CN103209678A - 用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物，其中至少90重量%的胶原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且其中胶原蛋白水解物包含至少四种分子量在600和1200Da之间的特征肽。

Description

用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物
本发明涉及用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物。
一段时间以来已知，可以通过经口摄入胶原蛋白水解物获得在人类皮肤、毛发和/或指甲的健康方面的有利效果（参见例如Vivian Zague：“关于胶原蛋白水解物的摄入对皮肤性质的影响的新观点（A new viewconcerning the effects of Collagen hydrolysate intake on skinproperties）”，Arch.Dermatol.Res.2008(9)479-483）。皮肤健康的改进在本文中被理解为对皮肤的天然性质和功能的各种积极影响，其中所述性质和功能既可以由于老化而受损，也可以额外地通过不同的消极环境影响而受损。摄入胶原蛋白水解物也对毛发和/或指甲的性质产生有利影响。
本发明所基于的目的是，进一步提高胶原蛋白水解物对皮肤、毛发和/或指甲的健康的积极效果，并且提出对于这种应用特别有效的胶原蛋白水解物。
就一开始所述种类的胶原蛋白水解物而言，根据本发明通过以下方式来实现所述目的，其中至少90重量%的胶原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且胶原蛋白水解物包含至少四种分子量在600和1200Da之间的特征肽。
胶原蛋白水解物包含具有不同链长或分子量的肽，所述肽在胶原蛋白的蛋白链切割期间产生，其中所述肽的分子量分布可以取决于水解物的制备条件而显著变化。目前已经出人意料地表明，相比于目前使用的包含明显更少比例的低分子量肽和/或不包含特征肽的胶原蛋白水解物，具有上述性质的胶原蛋白水解物在多种不同方面对皮肤健康产生特别有利的影响，即显示出显著更好的结果。
以至少90重量%低于3500Da的极限值为基础的胶原蛋白水解物的分子量分布可以例如通过凝胶渗透色谱法使用限定的胶原蛋白片段的校准标样极精确和可重复地确定。
至少45重量%的胶原蛋白水解物优选具有小于1500Da的分子量，即胶原蛋白水解物的一定比例的肽是特别短链的。已经表明，通过这种特别低分子的比例（其在目前使用的胶原蛋白水解物中仅以明显更少的量存在），可以获得皮肤健康方面的极为突出的效果。
根据本发明使用的胶原蛋白水解物的平均分子量（重均Mw）通常在约1700至约2300Da的范围内。
胶原蛋白水解物的特征肽（其有趣地对胶原蛋白水解物的效力做出重大贡献）的存在可以特别通过MALDI-质谱法确定，其中特征肽在质谱中以峰的形式出现。在通过MALDI-质谱法确定的分子量分布中，至少四种特征肽优选具有相比于其周围至少两倍的强度，进一步优选至少四倍的强度。
在本发明的优选的实施方案中，胶原蛋白水解物包含620和690Da之间的肽、790和860Da之间的肽、980和1050Da之间的肽以及1175和1245Da之间的肽。这些肽以特有方式使根据本发明的胶原蛋白水解物区别于已知的胶原蛋白水解物。
胶原蛋白水解物还可额外地具有1500和3500Da之间的特征肽，所述特征肽也构成与根据现有技术的胶原蛋白水解物的区别特征。
胶原蛋白水解物优选具有12重量%或更大的羟基脯氨酸比例。通过脯氨酸的翻译后羟基化形成的氨基酸羟基脯氨酸仅存在于胶原蛋白中，因此胶原蛋白水解物中高比例的羟基脯氨酸是基本不存在其他结缔组织蛋白（例如弹性蛋白和蛋白聚糖）的度量，所述其他结缔组织蛋白的片段取决于制备方法也可以以一定量被包含在胶原蛋白水解物中。
有利的是，胶原蛋白水解物通过明胶的酶促水解制得。明胶包含变性胶原蛋白并且通过本领域技术人员已知的不同方法从不同动物种类的结缔组织或从骨骼获得。在本发明的范围内，作为胶原蛋白水解物的起始材料使用的明胶优选从哺乳动物的皮肤，特别是从猪皮或牛皮获得，但是也不排除使用来自家禽的明胶。
明胶的酶促水解通常通过至少一种内切蛋白酶进行，其中在本发明的范围内优选的是，使用多种内切蛋白酶（即至少两种不同的内切蛋白酶），从而由此相应地影响所得胶原蛋白水解物的氨基酸分布情况
Figure BDA00003192928500031
并且提高水解物对皮肤、毛发和/或指甲的健康的积极效果。
根据本发明的优选的实施方案，胶原蛋白水解物通过至少两种具有不同特异性的内切蛋白酶，特别是至少两种不同的金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶的依次作用制得，即通过分别在特定氨基酸之前或之后切割胶原蛋白分子的氨基酸序列的蛋白酶的依次作用制得。金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶有利地为来自于微生物枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和蜂蜜曲霉（Aspergillus melleus）的酶。
通过选择合适的内切蛋白酶不仅可以获得胶原蛋白水解物的特征性分子量分布，而且也可以影响水解物中包含的肽的末端处的氨基酸种类。就此而言，例如优选的是，胶原蛋白水解物的至少50%的N-端氨基酸为疏水性氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本发明还特别涉及胶原蛋白水解物用于刺激通过皮肤细胞生物合成细胞外基质蛋白的用途。皮肤细胞特别包括成纤维细胞，所述成纤维细胞尤其合成胶原蛋白（主要为I型）、弹性蛋白以及蛋白聚糖。这些蛋白以足够量形成对于皮肤的细胞外基质的建立或再生是决定性的，皮肤的细胞外基质又对于皮肤的性质例如张力和弹性及其水分平衡是非常决定性的。
皮肤细胞也包括角化细胞，所述角化细胞不仅负责皮肤最外层的角质化，而且负责毛发和指甲的形成。因此可以通过根据本发明使用的胶原蛋白水解物刺激这些细胞从而改进皮肤的屏障功能以及毛发和/或指甲的健康。
本发明的一个重要方面涉及胶原蛋白水解物用于提高皮肤的张力和/或减少皱纹形成的用途。皮肤的这些性质通常由于老化以及由于环境影响例如紫外线辐射或有毒物质而变差。由于基质蛋白胶原蛋白和弹性蛋白特别对皮肤的张力和弹性负责，可以通过受根据本发明使用的胶原蛋白水解物大幅刺激的所述基质蛋白的增加的合成来抵抗这些影响并且显著改进皮肤健康。
本发明的另一重要方面涉及胶原蛋白水解物用于提高皮肤的水分含量的用途。细胞外基质中包含的蛋白聚糖（例如多能蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和核心蛋白聚糖）（也证实其合成受根据本发明使用的胶原蛋白水解物刺激）对皮肤结合足够量的水分的能力做出巨大贡献。皮肤的水分含量也可以通过有害的环境影响例如紫外线辐射而降低，其中水分损失通常伴有皮肤的柔韧性降低、皲裂和过度角质化。
本发明的另一方面涉及胶原蛋白水解物用于改进皮肤的屏障功能的用途。所谓的CE-蛋白（“角质化包膜”-蛋白），尤其是外皮蛋白、兜甲蛋白和丝聚蛋白对屏障功能起重要作用，已证实它们的生物合成受低分子量的胶原蛋白水解物刺激。因此，通过根据本发明使用胶原蛋白水解物，改进了皮肤的水分损失的减少、屏障功能以及针对病原菌和有毒物质的天然保护。
根据本发明使用胶原蛋白水解物还额外导致皮肤区域内的抗氧化作用，由此可以降低例如由紫外线辐射或突变物质造成的DNA损伤（突变）的频率。这种突变构成细胞过早老化的原因并且因此促进皮肤的老化症状（张力降低、形成皱纹等），因此可以通过根据本发明的用途抑制所述过程。
根据本发明的优选的实施方案，胶原蛋白水解物用于经口摄入。在经口摄入时，胶原蛋白水解物通常通过血液循环比在局部应用时更有效地转运至作用位点，即特别是转运至皮肤细胞。此外，这种应用形式对于使用者来说通常不费事。
胶原蛋白水解物优选以营养增补剂的形式使用。胶原蛋白水解物在此通常用于在一般保健的意义上改进皮肤健康或者也用于美容应用；这种营养增补剂可被称为“营养食品”或“营养美容品”。但是在本发明的范围内，例如在存在特应性皮炎时（其中患者具有干燥皲裂皮肤的趋势增加），胶原蛋白水解物用于治疗临床病症的用途也是可能的。
营养增补剂可以几乎以任意形式提供，例如以片剂、胶囊、糖衣片剂、锭剂或溶液（例如在单个安瓿中或在饮料中）的形式。
胶原蛋白水解物也可以被包含在食品或高档食品中，例如甜食或用于配制饮料的速溶粉中。因此，水解物可以在正常营养的过程中被使用者摄入而无需额外的花费（所谓的“功能食物”）。就此而言特别有利的是，胶原蛋白水解物基本上是无味的。
有利的是，每日摄入约1.5至5g，优选约2至3g，进一步优选约2.3至2.7g胶原蛋白水解物。已经表明，通过经口摄入所述量的水解物在数周内即可显著改进皮肤健康。
本发明的另一优选实施方案涉及胶原蛋白水解物的局部应用，即以美容产品的形式应用从而施用在皮肤、毛发和/或指甲上。胶原蛋白水解物在此可以被特别包含在乳霜、膏剂、洗剂或凝胶中。还有利的是，胶原蛋白水解物例如以约5至10重量%的量被添加到身体护理产品，例如沐浴凝胶或洗发剂。
根据如下实施例参考附图更详细地描述本发明的这些和其他优点。附图分别显示了：
图1A至1C：与I型胶原蛋白、双糖链蛋白聚糖或多能蛋白聚糖的合成的刺激相关的图；
图2A和2B：与无毛小鼠的皮肤水分的提高相关的图；
图3：与CE-蛋白的合成的刺激相关的图；
图4A至4C：不同胶原蛋白水解物的MALDI-质谱；和
图5A和5B：与I型胶原蛋白、核心蛋白聚糖和多能蛋白聚糖的合成的刺激相关的图。
具体实施方式
1.胶原蛋白水解物的制备和性质
为了制备根据本发明的胶原蛋白水解物，使用猪皮明胶（A型，200至250g Bloom）的浓度为20至40重量%（干物质）的水溶液作为起始材料。明胶通过两种不同的微生物来源的内切蛋白酶在50至60°C下依次作用120至180分钟进行酶促水解，其中使用枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的内切蛋白酶作为第一种酶，并且使用地衣芽孢杆菌的内切蛋白酶作为第二种酶。然后使酶热灭活并将溶液喷雾干燥。
所得胶原蛋白水解物的分子量分布可以通过凝胶渗透色谱法使用如下参数确定：
固定相：TSK 2000 SW XL（Tosoh Bioscience股份有限公司）
移动相：0.4mol/l磷酸二氢钠pH5.3
流速：0.5ml/min
校准标样：限定的I型胶原蛋白片段（FILK，Freiberg）
检测：UV-检测器Knauer K-2501，在214nm下
确定得到根据下表1所示的根据本发明的胶原蛋白水解物（在下文中称为低分子量水解物）的分子量分布。为了对比，表1中也给出用相同方法确定的市售获得的胶原蛋白水解物（在下文中称为高分子量水解物）的分子量分布：
表1
MW-范围 低分子量水解物 高分子量水解物
＞7500Da ＜5重量% ＜10重量%
3500-7500Da 约12-18重量% 约25-35重量%
1500-3500Da 约25-31重量% 约29-35重量%
500-1500Da 约40-46重量% 约24-30重量%
＜500Da 约5-10重量% 约2-5重量%
该低分子量水解物的羟基脯氨酸含量为约12至13重量%，并且可以在用氯胺-T氧化并用对二甲基氨基苯甲醛转化之后通过光度法确定。水解物的大于50%的N-端氨基酸为疏水性氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
2.细胞外基质蛋白的合成的刺激
在人类真皮成纤维细胞（皮肤细胞）上体外研究胶原蛋白（I型）以及蛋白聚糖双糖链蛋白聚糖和多能蛋白聚糖的合成的刺激。为此，分别用0.5mg/ml低分子量或高分子量水解物温育细胞24小时，然后通过实时PCR确定胶原蛋白-RNA、双糖链蛋白聚糖-RNA和多能蛋白聚糖-RNA的表达，并进行半定量（基于无水解物的对照样）评估。
结果以柱状图的形式表示，图1A中为I型胶原蛋白，图1B中为双糖链蛋白聚糖，图IC中为多能蛋白聚糖，其中图分别显示至少18次测量的平均值。横坐标表示相对于对照样（=1）的RNA-表达。左侧实心柱分别表示对照样，中间影线柱表示高分子量水解物（作为对比），右侧点状柱表示低分子量水解物（根据本发明）。
图中显示，所有三种基质蛋白的合成均受两种胶原蛋白水解物刺激，其中相比于高分子量水解物，低分子量水解物的积极效果分别更为突出。对于除了弹性蛋白之外对皮肤的张力和弹性主要负责的胶原蛋白以及对于对皮肤的水分平衡起重要作用的多能蛋白聚糖，低分子量水解物的增强效果特别显著。
3.皮肤的水分含量的提高
在无毛小鼠上直接研究胶原蛋白水解物对皮肤水分的影响。无毛小鼠是建立的模型体系，所述模型体系常常被用于皮肤病学研究，并且由此获得的知识原则上可以转用于人类皮肤（参见例如T.Fujimura等人，J.Dermatol.Sci.2000(24)105-111和Y.Nishimori等人，J.Invest.Dermatol.2001(117)1458-1463）。
在三周的时间段内每日用150μg胶原蛋白水解物/kg体重饲喂动物，相反，对照组接收BSA。同时，所有动物每周接收18mJ/cm2皮肤表面积的UV-B-辐射剂量，由此使皮肤水分受损。
在一周之后和三周之后用水分测试仪CM 825（Corneometer CM825）（生产商：Courage&Khazaka）测量皮肤的水分含量。测量原理在此基于由皮肤表层结合的水的介电常数引起的测量电容的容量变化，所述介电常数显著不同于大多数其他材料的介电常数。
结果以柱状图的形式表示，图2A中为一周后的测量结果，图2B中为三周后的测量结果，其中图分别显示7次测量的平均值和标准误差。横坐标表示相对于对照样（=1）的皮肤水分。左侧实心柱分别表示对照样，中间影线柱表示高分子量水解物（作为对比），右侧点状柱表示低分子量水解物（根据本发明）。
图中显示，相比于高分子量水解物，由低分子量水解物在一周和三周之后引起的皮肤水分的升高分别更强。这是根据本发明使用的水解物在改进皮肤健康方面的特别效力的进一步证明。
4.CE-蛋白的合成的刺激
所谓的“角质化包膜”-蛋白对皮肤针对病原菌和有毒物质入侵的屏障功能起重要作用。在无毛小鼠上确定CE-蛋白外皮蛋白、兜甲蛋白和丝聚蛋白的合成，在这之前将所述无毛小鼠每日用150μg胶原蛋白水解物/kg体重饲喂五周（如上所述）。从皮肤提取蛋白之后，通过SDS-聚丙烯酰胺-凝胶电泳和免疫印迹用特异性抗体进行相对于对照组（用BSA饲喂）的蛋白定量。
结果以柱状图的形式表示在图3中，其中图分别显示7次测量的平均值和标准误差。横坐标表示相对于对照样（=1）的用低分子量水解物饲喂之后的CE-蛋白的量。左侧柱表示外皮蛋白，中间柱表示兜甲蛋白和右侧柱表示丝聚蛋白。
图中显示，所研究的所有三种CE-蛋白的合成均受经口摄入根据本发明使用的胶原蛋白水解物的刺激，在外皮蛋白的情况下甚至超过三倍。
5.胶原蛋白水解物的抗氧化作用
在无细胞体系中通过丙二醛试验确定低分子量胶原蛋白水解物的抗氧化作用。
在此显示，活性氧物质的形成由于胶原蛋白水解物而平均减少约7%。由此可以减少皮肤区域内DNA损伤的频率，从而可以通过根据本发明的用途抵抗老化症状。
6.通过MALDI-MS分析分子量分布
将根据实施例1制备的根据本发明的具有约2000Da的平均分子量的低分子量胶原蛋白水解物（在下文中称为水解物A）与市售获得的平均分子量为约2100Da（在下文中称为水解物B）和约2900Da（在下文中称为水解物C）的两种胶原蛋白水解物进行比较。
通过MALDI-质谱法（MALDI-MS）分析这三种水解物的精确的分子量分布。为此，将样品在0.1%的三氟乙酸中调节至10μg/μl的最终浓度，然后通过使用μC18材料进行纯化。用HCCA-基质将样品制备在MALDI-靶标上并通过使用Ultraflex-III-TOF/TOF-质谱仪（生产商：Bruker Daltonics）确定质谱。
图4A至4C显示了胶原蛋白水解物A、B或C的相应的质谱或分子量分布，其中纵坐标表示分子量或质量数，横坐标表示强度。三个质谱的对比表明，根据本发明的水解物A包含根据表2的如下特征肽，其中相应的峰具有相比于其周围两倍至四倍的强度：
表2
约656Da
约825Da
约1014Da
约1211Da
约1927Da
约2410Da
约3433Da
特别地，600和1500Da之间的四种肽在两种市售水解物B和C中没有等同物，因此是水解物A特别特征性的。
7.细胞外基质蛋白的合成的刺激
在人类真皮成纤维细胞（皮肤细胞）上体外研究胶原蛋白（I型）以及蛋白聚糖核心蛋白聚糖和多能蛋白聚糖的合成的刺激。为此，分别用0.5mg/ml水解物A、B或C温育细胞24小时，然后通过实时PCR确定胶原蛋白-RNA、核心蛋白聚糖-RNA和多能蛋白聚糖-RNA的表达并进行半定量评估。核心蛋白聚糖对皮肤中胶原蛋白纤维的形成起重要作用。
结果以柱状图的形式表示，图5A中为水解物B，图5B中为水解物C，其中横坐标分别表示相对于根据本发明的水解物的RNA-表达A（=1）的市售水解物B或C的RNA-表达。左侧柱分别表示I型胶原蛋白，中间柱表示核心蛋白聚糖和右侧柱表示多能蛋白聚糖。分别显示至少7次测量的平均值以及标准误差。
数据有趣地表明，在所有三种基质蛋白的情况下，相比于水解物A，由平均分子量仅略微更高的两种水解物B和C引起的对RNA-合成的刺激显著更少。由此看来，水解物A的特征肽对其有利效果起决定性作用。
8.食物（增补）产品和美容品的示例性制剂
下文给出根据本发明的胶原蛋白水解物的用途的一些示例性制剂，所述制剂当然可以以各种方式进行修改：
胶囊（营养增补剂）
Figure BDA00003192928500121
巧克力
Figure BDA00003192928500122
饮料
Figure BDA00003192928500123
洗发剂
Figure BDA00003192928500124
Figure BDA00003192928500131

Claims (20)

1.用于改进人类皮肤、毛发和/或指甲的健康的胶原蛋白水解物，其特征在于，至少90重量%的胶原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且胶原蛋白水解物包含至少四种分子量在600和1200Da之间的特征肽。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白水解物，其中至少45重量%的胶原蛋白水解物具有小于1500Da的分子量。
3.根据权利要求1或2所述的胶原蛋白水解物，其中所述至少四种特征肽在通过MALDI-质谱法确定的分子量分布中具有相比于其周围至少两倍的强度，优选至少四倍的强度。
4.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物包含620和690Da之间的肽、790和860Da之间的肽、980和1050Da之间的肽以及1175和1245Da之间的肽。
5.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物还包含分子量在1500和3500Da之间的特征肽。
6.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物具有12重量%或更大的羟基脯氨酸比例。
7.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物通过明胶的酶促水解制得。
8.根据权利要求7所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物通过至少两种具有不同特异性的内切蛋白酶，特别是至少两种不同的金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶的依次作用制得。
9.根据权利要求8所述的胶原蛋白水解物，其中金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶选自来自于微生物枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和蜂蜜曲霉（Aspergillusmelleus）的酶。
10.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物的至少50%的N-端氨基酸为疏水性氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
11.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其用于刺激通过皮肤细胞生物合成细胞外基质蛋白。
12.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其用于提高皮肤的张力和/或较少皱纹形成。
13.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其用于提高皮肤的水分含量。
14.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其用于改进皮肤的屏障功能。
15.根据前述权利要求任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物用于经口摄入。
16.根据权利要求15所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物为营养增补剂。
17.根据权利要求15所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物被包含在食品或高档食品中。
18.根据权利要求15至17任一项所述的胶原蛋白水解物，其中每日摄入约1.5至5g，优选约2至3g，进一步优选约2.3至2.7g胶原蛋白水解物。
19.根据权利要求1至14任一项所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物用于局部应用。
20.根据权利要求19所述的胶原蛋白水解物，其中胶原蛋白水解物被包含在乳霜、膏剂、洗剂、凝胶或洗发剂中。
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