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Die vorliegende Erfindung betrifft Kollagenhydrolysat zur Verwendung als Wirkstoff, um die Alterung von Körperzellen bei Menschen oder Tieren zu verzögern.
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Die biologische Alterung des Körpers von Menschen oder Tieren steht einerseits im Zusammenhang mit äußeren Umwelteinflüssen, die sich über die Lebenszeit akkumulieren. Unabhängig von solchen Umwelteinflüssen besteht auf der Ebene der einzelnen Körperzellen aber auch ein genereller Zusammenhang zwischen der Alterung und einer sukzessiven Verkürzung der Telomere während der Lebenszeit. Telomere sind repetitive Abschnitte der DNA an den Enden der Chromosomen, die zunächst mit jeder Zellteilung kürzer werden. Diese Verkürzung kann teilweise durch das DNA synthetisierende Enzym Telomerase wieder ausgeglichen werden, wobei die Aktivität der Telomerase in verschiedenen Zelltypen sehr unterschiedlich ist. Wird eine bestimmte Länge der Telomere unterschritten, erfolgen keine weiteren Zellteilungen.
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Für den Alterungsprozess und damit die Lebenserwartung eines Organismus ist weniger die ursprüngliche Länge der Telomere relevant, als vielmehr die Telomer-Verkürzungsrate, die zum Beispiel als durchschnittliche Verkürzung der Telomere in Basenpaaren pro Lebensjahr angegeben werden kann (siehe K. Whittemore et al. in PNAS 116 (2019) 15122-15127).
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Es wird seit einiger Zeit nach Wirkstoffen gesucht, die der Verkürzung von Telomeren entgegenwirken, um auf diese Weise die Alterung von Körperzellen bei Menschen oder Tieren, und damit von Geweben, Organen und dem Körper insgesamt, zu verzögern. Solche Überlegungen betreffen insbesondere (aber nicht ausschließlich) die Alterung der Haut, da sich diese im besonderen Maße nach außen bemerkbar macht.
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Als entsprechende Wirkstoffe zur Verzögerung der Alterung wurden bereits verschiedene Pflanzenextrakte vorgeschlagen, beispielsweise von Pflanzen der Gattungen Astralagus und Cimicifuga in der
WO 2005/044179 A2 oder der Gattungen Dendropanax und Kappaphycus in der
WO 2018/139835 A1 .
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen effektiven Wirkstoff zur Verzögerung der Alterung von Körperzellen bei Menschen oder Tieren vorzuschlagen.
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Zur Lösung dieser Aufgabe wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Kollagenhydrolysat als entsprechender Wirkstoff vorgeschlagen. In Zellversuchen konnte gezeigt werden, dass Kollagenhydrolysat signifikant der Verkürzung von Telomeren entgegenwirkt und die Telomerase aktiviert, wie weiter unten im Einzelnen ausgeführt wird.
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Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Kollagenhydrolysat, um die Hautalterung zu verzögern. Diese äußerst sich typischerweise in Form von Faltenbildung, Verlust von Elastizität, Bildung von sogenannten Altersflecken usw. Die von der Wirkung des Kollagenhydrolysats betroffenen Körperzellen sind in diesem Fall Fibroblasten.
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Weitere Typen von Körperzellen, deren Alterung im Rahmen der Erfindung verzögert werden kann, sind andere Bindegewebszellen wie Osteoblasten und Chondrozyten, sowie Muskelzellen (Myozyten), Nervenzellen (Neuronen) und Zellen des Immunsystems.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Kollagenhydrolysat eine nicht-therapeutische Verwendung, d.h. insbesondere eine kosmetische Verwendung. Dies trägt der Tatsache Rechnung, dass die biologische Alterung des Körpers als natürlicher Prozess kein pathologischer Zustand ist, der im medizinischen Sinne therapiebedürftig wäre. Gleichwohl kann eine Verzögerung der Alterung zu einer Verbesserung der Lebensqualität beitragen.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Verwendung des Kollagenhydrolysats eine therapeutische Verwendung zur Vorbeugung und/oder Behandlung von altersbedingten Erkrankungen. Solche Erkrankungen, die mit einer Verkürzung der Telomere in Verbindung stehen, sind insbesondere Artherosklerose, chronische Lebererkrankungen, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen sowie bestimmte Erkrankungen der Nebenniere und der Milz. Weitere Erkrankungen, die mit zunehmendem Alter gehäuft auftreten, sind Osteoporose, Arthrose, Sarkopenie und Demenzerkrankungen wie z.B. Alzheimer.
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Bei der erfindungsgemäßen Verwendung wirkt das Kollagenhydrolysat bevorzugt der Verkürzung von Telomeren in den Körperzellen entgegen, und insbesondere senkt es die Telomer-Verkürzungsrate. Wie bereits erwähnt, korreliert die Telomer-Verkürzungsrate, zumindest bei einem Vergleich zwischen verschiedenen Spezies, mit der Lebenserwartung. Eine Senkung dieser Rate durch Kollagenhydrolysat konnte in den durchgeführten Zellversuchen bei humanen Fibroblasten explizit gezeigt werden.
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Das Kollagenhydrolysat kann im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung das Enzym Telomerase in den Körperzellen aktivieren. Auch dieser Effekt konnte in den Zellversuchen mit humanen Fibroblasten gezeigt werden. Die Aktivierung der Telomerase ist jedoch nicht notwendigerweise der einzige Wirkungsmechanismus, um einer Verkürzung der Telomere entgegenzuwirken.
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Für Kollagenhydrolysat sind zwar schon seit längerem positive physiologische Wirkungen bekannt, insbesondere im Zusammenhang mit Osteoporose oder Gelenkbeschwerden. Auf eine Interaktion von Kollagenhydrolysat mit den Telomeren gab es jedoch keinerlei Hinweise, so dass die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beobachtete Wirksamkeit durchaus überraschend ist.
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Je nachdem, ob es sich um eine nicht-therapeutische oder um eine therapeutische Verwendung des Kollagenhydrolysats handelt, kann das Kollagenhydrolysat im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Nahrungsergänzungsmittel oder als Arzneimittel verabreicht werden. In jedem Fall ist Kollagenhydrolysat ein gesundheitlich völlig unbedenkliches Produkt, von dem keine schädlichen Nebenwirkungen bekannt sind.
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Das Kollagenhydrolysat wird vorzugsweise oral verabreicht. Es ist bekannt, dass die Peptide des Kollagenhydrolysats selbst bei relativer hohen Molekulargewichten von bis zu 10.000 Da im Darm mindestens zu einem gewissen Anteil resorbiert werden. Oral verabreichtes Kollagenhydrolysat kann somit prinzipiell zu allen Körperzellen als Wirkungsort gelangen.
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Die konkrete Darreichungsform des Kollagenhydrolysats kann die eines Pulvers, einer Lösung, eines Gels, einer Tablette oder einer Kapsel sein.
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Die Tagesdosis des verabreichten Kollagenhydrolysats, insbesondere bei oraler Verabreichung, beträgt günstigerweise von ca. 0,5 bis ca. 20 g, bevorzugt von ca. 2 bis ca. 15 g, weiter bevorzugt von ca. 3 bis ca. 10 g, insbesondere in einer Tagesdosis von ca. 4 bis ca. 8 g.
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Das Kollagenhydrolysat als erfindungsgemäßer Wirkstoff weist typischerweise ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 15.000 Da auf, bevorzugt von 1.000 bis 8.000 Da, weiter bevorzugt von 1.500 bis 5.000 Da, am meisten bevorzugt von 1.800 bis 2.200 Da. Mit diesen Angaben ist stets das gewichtsmittlere Molekulargewicht gemeint, welches insbesondere durch Gelpermeationschromatographie bestimmt werden kann.
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Das Kollagenhydrolysat ist vorzugsweise durch enzymatische Hydrolyse eines kollagenhaltigen Ausgansmaterials hergestellt. Für diese Hydrolyse werden insbesondere Endopeptidasen oder Exopeptidasen mikrobiellen oder pflanzlichen Ursprungs eingesetzt. Durch geeignete Auswahl der Peptidasen und der Hydrolysebedingungen können Kollagenhydrolysate in dem jeweils gewünschten Molekulargewichtsbereich hergestellt werden.
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Das kollagenhaltige Ausgangsmaterial ist in der Regel ausgewählt aus Haut oder Knochen von Wirbeltieren, bevorzugt von Säugetieren oder Vögeln, und insbesondere aus der Haut von Rindern oder Schweinen (Rinderspalt bzw. Schweineschwarte). Alternativ kann das kollagenhaltige Ausgangsmaterial ausgewählt sein aus Haut, Knochen und/oder Schuppen von Fischen, insbesondere Kalt- oder Warmwasserfischen.
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Kollagenhydrolysat kann aber auch aus wirbellosen Tieren als Ausgangsmaterial gewonnen und im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise können Kollagenhydrolysate aus Weichtieren oder aus Quallen hergestellt werden.
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Das Kollagenhydrolysat kann entweder in einem einstufigen Verfahren aus diesen Ausgangsmaterialien hergestellt sein oder über die Zwischenstufe Gelatine, wobei in diesem Fall sowohl Gelatine vom Typ A als auch vom Typ B verwendet werden kann.
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Vorzugsweise ist das Kollagenhydrolysat durch die nacheinander folgende Einwirkung von mindestens zwei Endoproteasen mit einer unterschiedlichen Spezifität, insbesondere von mindestens zwei verschiedenen Metalloproteasen und/oder Serinproteasen, hergestellt, d.h. von Proteasen, die die Aminosäuresequenz der Kollagenmoleküle jeweils vor bzw. hinter bestimmten Aminosäuren spalten. Günstigerweise handelt es sich bei den Metalloproteasen und/oder Serinproteasen um Enzyme aus den Mikroorganismen Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus oryzae und Aspergillus melleus.
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Durch die Auswahl geeigneter Endoproteasen kann nicht nur eine bestimmte Molekulargewichtsverteilung des Kollagenhydrolysats erhalten werden, sondem es wird auch die Art der Aminosäuren an den Termini der in dem Hydrolysat enthaltenen Peptide beeinflusst. In dieser Hinsicht ist es z.B. bevorzugt, wenn mindestens 50% der N-terminalen Aminosäuren des Kollagenhydrolysats hydrophobe Aminosäuren sind, insbesondere Alanin, Leucin und Isoleucin.
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Alternativ zur enzymatischen Hydrolyse kann das Kollagenhydrolysat im Rahmen der Erfindung durch rekombinante Genexpression hergestellt sein. Durch den Einsatz von natürlichen Kollagensequenzen, insbesondere aus Rindern oder Schweinen, und deren Expression in gentechnisch modifizierten Zellen (z.B. Hefen, Bakterien oder Pflanzenzellen, insbesondere Tabak) können Produkte hergestellt werden, die mit den Hydrolyseprodukten der entsprechenden kollagenhaltigen Rohstoffe im Wesentlichen identisch sind. Dabei ist es möglich, eine engere bzw. exakt vorgegebene Molekulargewichtsverteilung zu erhalten.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Kollagenhydrolysat in Kombination mit mindestens einem weiteren Wirkstoff verabreicht, der einer Verkürzung von Telomeren in den Körperzellen entgegenwirkt. Durch eine solche Kombination können unter Umständen noch stärkere Effekte erzielt werden.
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Der mindestens eine weitere Wirkstoff, der einer Verkürzung von Telomeren entgegenwirkt, ist bevorzugt ausgewählt aus Pflanzenextrakten von Pflanzen der Gattungen Astralagus (Tragant), Cimicifuga (Silberkerzen), Dendropanax und Kappaphycus.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Kollagenhydrolysat in einer Zusammensetzung verabreicht, die außer dem Kollagenhydrolysat keine weiteren Wirkstoffe enthält. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die verabreichte Zusammensetzung im Wesentlichen vollständig aus dem Kollagenhydrolysat besteht.
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Sofern das Kollagenhydrolysat nicht als alleiniger Wirkstoff eingesetzt wird, kann es gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit einer oder mehreren weiteren Komponenten kombiniert werden (z.B. in einem Nahrungsergänzungsmittel oder Arzneimittel), die einen positiven physiologischen Effekt aufweisen. Solche Komponenten sind bevorzugt ausgewählt aus Vitamin C, Vitaminen der B-, D-, E- und K-Reihe, konjugierten Linolensäuren, Coffein und dessen Derivaten, Guaranäextrakt, Grünteeextrakt, Epigallocatechingallat, Kreatin, L-Carnitin, L-Citrullin, L-Arginin, α-Liponsäure, N-Acetylcystein, NADH, D-Ribose, Magnesiumaspartat, Antioxidantien wie Anthocyane, Carotinoide, Flavonoide, Resveratol, Glutathion, Superoxiddismutase und Xanthane wie Mangiferin, Mineralstoffen wie Eisen, Magnesium, Calcium, Zink, Selen und Phosphor, sowie weiteren Proteinen, Hydrolysaten oder Peptiden wie Soja-, Weizen- oder Molkenprotein.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Verzögern der Alterung von Körperzellen bei Menschen oder Tieren, umfassend die Verabreichung von Kollagenhydrolysat an einen Menschen oder an ein Tier. Vorteile und bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens wurden bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Kollagenhydrolysat beschrieben.
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Die Wirksamkeit von Kollagenhydrolysat gegen die Verkürzung von Telomeren wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
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Beispiele
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Die im Folgenden beschriebenen in-vitro-Untersuchungen an humanen Fibroblasten zu den Auswirkungen von Kollagenhydrolysat auf die Telomerlänge und die Aktivität der Telomerase wurden durchgeführt von der Fa. Life Length in Madrid, Spanien.
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1. Effekt von Kollaaenhvdrolvsat auf die Telomerlänae
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1.1 Zellkulturen
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Alle Untersuchungen wurden an Zellkulturen von adulten humanen Fibroblasten durchgeführt. Die Aussaat erfolgte jeweils mit 2.000 Zellen pro cm2 in High-Glucose-DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 1.000 U/ml Streptomycin. Das Medium wurde alle 2 bis 3 Tage ersetzt, und die Zellen wurden alle 4 bis 5 Tage bei einer Konfluenz von 70 bis 80% passagiert.
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Parallel zu den Zellkulturen unter Standardbedingungen wurden auch Zellkulturen unter oxidativen Bedingungen untersucht, bei denen das o.g. Kulturmedium zusätzlich 10 µM H2O2 enthielt.
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1.2 Kollagenhydrolysat
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Das für die Untersuchungen verwendete Kollagenhydrolysat (KH) wird von der Anmelderin unter der Bezeichnung VERSIOL® vertrieben. Es wird durch enzymatische Hydrolyse aus Schweineschwartengelatine vom Typ A hergestellt und hat ein mittleres Molekulargewicht von etwa 2.000 Da.
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Die Effekte des Kollagenhydrolysats wurden über einen weiten Konzentrationsbereich untersucht. Hierzu wurden jeweils Zellkulturen geführt (sowohl unter Standard- als auch oxidativen Bedingungen), bei denen das Kulturmedium mit 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml, 1 mg/ml oder 10 mg/ml Kollagenhydrolysat versetzt war. Kontrollansätze waren jeweils ohne Zusatz von Kollagenhydrolysat.
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1.3 Populationsverdopplung
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Die Zellkulturen wurden über einen Zeitraum von 8 Wochen geführt, wobei wöchentlich die Populationsverdopplung (PD) pro Passage bestimmt wurde.
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Die kumulative PD ist in den folgenden Tabellen für Standardbedingungen und für oxidative Bedingungen angegeben: Kumulative PD pro Passage unter Standardbedingungen:
| KH [mg/ml] | 0 | 0,01 | 0,1 | 1 | 10 |
| Woche 1 | 3,2 | 2,9 | 2,6 | 3,4 | 2,6 |
| Woche 2 | 6,7 | 6,5 | 6,8 | 6,8 | 6,2 |
| Woche 3 | 10,2 | 9,7 | 10,1 | 10,3 | 9,5 |
| Woche 4 | 13,5 | 13,2 | 13,9 | 13,7 | 12,6 |
| Woche 5 | 16,8 | 16,2 | 16,8 | 16,5 | 15,9 |
| Woche 6 | 19,5 | 18,4 | 19,7 | 19,5 | 18,7 |
| Woche 7 | 23,1 | 22,5 | 23,2 | 23,2 | 22,5 |
| Woche 8 | 25,2 | 24,7 | 25,2 | 24,8 | 24,5 |
Kumulative PD pro Passage unter oxidativen Bedingungen:
| KH [mg/ml] | 0 | 0,01 | 0,1 | 1 | 10 |
| Woche 1 | 3,2 | 2,9 | 2,9 | 2,7 | 2,7 |
| Woche 2 | 6,2 | 5,9 | 6,2 | 5,4 | 6,0 |
| Woche 3 | 9,2 | 8,9 | 9,5 | 8,7 | 8,5 |
| Woche 4 | 8,7 | 11,9 | 12,3 | 12,6 | 11,4 |
| Woche 5 | 13,6 | 13,5 | 14,3 | 14,3 | 13,2 |
| Woche 6 | 15,3 | 16,7 | 16,9 | 14,4 | 14,7 |
| Woche 7 | 18,1 | 20,0 | 20,0 | 16,5 | 18,2 |
| Woche 8 | 19,8 | 21,0 | 21,0 | 17,5 | 19,5 |
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Erwartungsgemäß ist die Populationsverdopplung unter oxidativen Bedingungen durchgehend geringer als unter Standardbedingungen. Die Anwesenheit von Kollagenhydrolysat hat hingegen keinen signifikanten Einfluss auf die PD, d.h. das Zellwachstum an sich wird durch Kollagenhydrolysat nicht beeinflusst.
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1.4 Bestimmung der Telomerlängen und -Verkürzungsraten
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Die Bestimmung der Telomerlängen erfolgt mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Hierfür wird eine fluoreszenzmarkierte Peptid-Nukleinsäure-Sonde verwendet, die mit drei repetitiven Telomersequenzen hybridisiert. Die Fluoreszenzintensität eines gegebenen Telomers ist proportional zu dessen Länge, wobei eine Quantifizierung mit Hilfe von Kontrollzellen mit bekannter Telomerlänge erfolgt.
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Bei allen untersuchten Zellkulturen erfolgte die Bestimmung der Telomerlängen jeweils nach 4 Wochen und nach 8 Wochen, sowie für den Kontrollansatz zu Beginn der Kultivierung (Woche 0). Die Zellen wurden fixiert und mit Pepsin aufgeschlossen, wobei pro Zeitpunkt und Zellkultur jeweils fünf Zellaufschlüsse durchgeführt wurden. Die DNA wurde mit 4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) eingefärbt und die Hybridisierung der Telomere mit der Sonde durchgeführt.
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Anschließend wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop die mit DAPI gefärbten Zellkerne lokalisiert und die Fluoreszenz der hybridisierten Telomere quantitativ erfasst, wobei für jeden Ansatz (Zellaufschluss) 15 verschiedene Bildausschnitte ausgewertet wurden. Die Telomerlängen und deren Verteilung wurden mit einer entsprechenden Software berechnet und unter Verwendung von Students t-Test statistisch analysiert.
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1.5 Ergebnisse
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1.5.1 Telomerlängen
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Aus den fluoreszenzmikroskopisch gewonnenen Daten wurden für jede Zellkultur nach 4 Wochen und nach 8 Wochen der Medianwert der Telomerlänge, die 20. Perzentile (jeweils in Kilobasenpaaren, kbp) sowie der Anteil an „kurzen Telomeren“ (weniger als 3 kbp) berechnet. Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen dargestellt. Angegeben ist jeweils auch der p-Werte gemäß dem t-Test, wenn die jeweilige Probe mit der entsprechenden Probe des Kontrollansatzes ohne Kollagenhydrolysat verglichen wird. Bei Werten von p<0,05 ist der Unterschied zum Kontrollansatz statistisch signifikant, diese Werte sind fett gedruckt. Telomerlängen unter Standardbedingungen:
| KH mg/ml | Woche | Medianlänge | 20. Perzentile | Anteil < 3 kbp |
| kbp | p-Wert | kbp | p-Wert | % | p-Wert |
| 0 | 0 | 7,726 | - | 4,063 | - | 12,8 | - |
| 0 | 4 | 6,878 | - | 3,342 | - | 17,3 | - |
| 0,01 | 4 | 7,082 | 0,02 | 3,464 | 0,08 | 16,7 | 0,1 |
| 0,1 | 4 | 7,051 | 0,08 | 3,433 | 0,2 | 16,9 | 0,4 |
| 1 | 4 | 6,921 | 0,6 | 3,351 | 0,9 | 17,3 | 1,0 |
| 10 | 4 | 7,264 | 0,001 | 3,757 | 0,0004 | 14,6 | 0,0008 |
| 0 | 8 | 5,578 | - | 2,489 | - | 24,2 | - |
| 0,01 | 8 | 5,900 | 0,0003 | 2,736 | 0,006 | 22,0 | 0,005 |
| 0,1 | 8 | 5,884 | 0,003 | 2,862 | 0,002 | 21,0 | 0,002 |
| 1 | 8 | 5,830 | 0,002 | 2,875 | 0,0002 | 20,9 | 0,0003 |
| 10 | 8 | 5,846 | 0,1 | 2,905 | 0,009 | 20,6 | 0,008 |
Telomerlängen unter oxidativen Bedingungen:
| KH | Woche | Medianlänge | 20. Perzentile | Anteil < 3 kbp |
| mg/ml | | kbp | p-Wert | kbp | p-Wert | % | p-Wert |
| 0 | 4 | 6,947 | - | 3,507 | - | 16,3 | - |
| 0,01 | 4 | 6,747 | 0,08 | 3,152 | 0,01 | 18,8 | 0,01 |
| 0,1 | 4 | 6,831 | 0,3 | 3,126 | 0,01 | 18,9 | 0,01 |
| 1 | 4 | 6,864 | 0,5 | 3,288 | 0,08 | 18,0 | 0,07 |
| 10 | 4 | 6,770 | 0,1 | 3,313 | 0,06 | 17,6 | 0,06 |
| 0 | 8 | 5,900 | - | 2,655 | - | 22,6 | - |
| 0,01 | 8 | 6,117 | 0,009 | 3,049 | 0,0001 | 19,5 | 0,0001 |
| 0,1 | 8 | 6,322 | 0,002 | 3,207 | 0,0003 | 18,1 | 0,0002 |
| 1 | 8 | 6,214 | 0,004 | 3,076 | 0,0006 | 19,3 | 0,0003 |
| 10 | 8 | 5,371 | 0,002 | 2,674 | 0,9 | 23,2 | 0,6 |
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Diese Daten zeigen einen signifikanten Effekt von Kollagenhydrolysat auf die Telomerlängen, zumindest nach einer Kultivierungszeit der Fibroblasten von 8 Wochen. Dieser Effekt gilt sowohl unter Standardbedingungen als auch bei Anwesenheit von H2O2, und für alle untersuchten Konzentrationen.
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1.5.2 Telomer-Verkürzungsraten
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Zur Berechnung der Telomer-Verkürzungsraten wurden für jede Zellkultur die Telomerlänge nach 4 bzw. 8 Wochen, abzüglich der Telomerlänge zu Beginn der Kultivierung, durch die jeweiligen PD-Wert (siehe Abschnitt 1.3) dividiert. Die Rate gibt somit die durchschnittliche Verkürzung der Telomere pro Populationsverdopplung an.
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Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen dargestellt, wobei auch hier bei einem p-Wert unter 0,05 eine statistische Signifikanz für den Vergleich mit dem Kontrollansatz vorliegt. Telomer-Verkürzungsraten unter Standardbedingungen:
| KH [mg/ml] | Woche | Rate [bp/PD] | p-Wert |
| 0 | 4 | 63,1 | - |
| 0,01 | 4 | 49,0 | 0,03 |
| 0,1 | 4 | 48,5 | 0,05 |
| 1 | 4 | 59,0 | 0,5 |
| 10 | 4 | 36,6 | 0,002 |
| 0 | 8 | 85,2 | - |
| 0,01 | 8 | 73,8 | 0,0007 |
| 0,1 | 8 | 73,1 | 0,003 |
| 1 | 8 | 76,6 | 0,005 |
| 10 | 8 | 76,8 | 1,0 |
Telomer-Verkürzungsraten unter oxidativen Bedingungen:
| KH [mg/ml] | Woche | Rate [bp/PD] | p-Wert |
| 0 | 4 | 89,4 | - |
| 0,01 | 4 | 82,4 | 0,5 |
| 0,1 | 4 | 73,0 | 0,2 |
| 1 | 4 | 68,5 | 0,1 |
| 10 | 4 | 84,1 | 0,6 |
| 0 | 8 | 92,1 | - |
| 0,01 | 8 | 76,7 | 0,0001 |
| 0,1 | 8 | 66,8 | 0,0006 |
| 1 | 8 | 86,4 | 0,2 |
| 10 | 8 | 120,7 | 0,001 |
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Diese Daten zeigen einen signifikanten Effekt von Kollagenhydrolysat auf die Telomer-Verkürzungsraten, zumindest nach einer Kultivierungszeit der Fibroblasten von 8 Wochen. Dieser Effekt gilt sowohl unter Standardbedingungen als auch bei Anwesenheit von H2O2, und für alle untersuchten Konzentrationen.
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2. Effekt von Kollagenhydrolysat auf die Telomeraseaktivität
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2.1 Zellkulturen
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Die Untersuchung wurde an Primärkulturen von adulten humanen Fibroblasten durchgeführt. Als Kulturmedium diente High-Glucose-DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 1.000 U/ml Streptomycin.
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Die Bestimmung der Telomeraseaktivität erfolgte zu Beginn der Kultivierung und nach 24 Stunden.
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2.2 Kollagenhydrolysat
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Es wurde dasselbe Kollagenhydrolysat verwendet wie zur Bestimmung der Telomerlängen (siehe Abschnitt 1.2). Dieses wurde dem Kulturmedium in einer Menge von 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml, 1 mg/ml oder 10 mg/ml zugesetzt. Beim Kontrollansatz erfolgte keine Zugabe von Kollagenhydrolysat.
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2.3 Bestimmung der Telomeraseaktivität
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Die Aktivitätsbestimmung für das Enzym Telomerase erfolgt mit der TRAP-Methode (Telomeric Repeat Amplification Protocol). Hierfür werden die Zellen lysiert und die Proteine extrahiert. Es wird ein Oligonukleotid-Substrat zugegeben, welches von der extrahierten Telomerase entsprechend den natürlichen Telomeren verlängert wird.
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Die Reaktionsprodukte der Telomerase werden mittels quantitativer Echtzeit-PCT amplifiziert. Als Messgröße dient die Anzahl der Zyklen, nach denen die Fluoreszenz erstmals über einen Schwellenwert steigt (Ct-Wert). Durch eine Kalibrierung mit Hilfe von HeLa-Zellen in verschiedenen Konzentrationen kann die relative Telomeraseaktivität (RTA) der Probe berechnet werden.
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2.4 Ergebnisse
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Die relative Telomeraseaktivität in den Fibroblasten zu Beginn der Kultivierung und für die verschiedenen KH-Konzentrationen nach 24 Stunden wurde jeweils dreifach bestimmt. In der nachfolgenden Tabelle sind die Mittelwerte und Standardabweichungen (SD) angegeben, sowie die p-Werte gemäß dem t-Test für den jeweiligen Vergleich mit dem Kontrollansatz (ohne KH). Bei einem p-Wert von unter 0,05 liegt eine statistische Signifikanz vor. Relative Telomeraseaktivität:
| KH [mg/ml] | Stunden | RTA Mittelwert | SD | p-Wert |
| 0 | 0 | 1,9 | 0,3 | - |
| 0 | 24 | 1,4 | 0,4 | - |
| 0,01 | 24 | 0,9 | 0,2 | 0,6 |
| 0,1 | 24 | 1,6 | 0,5 | 0,03 |
| 1 | 24 | 2,5 | 0,4 | 0,3 |
| 10 | 24 | 2,1 | 1,0 | 0,2 |
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Diese Daten zeigen eine Erhöhung der Telomeraseaktivität in den Fibroblasten durch Zugabe von Kollagenhydrolysat in Konzentrationen von 0,1; 1 oder 10 mg/ml, auch wenn die Erhöhung nur im Fall von 0,1 mg/ml signifikant ist.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2005/044179 A2 [0005]
- WO 2018/139835 A1 [0005]