BR112013011894B1

BR112013011894B1 - hidrolisado de colágeno para usar para melhorar a saúde da pele humana, cabelos e/ou unhas

Info

Publication number: BR112013011894B1
Application number: BR112013011894A
Authority: BR
Inventors: Giesen-Wiese Monika; Oesser Steffen; Hausmanns Stephan
Original assignee: Gelita Ag
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2018-07-17
Also published as: US20130252899A1; EP2640352B1; AU2011331466A1; MX344236B; RU2577699C2; WO2012065782A2; CN103209678B; AU2011331466B2; CA2816900C; PL2640352T3; CN103209678A; KR101662004B1; ES2641922T3; KR20130102601A; DE102010060564A1; WO2012065782A3; RU2013127136A; EP2640352A2; CA2816900A1; BR112013011894A2

Description

(54) Título: HIDROLISADO DE COLÁGENO PARA USAR PARA MELHORAR A SAÚDE DA PELE HUMANA, CABELOS E/OU UNHAS (51) Int.CI.: A61K 8/65; A61Q 19/08 (30) Prioridade Unionista: 15/11/2010 DE 10 2010 060 564.6 (73) Titular(es): GELITA AG (72) Inventor(es): STEPHAN HAUSMANNS; MONIKA GIESEN-WIESE; STEFFEN OESSER

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para HIDROLISADO DE COLÁGENO PARA USAR PARA MELHORAR A SAÚDE DA PELE HUMANA, CABELOS E/OU UNHAS.

A presente invenção refere-se a um hidrolisado de colágeno para usar para melhorar a saúde da pele humana, cabelos e/ou unhas.

Há muito tempo sabe-se, que através da absorção oral de hidrolisado de colágeno podem ser obtidos efeitos vantajosos em relação à saúde da pele, mas também dos cabelos e/ou unhas do ser humano (vide, por exemplo, Vivian Zague: A new view concerning the effects of collagen hydrolysate intake on skin properties em Arch. Dermatol. Res. 2008 (9) 479483). Por uma melhora da saúde da pele nesse contexto, é entendida qualquer influência positiva das propriedades e funções naturais da pele, sendo que essas propriedades e funções podem ser consideradas tanto em consequência do envelhecimento, quanto também adicionalmente por diversas influências ambientais negativas. A absorção do hidrolisado de colágeno atua de forma vantajosa também sobre as propriedades da pele e/ou unhas.

O objetivo da invenção tem por base aumentar ainda mais os efeitos positivos de hidrolisado de colágeno sobre a saúde da pele, cabelos e/ou unhas e propor um hidrolisado de colágeno particularmente eficaz para esse uso.

Este objetivo é resolvido no caso do hidrolisado de colágeno do tipo supramencionado de acordo com a invenção pelo fato, de que pelo menos 90% em peso, do hidrolisado de colágeno apresentam um peso molecular inferior a 3.500 Da e que o hidrolisado de colágeno compreende pelo menos quatro peptídeos característicos com um peso molecular entre 600 e 1.200 Da.

Os hidrolisados de colágeno contêm peptídeos com diferentes comprimentos de cadeia ou pesos moleculares, que se formam na dissociação das cadeias de proteínas do colágeno, em que as distribuições de pesos moleculares desses peptídeos, dependendo das condições de produção do hidrolisado, podem se distinguir nitidamente. Foi mostrado surpreendentemente, agora, que um hidrolisado de colágeno com as propriedades supra

2/14 mencionadas sobdiferentes aspectos atua de forma particularmente vantajosa sobre a saúde da pele, isto é, mostra resultados nitidamente melhores do que os hidrolisados de colágeno usados até agora, que contêm uma porção substancialmente menor de peptídeos de baixo peso molecular e/ou não contêm os peptídeos característicos.

A distribuição do peso molecular do hidrolisado de colágeno, que serve de base ao valor limite de pelo menos 90% em peso, abaixo de 3.500 Da pode ser determinada de forma muito precisa e reproduzível, por exemplo, por meio de uma cromatografia de permeação em gel usando um padrão de calibração de fragmentos de colágeno definidos.

Preferencialmente, pelo menos 45% em peso, do hidrolisado de colágeno apresentam um peso molecular de menos de 1.500 Da, isto é, uma certa porção dos peptídeos do hidrolisado de colágeno é particularmente de cadeia curta. Foi mostrado, que através dessas porções de peso molecular particularmente baixo, que estão contidas somente em quantidade substancialmente menor nos hidrolisados de colágenos atualmente usados, é possível obter efeitos pronunciados sobre a saúde da pele.

O peso molecular médio (média de peso M_w) do hidrolisado de colágeno usado de acordo com a invenção, encontra-se tipicamente na faixa de cerca de 1.700 até cerca de 2.300 Da.

A presença dos peptídeos característicos do hidrolisado de colágeno, que de maneira interessante contribuem substancialmente para sua eficácia, pode ser determinada, em particular, por meio da espectroscopia de massa MALDI, em que os peptídeos característicos surgem no espectro de massa como picos. Preferencialmente, os pelo menos quatro peptídeos característicos em uma distribuição de peso molecular determinada por meio da espectroscopia de massa MALDI apresentam uma intensidade pelo menos dupla, mais preferencialmente uma intensidade pelo menos quádrupla em comparação com seu meio.

Em uma forma de concretização preferida da invenção, o hidrolisado de colágeno compreende um peptídeo entre 620 e 690 Da, um peptídeo entre 790 e 860 Da, um peptídeo entre 980 e 1.050 Da e um peptídeo

3/14 entre 1.175 e 1.245 Da. Esses peptídeos distinguem o hidrolisado de colágeno de acordo com a invenção de maneira característica dos hidrolisados de colágeno conhecidos.

O hidrolisado de colágeno pode apresentar adicionalmente também peptídeos característicos entre 1.500 e 3.500 Da, que representam, do mesmo modo, uma característica distintiva em relação aos hidrolisados de colágeno de acordo com o estado da técnica.

Preferencialmente, o hidrolisado de colágeno apresenta uma porção de hidroxiprolina de 12% em peso ou mais. O aminoácido hidroxiprolina formado através de hidroxilação pós-translacional de prolina ocorre exclusivamente em colágenos, de modo que uma alta porção de hidroxiprolina no hidrolisado de colágeno representa uma medida para a ampla ausência de outras proteínas do tecido conjuntivo (por exemplo, elastina e proteoglicanos), cujos fragmentos, dependendo do processo de produção, também podem estar presentes em certas quantidades em hidrolisados de colágeno.

É vantajoso, que o hidrolisado de colágeno é produzido através de hidrólise enzimática de gelatina. A gelatina compreende colágeno desnaturado e é obtida por meio de diversos processos conhecidos pelo especialista a partir do tecido conjuntivo ou a partir de ossos de diversas espécies animais. No contexto da presente invenção, a gelatina usada como material de partida para o hidrolisado de colágeno é preferencialmente obtida da pele de mamíferos, em particular, de pele de porco ou do tecido conjuntivo de bovinos, mas, onde também, não é excluído o uso de gelatina de asas.

A hidrólise enzimática da gelatina é efetuada, via de regra, através de pelo menos uma endoprotease, sendo que no contexto da invenção é preferível usar várias endoproteases (isto é, pelo menos duas diferentes endoproteases) para, por esse meio, influenciar de forma correspondente o perfil do aminoácido do hidrolisado de colágeno resultante e aumentar o efeito positivo do hidrolisado de colágeno sobre a saúde da pele, cabelos e/ou unhas.

De acordo com uma forma de concretização preferida da invenção, o hidrolisado de colágeno é produzido através da ação sucessiva de

4/14 pelo menos duas endoproteases com uma diferente especificidade, em particular, por pelo menos duas diferentes metaloproteases e/ou serinaproteases, isto é, por proteases, que dissociam a sequência de aminoácidos das moléculas de colágeno em cada caso antes, respectivamente, depois de determinados aminoácidos. De maneira vantajosa, no caso das metaloproteases e/ou serinaproteases, trata-se de enzimas dos micro-organismos Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus oryzae e Aspergillus melleus.

Através da seleção de endoproteases adequadas, é possível obter não só a distribuição característica do peso molecular do hidrolisado de colágeno, mas sim, o tipo dos aminoácidos nas extremidades dos peptídeos obtidos no hidrolisado também é influenciado. A esse respeito é preferível, por exemplo, se pelo menos 50% dos aminoácidos N-terminais do hidrolisado de colágeno são aminoácidos hidrófobos, em particular, alanina, leucina e isoleucina.

A invenção se refere, em particular, também ao uso do hidrolisado de colágeno para estimular a biossíntese de proteínas de matriz extracelular através das células da pele. As células da pele compreendem, em particular, fibroblastos que, entre outros, sintetizam colágeno (principalmente do tipo I), elastina, bem como proteoglicanos. A formação dessas proteínas em quantidade suficiente é decisiva para a estruturação ou a regeneração da matriz extracelular da pele, que por seu lado, é essencialmente determinante para as propriedades da pele, tais como tonicidade e elasticidade, bem como sua umidade.

Às células da pele são incluídos também os queratócitos, que são responsáveis tanto pela queratinização da camada externa da pele, quanto também pela formação de cabelos e unhas. Assim, uma estimulação dessas células pelo hidrolisado de colágeno usado de acordo com a invenção, pode causar uma melhora da função de barreira da pele, bem como da saúde dos cabelos e/ou unhas.

Um aspecto essencial da invenção se refere ao uso do hidrolisado de colágeno para aumentar a força de tensão da pele e/ou diminuir a

5/14 formação de rugas. Essas propriedades da pele pioram, via de regra, condicionadas pela idade, bem como em conseqüência de influências ambientais, tais como, por exemplo, radiação UV ou substâncias tóxicas. Visto que especialmente as proteínas matriz colágeno e elastina são responsáveis pela tonicidade e elasticidade da pele, através de sua múltipla síntese, que é estimulada em grau particular pelo hidrolisado de colágeno usado de acordo com a invenção, essas podem reagir contra esses efeitos e melhorar nitidamente a saúde da pele.

Um outro aspecto importante da invenção se refere ao uso do hidrolisado de colágeno para aumentar o teor de umidade da pele. Uma contribuição essencial para a capacidade da pele, de formar quantidades suficientes de umidade, é prestada pelos proteoglicanos contidos na matriz extracelular (por exemplo, versican, biglican e decorin), cuja síntese também é comprovadamente estimulada pelo hidrolisado de colágeno usado de acordo com a invenção. O teor de umidade da pele também pode ser reduzido através de influências ambientais prejudiciais, tal como a radiação UV, em que a perda de umidade ocorre frequentemente com uma menor elasticidade, fissura e queratinização excessiva da pele.

Um outro aspecto importante da invenção se refere ao uso do hidrolisado de colágeno para melhorar a função de barreira da pele. Um papel essencial para essa função de barreira têm as assim mencionadas proteínas CE (proteínas cornified envelope), entre outras, involucrin, loricrin e filagrin, cuja biossintese é comprovadamente estimulada peio hidrolisado de colágeno de baixo peso molecular. Assim, através do uso de acordo com a invenção de hidrolisado de colágeno, a diminuição da perda de umidade, a função de barreira, bem como, a proteção natural da pele contra germens patogênicos e substâncias tóxicas, melhora.

O uso de acordo com a invenção do hidrolisado de colágeno leva adicionalmente também a um efeito antioxidante na região da pele, com o que a frequência de danos de DNA (mutações) pode ser reduzida, por exemplo, através de radiação UV ou de substâncias mutagênicas. Tais mutações representam uma das origens para o envelhecimento prematuro de

6/14 células e promovem, com isso, sinais de envelhecimento da pele (diminuição da tonicidade, formação de rugas e assim por diante), de modo que esse procedimento pode ser inibido pelo uso de acordo com a invenção.

De acordo com uma forma de concretização preferida da invenção, o hidrolisado de colágeno é previsto para uma ingestão oral. Na ingestão oral, resulta frequentemente um transporte mais eficaz do hidrolisado de colágeno através da circulação sanguínea até o local da ação, isto é, em particular, às células da pele, do que em uma aplicação tópica. Além disso, essa forma de aplicação para o usuário está associada, via de regra, com um gasto substancialmente menor.

Preferencialmente, o hidrolisado de colágeno é usado como suplemento alimentar. O hidrolisado de colágeno serve, nesse caso, via de regra, para melhorar a saúde da pele no sentido de uma prevenção de saúde geral ou também como uma aplicação cosmética; tais suplementos alimentares podem se designados como nutracêuticos ou nutricosméticos. Mas o uso do hidrolisado de colágeno para o tratamento de um quadro clínico no contexto da presente invenção, também é possível, assim, por exemplo, na presença de uma dermatite atópica, na qual os pacientes têm uma alta tendência à pele seca, rachada.

O suplemento alimentar pode ser oferecido em forma quase arbitrária, por exemplo, na forma de comprimidos, cápsulas, drágeas, pastilhas ou também de uma solução (por exemplo, em ampolas individuais ou em bebidas).

O hidrolisado de colágeno também pode estar alternativamente contido em um alimento ou em produtos relacionados, por exemplo, em doces ou em um pó instantâneo para a preparação de bebidas. Dessa maneira, o hidrolisado pode ser tomado pelo consumidor sem gasto adicional no âmbito de uma dieta normal (o chamado alimento funcional). Nesse contexto é particularmente vantajoso, que o hidrolisado de colágeno tenha um sabor essencialmente neutro.

É vantajoso, que seja prevista uma ingestão diária de cerca de 1,5 a 5 g, preferencialmente de cerca de 2 a 3 g, mais preferencialmente de

7/14 cerca de 2,3 a 2,7 g do hidrolisado de colágeno. Foi mostrado, que através da ingestão oral dessa quantidade de hidrolisado, a saúde da pele pode ser notadamente melhorada já dentro de poucas semanas.

Uma outra forma de concretização da invenção se refere à aplicação tópica do hidrolisado de colágeno, isto é, à aplicação na forma de produtos cosméticos para aplicar sobre a pele, os cabelos e/ou as unhas. O hidrolisado de colágeno, nesse caso, pode estar contido, em particular, em um creme, uma pomada, uma loção ou em um gel. Também é vantajoso, que o hidrolisado de colágeno seja acrescentado a um produto para o cuidado do corpo, tal como, por exemplo, em um gel de banho ou em um xampu para cabelos, por exemplo, em uma quantidade de cerca de 5 a 10% em peso.

Essa e outras vantagens da invenção são detalhadamente descritas com base nos seguintes exemplos com referência às figuras. Individualmente mostram:

as Figuras 1A até 1C: diagramas que se referem à estimulação da síntese de colágeno tipo I, biglican ou versican;

as Figuras 2A e 2B: diagramas que se referem ao aumento da umidade da pele em camundongos calvos;

a Figura 3: um diagrama que se refere à estimulação da síntese de proteínas CE;

a Figura 4A até 4C: espectros de massa MALDI de diversos hidrolisados de colágeno; e a Figura 5A e 5B: diagramas que se referem à estimulação da síntese de colágeno tipo I, decorin e versican.

Exemplos

1. Produção e propriedades do hidrolisado de colágeno

Para produzir um hidrolisado de colágeno de acordo com a invenção, utiliza-se como material de partida uma solução aquosa de uma gelatina de pele de porco (tipo A, 200 a 250 g de Bloom) com uma concentração de 20 a 40% em peso (substância seca). A gelatina é enzimaticamente hidrolisada através da ação sucessiva de duas diferentes endoproteases de

8/14 origem microbiana a 50 a 60°C durante 120 a 180 minutos, em que, como primeira enzima, é usada uma endoprotease de Bacillus subtilis ou de Bacillus amyloliquefaciens e como segunda enzima, uma endoprotease de Bacillus licheniformis. Em seguida, as enzimas são termicamente inativadas e a solução é secada por atomização.

A distribuição do peso molecular do hidrolisado de colágeno resultante pode ser determinada por meio de cromatografia de permeação em gel usando os seguintes parâmetros:

fase estacionária: TSK 2000 SW XL (Tosoh Bioscience GmbH) fase móvel: 0,4 mol/l de dihidrogenofosfato pH 5,3 taxa de fluxo: 0,5 ml/min padrão de calibração: fragmentos de colágeno tipo I definidos (FILK, Freiberb) detecção: detector UV Knauer K-2501 a 214 nm.

A determinação forneceu uma distribuição do peso molecular do hidrolisado de colágeno de acordo com a invenção (a seguir, designado como hidrolisado de baixo peso molecular) de acordo com a seguinte Tabela 1. Para comparar, na Tabela 1 também é indicada a distribuição do peso molecular de um hidrolisado de colágeno comercialmente disponível, que foi de20 terminado com o mesmo método (a seguir, designado como hidrolisado de peso molecular elevado):

Tabela 1

faixa de peso molecular	hidrolisado de baixo peso molecular	hidrolisado de peso molecular elevado
> 7.500 Da	< 5% em peso	<10% em peso
3.500 - 7.500 Da	cerca de 12-18% em peso	cerca de 25-35% em peso
1.500-3.500 Da	cerca de 25-31% em peso	cerca de 29-35% em peso
500-1.500 Da	cerca de 40-46% em peso	cerca de 24-30% em peso
< 500 Da	cerca de 5.10% em peso	cerca de 2-5% em peso

O teor de hidroxiprolina desse hidrolisado de baixo peso molecu9/14 lar importa em cerca de 12 a 13% em peso e pode ser fotometricamente determinado depois da oxidação com cloramina-T e reação com pdimetilamino-benzaldeído. Mais de 50% dos aminoácidos N-terminais do hidrolisado são aminoácidos hidrófobos, em particular, alanina, leucina e isoleucina.

2. Estimulação da síntese de proteínas de matriz extracelular

A estimulação da síntese de colágeno (tipo I) bem como dos proteoglicanos biglican e versican foi pesquisada in vitro em fibroblastos dérmicos humanos (células da pele). Para esse fim, as células foram incubadas durante 24 horas com 0,5 mg/ml cada do hidrolisado de baixo peso molecular ou de peso molecular elevado e, em seguida, a expressão de colágenoRNA, biglican-RNA e versican-RNA foi determina por meio de Realtime-PCR e avaliada semiquantitativamente (com base em um controle sem hidrolisado).

Os resultados são representados como diagramas de coluna para o colágeno tipo-l na figura 1A, para biglican na figura 1B e para versican na figura 1C, sendo que os diagramas mostram em cada caso o valor médio de pelo menos 18 medições. Na abscissa está registrada a expressão RNA relativamente ao controle (=1). A coluna esquerda enchida representa em cada caso o controle, a coluna do meio sombreada representa o hidrolisado de peso molecular elevado (como comparação) e a coluna direita pontilhada, o hidrolisado de baixo peso molecular (de acordo com a invenção).

Verificou-se, que a síntese de todas as três proteínas matriz é estimulada pelos dois hidrolisados de colágeno, sendo que o efeito positivo do hidrolisado de baixo peso molecular é em cada caso mais pronunciado do que aquele do hidrolisado de peso molecular elevado. No colágeno, que além da elastina, é responsável principalmente pela tonicidade e elasticidade da pele, bem como no versican, tem que um papel importante para manter a umidade da pele, o efeito pronunciado do hidrolisado de baixo peso molecular é particularmente nítido.

3. Aumento do teor de umidade da pele

A influência da umidade da pele através do hidrolisado de colá10/14 geno foi pesquisada diretamente em camundongos calvos. Camundongos calvos representam um sistema de modelo estabelecido, que é frequentemente usado em questões dermatológicas e os conhecimentos obtidos dessas podem ser transmitidos, em princípio, para a pele humana (vide, por exemplo, T. Fujimura etal.; J. Dermatol. Sei. 2000 (24) 105-111 e Y. Nishimori et al.; J. Invest. Dermatol. 2001 (117) 1458-1463).

Os animais foram alimentados durante um período de tempo de três semanas diariamente com 150 pg de hidrolisado de colágeno por kg de peso corporal, o grupo de controle, ao invés disso, recebeu BSA. Ao mesmo tempo, todos os animais receberam uma dose semanal de radiação UV-B de 18 mJ/cm² na superfície da pele, pelo que a umidade da pele é influenciada de forma negativa.

O teor de umidade da pele foi medida depois de uma semana e depois de três semanas com um corneômetro CM 825 (fabricante: Courage & Khazaka). O princípio de medição baseia-se, aqui, na alteração da capacidade de um condensador de medição através da constante de dieletricidade da água ligada nas camadas superiores da pele, que se distingue das constantes de dieletricidade da maioria das outras substâncias.

Os resultados são representados na Figura 2A como gráficos de coluna para a medição depois de uma semana e na Figura 2B para a medição depois de três semanas, em que os gráficos mostram em cada caso o vaior médio e o erro padrão de 7 medições. Na abscissa, a umidade da pele é traçada relativamente ao controle (=1). A coluna esquerda preenchida representa em cada caso o controle, a coluna do meio sombreada representa o hidrolisado de peso molecular elevado (como comparação) e a coluna direita pontilhada, o hidrolisado de baixo peso molecular (de acordo com a invenção).

Verifica-se, que o aumento da umidade da pele pelo hidrolisado de baixo peso molecular tanto depois de uma semana, quanto também depois de três semanas, é em cada caso maior do que pelo hidrolisado de peso molecular elevado. Esse é um outro resultado para a eficácia particular do hidrolisado usado de acordo com a invenção na melhora da saúde da pele.

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4. Estimulação da síntese de proteínas CE

As chamadas proteínas Cornified Envelope” têm um papel importante para a função de barreira da pele contra a penetração de germes patogênicos e substâncias tóxicas. A síntese das proteínas CE involucrin, loricrin e filaggrin foi determinada em camundongos calvos, que anteriormente foram alimentados durante cinco semanas diariamente com 150 pg de hidrolisado de colágeno por kg de peso corporal (tal como descrito acima). A quantificação das proteínas relativamente a um grupo de controle (alimentação com BSA) foi efetuada por meio de eletroforese em gel de SDSpoliacrilamida e Western-Blot com anticorpos específicos após a extração das proteínas da pele.

Os resultados são representados na Figura 3 como gráficos de coluna, em que o gráfico mostra em cada caso o valor médio e o erro padrão de 7 medições. Na abscissa, a quantidade das proteínas CE após a alimentação com o hidrolisado de baixo peso molecular é traçada relativamente ao controle (=1). A coluna esquerda representa Involucrin, a coluna do meio, Loricrin e a coluna direita representa Filaggrin.

Verifica-se, que a síntese de todas as três proteínas CE pesquisadas é estimulada pela absorção oral do hidrolisado de colágeno usado de acordo com a invenção, no caso de Involucrin, mesmo em mais do que o triplo.

5. Efeito antioxidante do hidrolisado de colágeno

O efeito antioxidante do hidrolisado de colágeno de baixo peso molecular foi determinado em um sistema livre de células por meio de um ensaio de malondiaideído.

Nesse caso, verifica-se, que a formação de espécies de oxigênio reativo é reduzida pelo hidrolisado de colágeno em média em torno de cerca de 7%. Na região da pele, com isso, a frequência de danos de DNA pode ser reduzida, de modo que é possível reagir contra os sinais de envelhecimento através do uso de acordo com a invenção.

6. Análise da distribuição do peso molecular por meio de MSMALDI

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O hidrolisado de colágeno de baixo peso molecular de acordo com a invenção, produzido conforme o exemplo 1, que apresenta um peso molecular médio de cerca de 2.000 Da (a seguir, hidrolisado A), foi confrontado com dois hidrolisados de colágeno comercialmente disponíveis com um peso molecular médio de cerca de 2.100 Da (a seguir, hidrolisado B) e cerca de 2.900 Da (a seguir, hidrolisado C).

As distribuições exatas do peso molecular desses três hidrolisados foram analisadas por meio de espectroscopia de massa MALDI (MSMALDI). Para esse fim, as amostras foram ajustadas em ácido trifluoracético a 0,1% para uma concentração final de 10 pg/μΙ e, em seguida, purificadas usando material pCi₈. As amostras foram preparadas com uma matrix HCCA em um alvo MALDI e os espectros de massa foram determinados usando um espectrômetro de massa Ultraflex-lll-TOF/TOF (fabricante: Bruker Daltonics).

As Figuras 4A até 4C mostram os correspondentes espectros de massa ou as distribuições do peso molecular dos hidrolisados de colágeno A, B ou C, sendo que o peso molecular ou o índice de massa está traçado na ordenada e na abscissa, a intensidade. Uma comparação dos três espectros mostra que o hidrolisado A de acordo com a invenção compreende os seguintes peptídeos característicos de acordo com a Tabela 2, sendo que os correspondentes picos apresentam uma intensidade dupla até quádrupla em comparação com seu meio:

Tabela 2

Em particular, os quatro peptídeos entre 600 e 1.500 Da não têm qualquer correspondências nos dois hidrolisados B e C comerciais e, dessa

13/14 maneira, são particularmente característicos para o hidrolisado A.

7. Estimulação da síntese de proteínas de matriz extracelular

A estimulação da síntese do colágeno (tipo I), bem como dos proteoglicanos decorin e versican foi pesquisada in vitro em fibroblastos dérmicos humanos (células da pele). Para isso, as células foram incubadas durante 24 horas em cada caso com 0,5 mg/ml dos hidrolisados A, B ou C e, em seguida, a expressão do colágeno-RNA, decorin-RNA e versican-RNA foi determinada por meio de realtime-PCR e avaliada semiquantitativamente. O Decorin tem um papel importante na formação das fibras de colágeno na pele.

Os resultados são representados como gráficos de colunas para o hidrolisado B na figura 5A e para o hidrolisado C na figura 5B, sendo que na abscissa é traçada em cada caso a expressão RNA nos hidrolisados B ou C comerciais relativamente à expressão RNA no hidrolisado A de acordo com a invenção (=1). A coluna esquerda representa em cada caso o colágeno do tipo I, a coluna do meio, decorin e a coluna direita representa versican. O valor médio de pelo menos 7 medições é representado em cada caso, bem como erro padrão.

De modo interessante, os dados mostram que em todas as três proteínas matriz realiza-se uma estimulação nitidamente menor da síntese de RNA em comparação com o hidrolisado A pelos dois hidrolisados B e C, cujo peso molecular médio é apenas insignificantemente mais elevado. Os peptídeos característicos do hidrolisado A parecem ter, assim, um papel decisivo para esse efeito vantajoso.

8. Receitas de exemplos de (suplementos) alimentares e cosméticos

A seguir, são indicadas algumas receitas exemplares para o uso do hidrolisado de colágeno de acordo com a invenção, que naturalmente podem ser modificadas de várias maneiras:

Cápsulas_(Suplementos alimentares) glicerina 53,67% em peso hidrolisado de colágeno 21,95% em peso

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gelatina	10,08% em peso 6,00% em peso 5,00% em peso 2,00% em peso 0,50% em peso 0,50% em peso 0,30% em peso 51,0% em peso
5	farinha de semente de guar lecitina ácido cítrico aroma (cassis) essência de laranja acesulfam-K Chocolate massa de cacau
10	sacarose	22,4% em peso
	manteiga de cacau	16,6% em peso
	hidrolisado de colágeno Bebida	10,0% em peso
	água	63,00% em peso
15	concentrado de aloe-vera	31,00% em peso
	hidrolisado de colágeno	4,00% em peso
	sacarose	1,50% em peso
	ácido cítrico	0,26% em peso
	aromas e corantes	0,24% em peso
20	sucralose Xamou	0,0031 %em peso
	água	58,8% em peso
	laureth-11-carboxilato de sódio	18,0% em peso
	cocoamidopropil-betaína	9,0% em peso
25	hidrolisado de colágeno	6,0% em peso
	PEG-6 capril/caproil-glicéride	3,0% em peso
	PEG-150 diestearato	2,5% em peso
	laureth-7	2,0% em peso
	sorbato de potássio	0,5% em peso
30	fragância	0,2% em peso

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Hidrolisado de colágeno para uso para melhorar a saúde de cabelo, unhas e/ou pele de ser humano, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de colágeno é produzido através de hidrólise enzimática de gela5 tina derivada de mamíferos ou aves pela ação consecutiva de pelo menos duas endoproteases com uma especificidade diferente a 50 a 60°C por 120 a 180 min, em que uma endoprotease de Bacillus subtilis ou de Bacillus amyloliquefaciens é usada como a primeira enzima e uma endoprotease de Bacillus licheniformis é usada como a segunda enzima,

10 em que pelo menos 90% em peso do hidrolisado de colágeno apresenta um peso molecular inferior a 3.500 Da, e em que o hidrolisado de colágeno compreende pelo menos quatro peptídeos característicos com um peso molecular entre 600 e 1.200 Da apresentando uma intensidade pelo menos dupla em comparação com seu

15 meio em uma distribuição de peso molecular determinada através de espectroscopia de massa MALDI, em que o espectro de massa foi determinado usando um espectrômetro de massa TOF/TOF com uma amostra do hidrolisado de colágeno tendo sido ajustada em ácido trifluoroacético a 0,1% para uma concentração final de 10 pg/pl, purificada usando material pCi₈ e prepa20 rada com uma matriz HCCA em um alvo MALDI.
2. Hidrolisado de colágeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 45% em peso, do hidrolisado de colágeno apresenta um peso molecular de menos de 1.500 Da.
3. Hidrolisado de colágeno de acordo com a reivindicação 1 ou

25 2, caracterizado pelo fato de que os pelo menos quatro peptídeos característicos em uma distribuição do peso molecular determinada por meio de espectroscopia de massa MALDI apresentam pelo menos uma intensidade quádrupla em comparação com seu meio.
4. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das 30 reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de colágeno compreende um peptídeo entre 620 e 690 Da, um peptídeo entre 790 e 860 Da, um peptídeo entre 980 e 1.050 Da e um peptídeo entre 1.175 e

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1.245 Da.
5. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de colágeno compreende outros peptídeos característicos com um peso molecular

5 entre 1.500 e 3.500 Da apresentando uma intensidade pelo menos dupla em comparação com seu meio em uma distribuição de peso molecular determinada através de espectroscopia de massa MALDI.
6. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de coláge10 no apresenta uma porção de hidroxiprolina de 12% ou mais.
7. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% dos aminoácidos N-terminais do hidrolisado de colágeno são aminoácidos hidrófobos, em particular, alanina, leucina e isoleucina.

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8. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para usar para a estimulação da biossíntese de proteínas de matriz extracelular através das células da pele.
9. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das

20 reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para usar para aumentar a tonicidade da pele e/ou para diminuir a formação de rugas.
10. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para usar para aumentar o teor de umidade da pele.

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11. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é para usar para melhorar a função de barreira da pele.
12. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de colá30 geno é previsto para uma ingestão oral.
13. Hidrolisado de colágeno de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de colágeno é um suplemento

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3/3 alimentar.
14. Hidrolisado de colágeno de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de colágeno está contido em um alimento ou produto relacionado.
15. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que está prevista uma ingestão diária de cerca de 1,5 a 5 g, preferencialmente cerca de 2 a 3 g, mais preferencialmente cerca de 2,3 a 2,7 g do hidrolisado de colágeno.
16. Hidrolisado de colágeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de colágeno está previsto para uma aplicação tópica.
17. Hidrolisado de colágeno de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de colágeno está contido em um creme, em uma pomada, em uma loção, em um gel ou em um xampu.

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