RU2186848C1 - Способ выделения супероксиддисмутазы - Google Patents

Способ выделения супероксиддисмутазы Download PDF

Info

Publication number
RU2186848C1
RU2186848C1 RU2001112992/13A RU2001112992A RU2186848C1 RU 2186848 C1 RU2186848 C1 RU 2186848C1 RU 2001112992/13 A RU2001112992/13 A RU 2001112992/13A RU 2001112992 A RU2001112992 A RU 2001112992A RU 2186848 C1 RU2186848 C1 RU 2186848C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
chromatography
solution
carried out
superoxide dismutase
isolation
Prior art date
Application number
RU2001112992/13A
Other languages
English (en)
Inventor
Л.Я. Соловьева
И.В. Чурилова
жев В.А. Кн
В.А. Княжев
В.Г. Калошин
Т.О. Антипова
Н.М. Федорова
Original Assignee
Чурилова Ирина Васильевна
Шаронова Валентина Львовна
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чурилова Ирина Васильевна, Шаронова Валентина Львовна filed Critical Чурилова Ирина Васильевна
Priority to RU2001112992/13A priority Critical patent/RU2186848C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2186848C1 publication Critical patent/RU2186848C1/ru

Links

Images

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии и смежных областях науки и техники для получения супероксиддисмутазы (СОД). Способ выделения супероксиддисмутазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae включает разрушение клеток продуцента и выделение активного начала обработкой клеток продуцента. Многостадийную хроматографию ведут последовательно на сорбентах Солоза, на Sp-сефадексе и на С8-целлюлозе. При этом хроматографию на Солозе КГ проводят в статическом режиме при рН 4,0-4,2 в 0,1 М растворе однозамещенного фосфата натрия с элюцией целевого продукта при рН 5,0-5,2. Хроматографию на Sp-сефадексе - на сорбенте, уравновешенном 0,1 М раствором однозамещенного фосфата натрия с проведением элюции супероксиддисмутазы 0,1 М водным раствором двузамещенного фосфата натрия. Хроматографию на С8-целлюлозе - при рН 3,9-4,1 с использованием в качестве элюата фосфатного буферного раствора. Предлагаемая технология позволяет получать препарат СОД с удельной активностью около 500000 ед/мг и высоким выходом. 1 табл.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии и смежных областях науки и техники для получения супероксиддисмутазы (СОД) человека.
Супероксиддисмутаза находит применение в качестве антиксиданта производстве биологических препаратов, используется для защиты от проникающей радиации, для лечения патологий суставов, дисплозии легких, как противовоспалительное средство и антимутагенный препарат, находит применение в онкологии и геронтологии, а также в пищевой промышленности.
Известен способ выделения СОД человека из эритроцитов крови (пат. США 4435506, 1984, кл. А 61 К 35/18), включающий гемолиз эритроцитов водой, добавку изопропанола, инкубацию 1 час при 50oС, фильтрование, концентрирование фильтрата на полых волокнах, осаждение дo 0-5oС, добавление к смеси ацетона, выдерживание 48 часов, отделение осадка в проточной центрифуге, перерастворение осадка при pH 7.0, центрифугирование и хроматографию на поперечно сшитом декстране. Чистота получаемого продукта - 87%, выход - 20%.
Недостатками способа являются сложность процесса, дефицитность и ограниченность ресурсов используемого сырья - донорской крови человека.
Одним из наиболее перспективных направлений в настоящее время является получение СОД из рекомбинантных штаммов дрожжей Saccharomyces cereviseae (S. cer. ) (вылож. заявка РФ 92009197, 1997, кл. С 12 N 9/02). СОД выделяют из продуцента разрушением клеток дрожжей, выделением из них фракции с мол. массой 10-100 кДа, хроматографической очисткой с использованием ионита типа КБ-2Т, фракционированием активной фракции и осаждением примесей.
Недостатком данного способа является получение препарата относительно невысокой активности.
Прототипом заявляемого способа является технология выделения СОД из дрожжей Saccharomyces cereviseae (пат. РФ 1800841, 1996, кл. С 12 N 9/02), заключающийся в том, что клетки разрушают методом замораживания-оттаивания, после чего экстрагируют активное начало фосфатным буферным раствором при рН 7.7-7.9 и соотношении мицелий: экстрагент 1:3 в течение 20-24 часов при 7oC. Затем суспензию подкисляют до рН 4.4 и отделяют биомассу центрифугированием. Субстрат последовательно очищают ионообменной хроматографией на КМТ, а затем гель-фильтрацией на сефадексе G-75. В результате получали СОД с активностью до 120 Ед/мл. Полученные активные фракции лиофилизируют.
Недостатком прототипа является невозможность получения препарата с высокой активностью.
Задачей, решаемой авторами, являлась разработка способа получения СОД человека, обладающей высокой удельной активностью и повышение выхода конечного продукта.
Указанная задача достигалась путем проведения процесса разрушения клеток дрожжей и выделения активного начала механической дезинтеграцией в присутствии стабилизатора СОД-раствора медного купороса; и осуществление очистки СОД последовательной ионообменной хроматографией на катионите Солоза КГ, Sp-сефадексе и C8-целлюлозе.
Условия очистки определяются экспериментально исходя из особенностей штамма-продуцента и условий его культивирования. Однако проведенные эксперименты, показали, что лучшие результаты достигаются при следующих параметрах процесса:
- использованием в качестве стабилизатора 3-4 мМ раствор медного купороса;
- проведением хроматографии на Солозе КГ в статическом режиме при рН 4.0-4.2 в 0.1 М растворе однозамещенного фосфата натрия с элюцией целевого продукта фосфатным буферным раствором при рН 5.0-5.2;
- проведением хроматографии на Sp-сефадексе, уравновешенным водным раствором 0.1 М однозамещенного фосфата натрия при pН 3.9-4.1 с элюцией целевого продукта 0.1 М раствором двузамещенного фосфата натрия;
- проведением хроматографии на С8-целлюлозе при рН 3.9-4.1 с использованием в качестве элюата 0.1 М раствора однозамещенного фосфата натрия.
Существенными отличиями являются изменение стадии разрушения клеток путем замены процедуры замораживания-оттаивания на существенно более разрушительную для клеток процедуру дезинтеграции (до 97% разрушения клеточных стенок), что приводит к более полному выделению СОД в раствор, стабилизации ее медным купоросом и принципиально иному составу разделяемой смеси продуктов и следовательно необходимости использования иных сорбентов и условий очистки СОД, в частности использования на первой стадии хроматографии со статической десорбцией СОД, позволяющей уменьшить потери целевого продукта и, одновременно, практически полностью отделить его от примесных белков, что исключено при проведении процесса, в режиме хроматографии в потоке.
Конечный продукт обессоливали и лиофильно высушивали. Активность СОД определяли хемилюминесцентным методом. Чистоту получаемого продукта, характеризовали с помощью электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии на сорбенте TSK 2. 000 SW•L.
В результате внесенных изменений в технологию получения СОД человека из дрожжей удалось получить продукт - с активностью 500000 Eд/мг при высоком выходе с единицы биомассы.
Использование заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. 4,5 кг дрожжевой биомассы Saccharomyces cereviseae суспендировали в 8.4 л 2 мМ водного раствора медного купороса, а затем подвергали дезинтеграции в течение 1.5 часов до достижения степени дезинтеграции клеток 97,5%. К лизату клеток добавляли 0.1 М НС1 до рН 4.2, полученный осадок отделяли центрофугированием. Было получено 14 л супернатанта с содержанием СОД 60,2%. Супернатант подкисляли до рН 4.1 и наносили на колонку с 9 л сорбента Солозы КГ. Через сорбент пропускали 50 л раствора 0.1 М однозамещенного фосфата натрия, после чего добавляли еще 10 л этого раствора и при интенсивном перемешивании вводили 10 М раствор NaOH до рН 5.15. Затем смесь перемешивали в течение 30 минут и сливали элюат СОД. Колонку дважды промывали двумя порциями по 10 л 1 М фосфатного буферного раствора и объединяли промывочный раствор с элюатом. Было получено 31 л СОД-содержащего элюата с содержанием СОД 0.1 мас.%.
Полученный элюат нитровали 1 М НC1 до pН 4.0 и наносили на колонку, содержащую 1 л Sp-сефадекса, уравновешенного раствором 0.1 М однозамещенного фосфата натрия при рН 4.0. После чего колонку промывали 3 л буферного раствора и элюировали СОД 0.1 М раствором двузамещенного фосфата натрия. Было получено 1.1 л элюата СОД с содержанием СОД - 24.2 г. Полученный элюат подкисляли 1 М НСl до рH 4.0 и наносили его на колонку с 1.2 л сорбента С8-целлюлоза. Колонку промывали раствором 0.1 М однозамещенного фосфата натрия при рН 4.0. Первые 0.9 л элюата отбрасывали, а следующие 1.8 л отбирали. Выход СОД составлял 23.5 г при активности 500 тысяч единиц на мг. Для сравнения - из 4 кг эритроцитов крови получали только 0.2 г СОД той же активности.
Пример 2. В условиях примера 1 проводили выделение СОД из дрожжей Saccharomyces cerevisae при варьировании параметров отдельных стадий процесса. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Claims (5)

1. Способ выделения супероксиддисмутазы, включающий в себя разрушение клеток продуцента - дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выделение активного начала и центрифугирование, многостадийную хроматографию полученного супернатанта с использованием сефадекса, отличающийся тем, что разрушение клеток и выделение активного начала проводят обработкой клеток продуцента механической дезинтеграцией в присутствии раствора медного купороса, а хроматографию проводят на сорбенте Солоза, на Sp-сефадексе и на С8-целлюлозе.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что разрушение клеток и экстракцию активного начала проводят обработкой клеток продуцента 1-4 мМ раствором медного купороса.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на Солозе КГ проводят в статическом режиме при рН 4,0 - 4,2 в растворе 0,1 М однозамещенного фосфата натрия с элюцией целевого продукта при рН 5,0 - 5,2.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на Sp-сефадексе проводят на сорбенте, уравновешенном раствором 0,1 М однозамещенного фосфата натрия с проведением элюции супероксиддисмутазы 0,1 М водным раствором двузамещенного фосфата натрия.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на С8-целлюлозе проводят при рН 3,9 - 4,1 с использованием в качестве элюата раствора 0,1 М однозамещенного фосфата натрия.
RU2001112992/13A 2001-05-16 2001-05-16 Способ выделения супероксиддисмутазы RU2186848C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001112992/13A RU2186848C1 (ru) 2001-05-16 2001-05-16 Способ выделения супероксиддисмутазы

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001112992/13A RU2186848C1 (ru) 2001-05-16 2001-05-16 Способ выделения супероксиддисмутазы

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2186848C1 true RU2186848C1 (ru) 2002-08-10

Family

ID=20249548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2001112992/13A RU2186848C1 (ru) 2001-05-16 2001-05-16 Способ выделения супероксиддисмутазы

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2186848C1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1693447A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-23 Gnosis S.p.A. Procedure for the preparation of superoxide dismutase
MD4243C1 (ru) * 2012-10-31 2014-02-28 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae - источник супероксиддисмутазы

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOSCIN S. FRIDOVICH J. The purfication and properties of SOD from Saccharomyces cerevisiae. Biochem. Biophys, Acta, 1972, v.289, р.276. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1693447A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-23 Gnosis S.p.A. Procedure for the preparation of superoxide dismutase
MD4243C1 (ru) * 2012-10-31 2014-02-28 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae - источник супероксиддисмутазы

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1927363B1 (en) An extract for preventing or treating thrombotic diseases
CN101182495B (zh) 以猪小肠为原料联产生产碱性磷酸酶和肝素钠的联产工艺
CA1231306A (en) Purification of interferon
WO2020034953A1 (zh) 一种双酶水解制备透明质酸奇数寡糖的方法
RU2186848C1 (ru) Способ выделения супероксиддисмутазы
US4027012A (en) Process for the extraction of components having anticoagulant activity "in vivo" from snake venoms and products obtained
CN112457377B (zh) 美洲大蠊多肽及其应用
CN114480354A (zh) 一种利用基因工程水稻表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法
RU2234513C2 (ru) Способ получения препарата интерлейкина-1-бета
US4610815A (en) Process for producing and obtaining anaphylatoxin- and cocytotaxin-containing leucotaxine preparations and of anaphylatoxin and cocytotaxin proteins in molecularly homogeneous, biologically active form
US4532214A (en) Method for isolation of aminoacylase
RU2051922C1 (ru) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА - 1β ИЗ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
CN117482209B (zh) 一种具有ace抑制作用的蜂王胎活性肽组合物及其制备方法和应用
EP0059182B1 (en) A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract
KR890001003B1 (ko) Lpf-ha의 정제방법
RU2111754C1 (ru) Способ выделения cu, zn-супероксиддисмутазы человека
SU891775A1 (ru) Способ получени пектолитического ферментного препарата из @
US2886489A (en) Preparation of elastase
RU2326947C2 (ru) Способ получения рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина-1 человека "арил"
CN108440639B (zh) 一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用
JP3108767B1 (ja) chib2型キチナーゼの製造法
RU2236460C1 (ru) Способ получения препарата коллагеназы
RU2412997C2 (ru) Способ получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью
CN117904242A (zh) 一种湖羊体内羊胎素多肽及其在免疫功能调节中的用途
JPS60243018A (ja) ヒト内来性癌制御因子

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Effective date: 20070313

PC4A Invention patent assignment

Effective date: 20080212

QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE

Effective date: 20110715

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20200517