los extremos 5' y un grupo metilo en los extremos 3'. Estas propiedades hacen que estas especies moleculares (particularmente las configuraciones bicatenarias) sean mucho más resistentes que otros ARNp a la degradación durante la extracción.

La presente invención se ilustrará mediante ejemplos no limitantes con referencia a las siguientes figuras.

Figura 1. Un método para la purificación a escala de laboratorio de ARNp de hongos.

Figura 2. Electroferogramas de extractos de ARNp obtenidos utilizando LB con diferente pH.

Figura 3. Electroferogramas de extractos de ARNp obtenidos utilizando diferentes concentraciones de SDS en el LB. Figura 4. Electroferogramas de extractos de ARNp obtenidos utilizando diferentes concentraciones de NaCl en el LB Figura 5. Electroferogramas de extractos de ARNp obtenidos usando diferentes concentraciones de EDTA en el LB.

Figura 6. ARNp total extraído de varias plantas y tejidos fúngicos (100 mg) utilizando el "método de extracción de ARNp MRG". El contenido total de ARNp del eluido de DW de las esferas de dióxido de silicio se determinó usando el kit Agilent RNA 6000 Nano a través del instrumento Bioanalyzer (Agilent Technologies) y los datos se expresan como ug/g de tejido ± D.E.

Figura 7. Método de extracción de ARNp MRG (columna) de plantas u hongos

Figura 8. Método de extracción de ARNp MRG (sin columna) de plantas u hongos

Figura 9. Extracción en disolución de bicarbonato diluido

Figura 10. La figura muestra el perfil de ARN de extractos de ARNp concentrados antes (A) y después (B) del tratamiento con ARNasa A utilizando el kit Agilent RNA 6000 Nano a través del instrumento Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Figura 11. La figura muestra el perfil de ARN de los extractos concentrados de ARNp antes (A) y después (B) del tratamiento con la proteína de unión a p19siARN utilizando el kit Agilent RNA 6000 Nano a través del instrumento Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Ejemplos

Materiales y método

Protocolo de inicio para la extracción de ARNp de tejido de hongos basado en la utilización de reactivos no tóxicos para la lisis de tejidos y esferas de sílice magnéticas para el aislamiento de ARNp de la disolución de extracción.

Protocolo de extracción básico (BEP):

1. Extracción de ARNp: Se incuban 100 mg de tejido de hongo (cuerpo fructífero de Agaricus bisporus) con 200 pL de tampón de lisis (LB) precalentado (55 °C) a temperatura ambiente durante 10 min con agitación en vórtice (30 segundos cada 2 minutos).

2. Unión de ARNp a esferas magnéticas: Después de la centrifugación, el extracto (200 pL) se transfiere a placas de múltiples pocillos y se añade isopropanol. Posteriormente, se añaden 0,5 mg de esferas de sílice magnéticas (MagPrep basic, Merck Millipore) a los pocillos que se dejan agitando suavemente durante 10 min.

3. Lavado de las esferas: Las esferas se retiran con un soporte magnético y el resto de la disolución se desecha. A continuación, las esferas se lavan tres veces con etanol al 85 % y luego se dejan secar para eliminar el etanol residual.

4. Elución del ARNp: El ARNp unido se retira de las esferas con 60 pl de agua sin ARNasa precalentada.

Optimización del protocolo.

Etapa 1: Variación del pH del tampón LB

Condiciones utilizadas: BEP con concentración final de isopropanol al 60 % y LB con diferente pH (pH 5-10) (ver figura 2).

Tabla 1: Cantidad de ARNp extraído de hongos usando LB con pH:

El mayor rendimiento de ARNp se obtuvo utilizando un LB con pH 8,5.

Etapa 2: Variación de las concentraciones de SDS en el LB

Condiciones utilizadas: BEP con una concentración final de isopropanol al 60 % y LB a pH 8,5 y varias concentraciones de SDS (0-6 %) (ver figura 3).

Tabla 2: Cantidad de ARNp extraído del tejido del hongo usando varias concentraciones de SDS en el LB:

El mayor rendimiento de ARNp se obtuvo con una concentración de SDS al 2 % en el LB.

Etapa 3: Variación de la concentración de NaCl en el LB.

Condiciones utilizadas: BEP con concentración final de isopropanol al 60 % y LB a pH 8,5, SDS al 2 % y diferentes concentraciones de NaCl (0-0,3 M) (ver figura 4)

Tabla 3: Cantidad de ARNp extraído del tejido de hongo usando varias concentraciones de NaCl:

El mayor rendimiento de ARNp se obtuvo con NaCl 0,2 M en el LB.

Etapa 4: Variación de la concentración de EDTA en el LB.

Condiciones utilizadas: BEP con concentración final de isopropanol al 60 % y LB a pH 8,5, SDS al 2 %, NaCl 0,2 M y diferentes concentraciones de EDTA (0,20 mM) (ver figura 5).

Tabla 4: Cantidad de ARNp extraído del tejido del hongo usando varias concentraciones de EDTA en el LB:

El mayor rendimiento de ARNp se obtuvo con una concentración de EDTA de 10 o 20 mM en el LB.

Protocolo de extracción optimizado (OEP):

1. Extracción de ARNp: Se incuban 100 mg de tejido de hongo (cuerpo fructífero de Agaricus bisporus) con 200 gL de tampón de lisis precalentado (55 °C) (LB: Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) que contiene NaCl 0,2 M, EDTA 10 mM y SDS al 2 %) a temperatura ambiente durante 10 min con agitación en vórtice (30 segundos cada 2 minutos).

2. Unión de ARNp a esferas magnéticas: Después de la centrifugación, el extracto (200 gL) se transfiere a placas de múltiples pocillos y se añaden 300 gL de isopropanol (al 100 %). Posteriormente, se añaden 0,5 mg de esferas de sílice magnéticas (MagPrep basic, Merck Millipore) a los pocillos, que se dejan en agitación suavemente durante 10 min.

3. Lavado de las esferas: Las esferas se retiran con un soporte magnético y el resto de la disolución se desecha. A continuación, las esferas se lavan tres veces con etanol al 85 % y luego se dejan secar para eliminar el etanol residual.

4. Elución del ARNp: El ARNp unido se retira de las esferas con 60 gl de agua sin ARNasa precalentada.

Con este OEP se obtiene un rendimiento de 100 gg/g de FW de ARN pequeño de Agaricus bisporus.

Método de extracción MRG

Tampón de extracción:

1) Colocar 100 mg de tejido finamente triturado (nitrógeno líquido) en un recipiente de 2 ml.

2) Añadir tampón de extracción precalentado (55 °C) (200 gl) y mezclar vigorosamente (vórtice).

3) Incubar (10 min, temperatura ambiente) en un termomezclador con un régimen de agitación de 10 s cada 2 min a 400 rpm.

4) Centrifugar (10 min a 9300 RCF, temperatura ambiente).

5) Transferir el sobrenadante en un nuevo recipiente de 2 ml.

6) Agregar isopropanol (300 gl) y mezclar.

7) Agregar 15 mg de gel de sílice (Sigma S-5631, prelavado x 2 en DW e incubado durante la noche con HCl 0,1 M) y mezclar.

8) Incubar durante 10 min a temperatura ambiente con agitación suave.

9) Centrifugar (10 min a 9300 RCF, temperatura ambiente).

10) Desechar el sobrenadante y agregar 500 gl de EtOH al 85 %. Mezclar suavemente.

11) Centrifugar (5 min a 9300 RCF, temperatura ambiente).

12) Repetir x 2 etapa 10-11.

13) Desechar el sobrenadante y dejar que el gel de sílice se seque.

14) Añadir 60 gl de DW.

15) Centrifugar (5 min a 9300 RCF, temperatura ambiente) y recolectar el sobrenadante

Comparación entre métodos de extracción conocidos y el método de la invención.

En este caso, los inventores comparan la eficacia de extracción y la pureza del extracto final entre el método de extracción MRG y otros protocolos que contienen compuestos que pueden ayudar a las purificaciones de la fracción de ARNp, tal como NaBO4 (Borax) o CTAB, que se unen a moléculas poliméricas como polisacáridos, proteínas y ADN o LiCl que, a altas concentraciones (> 2 M), precipitan especies de ácidos nucleicos de alto peso molecular (ARN y ADN) por encima de 150 pb. El método de la invención es un método escalable, barato y seguro para la producción industrial de extractos de ARNp para la industria alimentaria. Todos los protocolos existentes se han modificado para eliminar compuestos altamente tóxicos y minimizar el número de etapas de purificación.

A continuación, se muestra una lista de los métodos utilizados:

Método CTAB modificado (Gambino, G., Perrone, I. y Gribaudo, I. (2008), A Rapid and effective method for RNA extraction from different tissues of grapevine and other woody plants, Phytochem. Anal., 19: 520-525).

Composición del tampón de extracción:

1) Colocar 150 mg de tejido finamente triturado (nitrógeno líquido) en un recipiente de 1,5 ml.

2) Añadir tampón de extracción precalentado (65 °C) (600 gl) y mezclar vigorosamente (vórtice).

3) Incubar (65 °C, 10 min) en termomezclador con un régimen de agitación de 20 s cada 2 min a 400 rpm.

4) Centrifugar (10 min a 9300 RCF, 18 °C).

5) Transferir el sobrenadante a un nuevo recipiente de 1,5 ml.

6) Agregar un volumen de una disolución de NaCl 5 M para alcanzar una concentración final de NaCl 0,5 M y mezclar 7) Agregar un volumen de una disolución de LiCl 8 M para alcanzar una concentración final de LiCl 2 M y mezclar.

8) Incubar (4 °C, 3,5 h)

9) Centrifugar (15 min a 16500 RCF, 4 °C).

10) Transferir el sobrenadante a un nuevo recipiente de 2 ml.

11) Agregar un volumen de una disolución de NaAc 3 M (pH 5,2) para alcanzar una concentración final de NaAc 0,3 M y mezclar.

12) Agregar un volumen igual de isopropanol (al 50 % en v/v) y mezclar.

13) Incubar en agua helada durante 1 hora.

14) Centrifugar (15 min a 16500 RCF, 4 °C).

15) Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 gl de EtOH al 80 %.

16) Centrifugar (15min a 16500 RCF, 4 °C).

17) Desechar el sobrenadante y deje que el sedimento se seque.

18) Agregar DW (50 gl).

Método LiCl (modificado a partir de "osas-Cárdenas, F. de F., Escobar-Guzmán, R., Cruz-Hernández, A., Marsch-Martínez, N., y de Folter, S. (2015), An efficient method for miRNA detection and localization in crop plants, Frontiers in Plant Science, 6, 99).

Tampón de extracción:

1) Colocar 100 mg de tejido finamente triturado (nitrógeno líquido) en un recipiente de 2 ml.

2) Añadir tampón de extracción (500 gl) y mezclar vigorosamente (vórtice).

3) Incubar (60 °C, 10 min) en termomezclador con un régimen de agitación de 20 s cada 2 min a 400 rpm.

4) Centrifugar (10 mina 9300 RCF, 4 °C).

5) Transferir el sobrenadante a un nuevo recipiente de 2 ml.

6) Agregar un volumen de una disolución de KCl 2 M para alcanzar una concentración final de KCl 0,55 M.

7) Agregar un volumen de una disolución de PEG 8000 (al 50 % en p/v) igual a 1/9 del volumen final y mezclar. 8) Incubar 10 min en agua helada.

9) Agregar un volumen de una disolución de LiCl 8 M para alcanzar una concentración final de LiCl 2 M.

10) Incubar 30 min en agua helada.

11) Centrifugar (10 min a 9300 RCF, 4 °C).

12) Transferir el sobrenadante a un nuevo recipiente.

13) Agregar un volumen de una disolución de NaAc 3 M (pH 5,2) para alcanzar una concentración final de NaAc 0,5 M.

14) Agregar 2 volúmenes de EtOH y mezclar.

15) Incubar durante la noche a -20 °C.

16) Centrifugar (15 min a 16500 RCF, 4 °C).

17) Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 600 gl de EtOH al 80 %.

18) Centrifugar (10 min a 16500 RCF, 4 °C).

19) Desechar el sobrenadante y dejar que el sedimento se seque.

20) Agregar DW (50 gl).

Método XT (Moser, C., Gatto, P., Moser, M., Pindo y Velasco, R., Isolation of functional RNA from small amounts of different grape and apple tissues, Mol. Biotechnol. (2004), 26:95).

Tampón de extracción:

Justo antes de usar, agregar PVP40 (concentración final al 2 % en p/v) y Tween 20 (concentración final al 1 % en v/v).

1) Colocar 100 mg de tejido finamente triturado (nitrógeno líquido) en un recipiente de 2 ml.

2) Añadir tampón de extracción precalentado (65 °C) (300 gl) y mezclar vigorosamente (vórtice).

3) Incubar (65 °C, 10 min) en termomezclador con un régimen de agitación de 20 s cada 2 min a 400 rpm.

4) Centrifugar (10 mina 9300 RCF, 4 °C).

5) Transferir el sobrenadante a un nuevo recipiente de 1,5 ml.

6) Agregar un volumen de una disolución de NaCl 5 M para alcanzar una concentración final de NaCl 0,5 M y mezclar.

7) Agregar un volumen de una disolución de LiCl 8 M para alcanzar una concentración final de LiCl 2 M.

8) Incubar 3 h a 4 °C

9) Centrifugar (15 min a 16500 RCF, 4 °C).

10) Transferir el sobrenadante a un nuevo recipiente de 1,5 ml.

11) Agregar un volumen de una disolución de NaAc 3M (pH 5,2) para alcanzar una concentración final de NaAc 0,3 M y mezclar.

12) Agregar 1 volumen de isopropanol y mezclar vigorosamente.

13) Incubar 1 h en agua helada.

14) Centrifugar (15 min a 16500 RCF, 4 °C).

15) Desechar el sobrenadante y lavar el sedimento con 500 gl de EtOH al 80 %.

16) Centrifugar (10 min a 16500 RCF, 4 °C).

17) Desechar el sobrenadante y dejar que el sedimento se seque.

18) Agregar DW (50 gl).

Tabla 5. Rendimiento de ARNp obtenido con los métodos descritos anteriormente:

Tabla 5. ARNp total extraído de diferentes tejidos de plantas y hongos utilizando diferentes métodos de extracción. El contenido de ARNp del extracto final se determinó utilizando el kit Agilent RNA 6000 Nano a través del instrumento Bioanalyzer (Agilent Technologies) y los datos se expresan como ug/g de tejido ± D.E.

Escalada del método MRG hasta un intervalo de 1 kg

La matriz elegida para configurar la escalada del método MRG estaba compuesta por los cuerpos fructíferos (sombrerillos y estipes) de hongos "champiñón" o cotiledones maduros de judías o guisantes.

Se congeló instantáneamente 1 kg de tejido vegetal o de hongo en nitrógeno líquido y se trituró hasta obtener un polvo fino usando TissueLyser II (Qiagen) con frascos de titanio y esferas de titanio de 10 mm de diámetro. Los frascos y esferas se mantuvieron fríos con nitrógeno líquido. El tiempo de trituración se fijó en 1 minuto a una frecuencia de agitación de 30 Hz.

A continuación, el tejido se colocó en un Becker de 3 litros y se añadieron lentamente 2 litros de tampón de lisis MRG (LB) precalentado (55 °C) y se mezclaron a fondo para homogeneizar el material. La disolución se mantuvo en agitación suave durante 10 minutos.

A continuación, el homogeneizado se filtró a través de láminas de celulosa y el líquido resultante se transfirió a un tanque de 5 l al que se añadieron 1,5 volúmenes de isopropanol al 100 %. Después de agitar para homogeneizar la disolución, se añadieron 100 g de esferas de dióxido de silicio, tamaño de partícula de malla 50/70 (Sigma S-5631) y el tanque se mantuvo en agitación durante 10 minutos. Las esferas se lavaron previamente x 2 en DW y se incubaron durante la noche con HCl 0,1 M antes de su uso.

Después de permitir la sedimentación de las esferas, se retiró la fase líquida y las esferas se lavaron 3 veces con 400 ml de EtOH al 85 % que se añadió a las esferas y se dejó en el tanque con agitación durante 10 minutos.

Después del lavado final, se dejó secar el dióxido de silicio y luego se eluyeron los ARNp con 200 ml de agua precalentada (65 °C).

Tabla 6. ARNp total extraído de 1 kg de plantas y tejido fúngico mediante el método de extracción MRG. El contenido de ARNp del extracto final se determinó utilizando el kit Agilent RNA 6000 Nano a través del instrumento Bioanalyzer (Agilent Technologies) y los datos se expresan como mg/kg de tejido ± D.E.

Extracción de ARNp de tejidos vegetales o de hongos sin homogeneización de tejidos.

También se desarrolló un método para la extracción de ARNp de tejidos de plantas y hongos sin homogeneización de tejidos. Se preincubaron tejidos de hongos o plantas intactos o cortados en trozos grandes (100 mg) durante 16 h a 4 °C en NaHCO38,75 mM. Posteriormente, después de la eliminación del líquido de lavado, los tejidos se colocaron en recipientes que contenían 1 L de varios medios de extracción: MRG LB (con exclusión de SDS), agua o NaHCO330 mM, y se incubó a 60 °C o 95 °C (ebullición) y el ARNp presente en la fase líquida se midió utilizando el método MRG (de la etapa 5). Para la incubación a 60 °C se cambió la fase líquida cada 60 min, y la duración total fue de 180 min. Para la incubación a 95 °C, el volumen se mantuvo constante rellenando y la duración total fue de 60 min.

Tabla 7.

Tabla 7. ARNp total extraído de 100 g de plantas y tejido fúngico incubados con medio de extracción sin homogeneización de tejido. El contenido total de ARNp del extracto líquido se determinó usando el kit Agilent RNA 6000 Nano a través del instrumento Bioanalyzer (Agilent Technologies) y los datos se expresan como ug/g de tejido ± D.E.

Este proceso permite reducir costes y, tras la extracción de los ARNp, la biomasa vegetal puede ser reutilizada en la cadena alimentaria y no convertirse en residuo industrial.

Tratamiento adicional del extracto de ARNp final:

El extracto final puede concentrarse mediante eliminación del agua (secado al vacío) o filtración a través de membranas de exclusión por tamaño (debe retener moléculas de 13 KDa).

1. ARNasa

Con el fin de mejorar la eficacia biológica de los extractos concentrados de ARNp, se desarrolló un método para reducir la posibilidad de interferencia dependiente de secuencia fuera de la diana o mediada por RISC y/o la actividad proinflamatoria de moléculas de ARNmc con longitud superior a 40 nt. Los extractos de ARNp concentrados se incubaron con ARNasa A (0,02 qg/10 |ul de extracto) en presencia de NaCl 0,4 M durante 30 minutos a TA. Con este tratamiento se eliminan 60 %-90 % del ARNp y el extracto resultante estaba muy enriquecido en especies moleculares de ARNbc.

2. Purificación de ARNbc a través de motivos de unión a ARNbc (dsRBM)

Con el fin de mejorar la eficacia biológica de los extractos concentrados de ARNp, se desarrolló un método para reducir la posibilidad de interferencia dependiente de secuencia fuera de la diana o mediada por RISC y/o la actividad proinflamatoria de moléculas de ARNmc con longitud superior a 40 nt. Las proteínas de unión al ARN (RBP) abundan en la naturaleza y pueden unirse de manera selectiva y reversible a los ARN. Esta capacidad es proporcionada por los dominios de unión a ARN específicos (RBD) que existen en varias formas. En particular, el dominio de unión a ARN bicatenario (dsRBM) es un dominio de 70-75 aminoácidos que desempeña un papel fundamental en el procesamiento del ARN, la localización del ARN, la interferencia del ARN, la edición del ARN y la represión de la traducción. Los dsRBM interactúan a lo largo del dúplex de ARN a través de las hélices a y el bucle p1-p2 y se ponen en contacto con la estructura de azúcar-fosfato del surco principal y de un surco menor, lo cual está mediado por el bucle p1-p2 junto con la región N-terminal de la hélice alfa 2. Esta interacción es una adaptación exclusiva para la forma de una doble hélice de ARN, ya que involucra a 2'-hidroxilos y el oxígeno del fosfato. A pesar de las características estructurales comunes entre las dsRBM, exhiben marcos químicos distintos, lo que permite la especificidad para una variedad de estructuras de ARN que incluyen bucles-tallos, bucles internos, protuberancias o hélices que contienen desapareamientos. La proteína de 19 kDa del virus de la mancha anular del clavel italiano (CIRV) (p19), que contiene una firma de aminoácidos básica que favorece la unión al ARN, actúa como un dímero y se une con alta afinidad (intervalo de nM-pM) y poca especificidad de secuencia al surco menor de los dúplex de ARNip de 21-25 nt selectivamente. Cuando la proteína de unión al ARNip p19 se expresa en plantas, suprime la interferencia del ARN.

El tratamiento de extractos concentrados de ARNp (10 ug) con proteínas de unión al ARNip p19 200 U (número del producto M0310S., NewEngland BioLabs) utilizando el protocolo indicado en la hoja de datos de la empresa (M0S10) dio como resultado la eliminación del 95 % de ARNp y la purificación del ARNbc de 21-24 nt. Este método también se puede aplicar a los extractos enriquecidos en ARNbc después del tratamiento con ARNasa (ver más arriba).

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1 Un método para aislar una fracción enriquecida en moléculas de ARN pequeño a partir de una muestra de hongos y/o plantas que comprende:

   a') incubar tejido o células de hongos y/o plantas con una disolución de bicarbonato de metal alcalino a una temperatura de 50-100 °C, separar el líquido de la fase sólida para obtener una fase líquida y

   b) añadir una disolución de alcohol a la fase líquida obtenida en la etapa a') para obtener una disolución;

   c) cargar la disolución obtenida en un soporte sólido capaz de unirse selectivamente a moléculas de ARN pequeño; d) eluir moléculas de ARN pequeño de dicho soporte sólido.
2. 2. - El método según la reivindicación 1, en el que la disolución de bicarbonato es una disolución de bicarbonato diluida, preferiblemente una disolución de NaHCO35-100 mM, más preferiblemente una NaHCO330 mM.
3. 3. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que además comprende, después de la etapa a'), una etapa a") en la que se descarta la fase líquida y se añade una disolución de bicarbonato diluida a una temperatura de 60-100 °C, y en el que la disolución de bicarbonato diluida es una disolución de NaHCO35-10 mM, preferiblemente una disolución NaHCO3 de 8,75 mM, repitiéndose opcionalmente dicha etapa a”).
4. 4. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura de la disolución de bicarbonato es de aproximadamente 95, 100 o 60 °C.
5. 5. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, antes de la etapa a'), se incuban células o tejido fúngico y/o vegetal con una disolución de bicarbonato diluida a 0-10 °C, preferiblemente a 4 °C, en el que la disolución de bicarbonato diluida es una disolución de NaHCO3 5-10 mM, preferiblemente una disolución de NaHCO38,75 mM.
6. 6. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el alcohol es isopropanol, etanol o cualquier alcohol capaz de reducir la actividad del agua y, por tanto, la solvatación de los ARNp, y estimular su unión al soporte sólido.
7. 7. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución de alcohol comprende isopropanol a una concentración final del 60 % en v/v.
8. 8. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las moléculas de ARN pequeño se eluyen del soporte sólido con agua libre de ARNasa y/o en el que las moléculas de ARN pequeño se eluyen del soporte sólido a una temperatura de aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 100 °C, preferiblemente a 55 o 65 °C.
9. 9. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el soporte sólido es un soporte mineral o un soporte polimérico, preferiblemente en el que el soporte mineral o soporte polimérico es una columna que comprende sílice o gel de sílice o partículas de dióxido de silicio, o en el que el soporte mineral o polimérico es un conjunto de esferas fabricadas de un polímero absorbente, preferiblemente en el que el conjunto de esferas se recoge mediante centrifugación, filtración o captura magnética.
10. 10. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además capturar las moléculas de ARN pequeño eluidas.
11. 11. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende:

    la etapa e) de retirar selectivamente los ARNp de las moléculas de ARN pequeño eluidas con un tratamiento con ARNasa y/o

    la etapa f) de tratar las moléculas de ARN pequeño eluidas con un agente que se une con alta afinidad a los dúplex de ARNip de 21 -25 nt selectivamente, para enriquecer la fracción de ARNbc de 21 -24 pb.
12. 12. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las moléculas de ARN pequeño incluyen moléculas de miARN, ARNip, ARNnp, ARNonp y/o ARNt, preferiblemente las moléculas de ARN pequeño consisten como máximo en 100 nucleótidos, preferiblemente como máximo 70 nucleótidos, o más preferiblemente como máximo 30 nucleótidos, preferiblemente en el que las moléculas de ARN pequeño consisten en entre 21 y 24 nucleótidos, más preferiblemente entre 19 y 24 nucleótidos.
13. 13. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas moléculas de ARN pequeño están en configuraciones monocatenarias y/o bicatenarias,

    y/o en el que dichas moléculas de ARN pequeño se caracterizan la presencia de un grupo fosfato en los extremos 5' y/o un grupo metilo en los extremos 3',

    y/o en el que las moléculas de ARN pequeño son miARN, miARN maduro y/o moléculas de ARNip.