CN104321423A - 一种用于过滤生物样品的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于过滤样品的方法，包含下列步骤：(a)提供带有真核细胞并含有或怀疑含有微生物的样品；(b)进行真核细胞的选择性裂解来获得裂解的样品；(c)使步骤(b)中获得的裂解的样品过滤通过设置成保留微生物的过滤器；(d)通过使基于洗涤剂的清洗缓冲液通过过滤器用基于洗涤剂的清洗缓冲液清洗过滤器来选择性地溶解源于由过滤器保留的真核细胞的蛋白质，从过滤器来移除蛋白质阻塞物，以允许另外的过滤所述裂解的样品的步骤(c)。

Description

一种用于过滤生物样品的方法
本发明以一般的方式涉及在含有大量的其他细胞的样品中的低浓度微生物的检测，以及更特别地涉及在血细胞的选择性裂解之后血液样品的过滤的方法，来选择性地在过滤器上保留病原体，而移除血细胞物质，诸如DNA和蛋白质。
分子诊断旨在快速检测样品诸如血液中微量的病原体(通常是细菌)。然而，血液是复杂的基质，以及包含用于适应性免疫系统的白血细胞(白细胞)、用于氧气传输的红血细胞(红细胞)、以及用于伤口愈合的血小板(platelets)(血小板(thrombocytes))。这种组成使得样品诸如全血中病原体的直接检测复杂化，全血含有高量的细胞物质，诸如DNA和蛋白质。
因此，需要用于富集病原体同时从血液样品中移除血液细胞物质的方法。
在已知的方法中，在血细胞的选择性裂解之后，通过大体积血液样品的过滤，病原体被收集在过滤器上。
在过滤步骤中，当病原体被保留在过滤器上时，抑制成分诸如DNA或蛋白质被移除。
国际专利申请WO-A-2011/070507公开了用于在含有或怀疑含有微生物的样品中真核细胞的选择性裂解的方法，其中洗涤剂和缓冲液被加入到所述样品来获得溶液，其进一步被孵育足够长的时间段来裂解真核细胞。这种方法允许具有5至10ml量级的体积的血液样品的处理，通过裂解样品中的白血细胞和红血细胞，降解白血细胞DNA，而微生物的主要部分(即多于20％、40％、60％、80％、90％，或甚至多于95％)依然活着，或如果通过处理被杀死，在细胞壁中仍然包含细菌DNA。所述微生物随后通过过滤步骤能够被富集，以便抑制成分诸如DNA或蛋白质被移除，而在细胞壁中带有它们的细菌DNA的病原体保留在过滤器上。
所有可用体积的样品被过滤来收集最多的微生物在过滤器上是很重要的。然而，当该方法被应用时，在样品完全过滤之前，过滤器通常由于，例如，样品中也被保留在过滤器上的蛋白质的存在而被阻塞(clog)。这种阻塞导致过滤的失败，从而停止了整个处理。因此，现有的方法确实限制了在过滤器上能够被处理的样品的量。
本发明旨在解决这些上述缺点，以及首次提出了用于过滤带有真核细胞的样品的方法，没有限制能够被过滤的样品的体积的风险，以便与现有方法相比增加该方法的灵敏度。这样的过滤方法可被用于在含有高背景的蛋白质和/或核酸的复杂样品中检测微生物的一般方法。
为了这个目标，本发明的第一方面是用于过滤样品的方法，包含下列步骤：
(a)提供带有真核细胞并含有或怀疑含有微生物的样品；
(b)进行真核细胞的选择性裂解来获得裂解的样品；
(c)使步骤(b)中获得的裂解的样品过滤通过设置成保留微生物的过滤器；
(d)通过使基于洗涤剂的清洗缓冲液通过过滤器用基于洗涤剂的清洗缓冲液清洗过滤器来选择性地溶解过滤器上保留的除了微生物之外的物质，从过滤器移除由除了微生物之外的物质组成的阻塞物，以允许另外的过滤所述裂解的样品的步骤(c)；
(e)重复步骤(c)至少1次。
本发明避开了被源于样品基质或真核细胞的物质对过滤器的阻塞，通过清洗过滤器的步骤来移除过滤器的阻塞物，以便裂解的样品可被完全地过滤，不会由于过滤器的透性的显著降低而停止。阻塞物的选择性移除是通过含有洗涤剂的清洗缓冲溶液进行的，以便只有除了微生物之外的物质从过滤器被移除。积累到过滤器上的微生物不被这种缓冲清洗溶液移除或降解，以便它们保留在过滤器上，用于为了检测或分析的进一步处理。
有利地，除了微生物之外的物质是源于真核细胞的蛋白质。已经注意到，源于真核细胞的蛋白质易于被过滤器保留以及阻塞过滤器，以便根据本发明的方法有助于进行从过滤器选择性移除这些蛋白阻塞物。
有利地，洗涤剂清洗缓冲液是pH大于5以及低于9的磷酸盐缓冲生理盐水溶液，以及含有表面活性剂作为洗涤剂。除了微生物之外的物质的选择性清洗被达到。
有利地，表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)以及洗涤剂清洗缓冲液含有约0.2％以及约0.5％之间体积的十二烷基硫酸钠(SDS)。优选地，表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)以及洗涤剂清洗缓冲液含有约0.3％体积的十二烷基硫酸钠(SDS)。十二烷基硫酸钠的这种特别的浓度达到了只有除了微生物之外的物质诸如源于真核细胞的蛋白质的选择性溶解。理想情况下，SDS的浓度为从0.2％到0.5％，优选从0.25％到0.35％，更优选从0.27％到0.33％体积。洗涤剂是SDS，因为已知这种洗涤剂对蛋白质具有显著的效果。它将以这样的方式对蛋白质相互作用：其使蛋白质变性，还原硫键(sulfide bond)，并取决于蛋白质的质量，会导致最终净负电荷。关键在于洗涤剂的浓度：其应该有效地助于打开过滤器，而其不可导致已经收集的病原体的裂解。
在本发明的优选的实施方式中，方法包含在过滤所述裂解的样品的步骤(c)过程中检测过滤器的阻塞的步骤。方法监测过滤器的阻塞，以便在涉及过滤器的阻塞时能够采取适当的行动。
理想情况下，当如通过测量过滤器室中建立的压力检测到过滤器的阻塞时，进行清洗过滤器的步骤(d)。如果过滤器被阻塞，过滤受到损害，当检测到阻塞时进行清洗步骤，以便该处理不包含任何不必要的清洗操作：仅仅在过滤器被阻塞时才进行清洗。
有利地，真核细胞的选择性裂解的步骤(b)包含：
(b1)加入裂解洗涤剂以及碱性缓冲液到所述样品的步骤，之后
(b2)孵育样品足够长的时间段来选择性地裂解真核细胞和同时降解真核生物DNA的步骤。这种方法确保真核细胞的细胞膜的物理完整性的合适的破坏，没有降解微生物的完整性的任何试图。
在一种实施方式中，所述样品是哺乳动物的血液样品。如果样品是血液样品，该方法以有效的清洗保留在过滤器上的裂解的血液细胞，增强了过滤。
在一种实施方式中，血液样品是全血。
当血液样品源于患有全身性炎症反应综合征(SIRS)的患者时，根据本发明的方法给出了良好的结果。源于患有SIRS的患者的这样的血液样品已经成功地被根据本发明的方法过滤了，即使凝血级联反应在处理血液样品之前被激活。
在本发明的一种实施方式中，在第一预定时间期间进行过滤步骤(c)，以及在第二预定时间期间进行清洗步骤(d)。这种实施方式限制了过滤在确定的第一时间，以便过滤器的阻塞不限制过滤，以及限制清洗步骤在确定的第二时间，以便清洗的过滤器将允许另一个步骤的过滤。在裂解的样品的过滤期间定期清洗过滤器以及过滤和清洗步骤在任何阻塞之前以连续模式完成，以便过滤器在更长时间段保持打开，以及更大的体积能够被处理。
有利地，第一预定时间范围从20-80秒，优选从50-70秒，以及更优选55-65秒，以及第二预定时间范围从5-25秒，优选5-20秒，以及更优选5-15秒。这些时间段允许有效地过滤源于患者诸如患有全身性炎症反应综合征(SIRS)或心内膜炎的患者的血液样品。
在本发明的另一种实施方式中，方法还包含裂解所述微生物的步骤以及基于核酸的分子检验来检测微生物。
本发明还涉及用于样品的过滤的设备，包含：
-裂解室，所述裂解室用于接受带有真核细胞并含有或怀疑含有微生物的样品，以及进行真核细胞的选择性裂解来获得裂解的样品；
-过滤器，所述过滤器连接到裂解室，用于在选择性裂解之后过滤裂解的样品，所述过滤器被设置成保留所述微生物在过滤器上，以及
-贮存器，所述贮存器连接到过滤器，并含有基于洗涤剂的清洗缓冲液来选择性地溶解被过滤器保留的除了微生物之外的物质，来从过滤器移除由除了微生物之外的物质组成的阻塞物。
根据本发明的设备提供了如果过滤器在过滤过程中被阻塞则清洗所述过滤器的方式。事实上，基于洗涤剂的清洗缓冲液被选择为仅仅溶解除了微生物之外的物质诸如源于真核细胞的蛋白质，以及含有基于洗涤剂的清洗缓冲液的贮存器被连接到过滤器来允许过滤器的清洗。即使一些蛋白质阻塞过滤器，过滤可以被操作，而没有微生物的任何损失，所述微生物不被基于洗涤剂的清洗缓冲液溶解。
在一种实施方式中，裂解室呈现40ml或更少的体积。
有利地，洗涤剂清洗缓冲液是pH大于5以及低于9的磷酸盐缓冲生理盐水，并含有在约0.2％以及约0.5％之间的体积的十二烷基硫酸钠(SDS)，优选约0.3％。
有利地，设备还包含设置成测量过滤器的阻塞的传感器。理想情况下，传感器是压力传感器。作为可替代的，传感器可以是光学传感器，其测量该装置的泵的偏转，并被集成在该设备中。有利地，上述的泵可以在固定的压力下操作。
有利地，该设备还包含用于进行基于核酸的分子检验的检测室来检测微生物。
定义
本发明的上下文中的“血细胞”涉及存在于血液中的哺乳动物细胞，以及包括红血细胞(红细胞)、白血细胞(白细胞)和血小板(blood platelets)(血小板(thrombocytes))。
本发明的上下文中的“全血”涉及用抗凝血剂处理的、含有血浆和细胞的未加工的血液。
“样品”涉及包含细胞物质的含水悬浮液，以及包含体液诸如淋巴液、脑脊液、血液(全血和血浆)、唾液，但还包含如均质悬浮液的含水级分，诸如，如肌肉、脑、肝或其他组织。
本发明中的“真核”涉及排除真菌的任何类型的真核生物，诸如动物，特别是含有血液的动物，以及包含无脊椎动物，诸如甲壳类动物(crustaceans)，以及脊椎动物。脊椎动物包含冷血(鱼、爬行动物、两栖动物)以及温血动物(鸟类和哺乳动物)。哺乳动物包含特别是灵长类动物，以及更特别是人类。
当在样品(诸如血液)中，与来自被收集血液样品的生物体并保持完整的真核细胞的百分比相比，该样品中保持完整的微生物细胞(诸如细菌细胞)的百分比显著地更高(如2、5、10、20、50、100、250、500或1000倍更多)时，获得本发明中使用的“选择性裂解”。例如，但不限于这种特定方法，真核细胞的选择性裂解可通过在文件WO-A-2011/070507中公开的方法进行。
本发明中使用的“微生物”涉及细菌(革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，还有细菌孢子)以及单细胞真菌诸如酵母和霉菌，其在已经被收集样品的生物中存在，通常是作为病原体。
从本发明的特定的非限制的例子的以下详细描述，本发明的其它特征和优点将显得更清楚，由附图所示，其中：
-图1表示了应用或者不应用根据本发明的方法过滤血液样品的比较结果；
-图2a和2b表示了应用或者不应用根据本发明的方法，不同病原体的检测的比较结果。图2a用病原体铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)以及图2b用病原体白色念珠菌(C.albicans)。
详细说明
实验1-对过滤的影响
图1表示了使用(样品A)以及不使用(样品B)根据本发明的清洗步骤，过滤源于患有全身性炎症反应综合征(SIRS)的患者的5ml血液样品的比较结果。
血液样品全部(A和B)被进行真核细胞的选择性裂解，通过加入由1M的HCO3 -/CO3 2-缓冲液(pH 10.0)和1％的十二烷基硫酸钠(SDS)组成的裂解缓冲液。与血液样品混合后，发生选择性裂解，并且在3分钟之后使用降低pH的第三缓冲液被停止。
将所有的血液样品处理通过被设置成保留微生物的过滤器。两个系列的6种血液样品已经被过滤：
-用标准方法准备的6种血液样品，在过滤过程中，在选择性裂解之后，不用过滤器清洗(血液样品A)，以及
-用根据本发明的方法准备的6种血液样品，在过滤过程中，在选择性裂解之后，有过滤器清洗步骤(血液样品B)。对于这些样品B，过滤步骤持续1分钟，以及清洗步骤持续10秒，各步骤以连续模式完成。
对于血液样品B，使用设置有连接到这样过滤器的裂解室的一次性筒(cartridges)准备血液样品，该筒具有额外的贮存器连接到该过滤器，以及含有清洗缓冲液，其为磷酸盐缓冲生理盐水溶液，其含有0.3％体积的十二烷基硫酸钠(SDS)。血液样品A被直接地和仅仅进行过滤操作，以及血液样品B被进行1分钟的过滤步骤，该步骤被用含有0.3％体积的十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲生理盐水溶液清洗过滤器的10秒步骤中断，之后是另一过滤步骤。
图1表示对于每一样品过滤的液体的量。对于血液样品A，只有一种血液样品的5ml已经被完全地过滤了，4个血液样品的仅仅2-3ml在过滤器阻塞之前已经被过滤了，以及一种血液样品完全没有被过滤，过滤器立即被阻塞了。6种血液样品B已经完全被过滤了。这证明了过滤器的清洗步骤使得能够过滤在此前进行选择性裂解的5ml的血液样品的完全体积。
实验2-病原体的回收的比较结果
图2a表示了使用根据本发明的方法，正常健康献血者的血液样品中含有的特定病原体铜绿假单胞菌的回收的结果，与不清洗过滤器的方法的结果比较。血液样品A表示不用清洗步骤的方法的基线，以及血液样品B在根据本发明在过滤过程中引入清洗的步骤下被测试。该图表示，过滤器的清洗对从血液回收病原体没有影响。
图2b表示了使用根据本发明的方法，包含在血液样品中的特定病原体白色念珠菌的回收的结果，与没有清洗过滤器的方法的结果比较。用病原体白色念珠菌的这个实验还导致了结论：根据本发明的方法对从血液回收病原体没有有害影响，由于血液样品A(基线，没有过滤器的清洗步骤)显示与在过滤过程中带有清洗步骤的测试的血液样品B相似的结果。
实验3-对可过滤体积的影响
在第三个实验中，一次性筒被设计成具有4倍小于标准过滤器大小的过滤器大小(1,75cm2对7cm2)。来源于正常的健康的献血者的血液的5ml的血液样品已经根据本发明的方法被成功过滤(带有清洗过滤器的步骤)，其与过滤通过标准大小的过滤器的20ml的血液样品相似。这是用无新的清洗的方法可达到的可过滤体积的至少2倍。
应理解，对于本领域技术人员明显的改善和/或修改可以被实施，其在本发明的范围下，因为本发明的范围是由所附的权利要求限定的。特别的是，真核细胞的选择性裂解可用任何已知的使用物理、化学或生物处理的方法进行。

Claims (15)

1.一种用于过滤样品的方法，所述方法包含下列步骤：
(a)提供带有真核细胞并含有或怀疑含有微生物的样品；
(b)进行所述真核细胞的选择性裂解来获得裂解的样品；
(c)使步骤(b)中获得的所述裂解的样品过滤通过设置成保留所述微生物的过滤器；
(d)通过使基于洗涤剂的清洗缓冲液通过所述过滤器，用所述基于洗涤剂的清洗缓冲液清洗所述过滤器来选择性地溶解被所述过滤器保留的除了所述微生物之外的物质，从所述过滤器移除由除了所述微生物之外的所述物质组成的阻塞物，以允许另外的过滤所述裂解的样品的步骤(c)；
(e)重复步骤(c)至少1次。
2.根据权利要求1所述的方法，其中除了所述微生物之外的所述物质是源于所述真核细胞的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述洗涤剂清洗缓冲液是pH大于5并且低于9的磷酸盐缓冲生理盐水溶液，并含有表面活性剂作为所述洗涤剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)，并且其中所述洗涤剂清洗缓冲液含有约0.2％以及约0.5％之间体积的十二烷基硫酸钠(SDS)，优选约0.3％。
5.根据权利要求1到4所述的方法，还包含在过滤所述裂解的样品的所述步骤(c)的过程中，检测所述过滤器的阻塞的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中当检测到所述过滤器的阻塞时，进行清洗所述过滤器的所述步骤(d)。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中真核细胞的选择性裂解的所述步骤(b)包含：
(b1)加入裂解洗涤剂以及碱性缓冲液到所述样品的步骤，之后
(b2)孵育所述样品足够长的时间段来选择性地裂解所述真核细胞的步骤。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述样品是哺乳动物血液样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述血液样品源于患有全身炎症反应综合征(SIRS)或心内膜炎的患者。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，还包含裂解所述微生物的步骤。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，还包含基于核酸的分子检验来检测所述微生物。
12.一种用于样品的过滤的设备，包含：
-裂解室，所述裂解室用于接受带有真核细胞并含有或怀疑含有微生物的样品，以及用于进行所述真核细胞的选择性裂解来获得裂解的样品，
-过滤器，所述过滤器连接到所述裂解室，用于在所述选择性裂解之后过滤所述裂解的样品，所述过滤器被设置成保留所述微生物在所述过滤器上，以及
-贮存器，所述贮存器连接到所述过滤器，并含有基于洗涤剂的清洗缓冲液来选择性地溶解被所述过滤器保留的除了所述微生物之外的物质，来从所述过滤器移除由除了所述微生物之外的所述物质组成的阻塞物。
13.根据权利要求12所述的设备，其中所述洗涤剂清洗缓冲液是pH大于5并且低于9的磷酸盐缓冲生理盐水溶液，以及含有在约0.2％以及0.5％之间体积的十二烷基硫酸钠(SDS)，优选约0.3％。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的设备，还包含传感器，所述传感器被设置成测量所述过滤器的阻塞。
15.根据权利要求12到14中任一项所述的设备，还包含检测室，所述检测室用于进行基于核酸的分子检验来检测所述微生物。
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