CN112359089A - 一种鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法 - Google Patents

一种鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，属于食品检测领域；具体为对数据结果在对应的物种库中进行检索，鉴定得到置信区间在95％以上的肽段序列，并在相应的蛋白质的氨基酸序列上进行标记；将鱼糜凝胶中未被鉴定到的赖氨酸与未发生交联的生鱼糜中未被鉴定到的赖氨酸进行比较，额外增加的赖氨酸即为发生交联的赖氨酸。此方法所需材料和方法简单，无需任何标记即可鉴定出参与G‑L异肽键交联的赖氨酸的位点，对于研究转谷氨酰胺酶诱导交联的鱼糜凝胶提供了理论基础，为开发更健康的酶促交联鱼糜凝胶提供了技术指导。

Description

一种鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析 方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，特别是涉及一种鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法。
背景技术
转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase，EC.2.3.2.13)作为一种被美国鱼糜药品监督管理局认证安全的鱼糜添加剂，能催化蛋白质上赖氨酸的ε-氨基与谷氨酸的γ-羟酰氨基形成共价键，促进蛋白质分子间或分子内的共价交联，增强凝胶网络结构的形成，常被用于添加到食物中改善鱼糜的质构特性，尤其在鱼糜制品领域应用颇多。肌原纤维蛋白是鱼糜肌肉中的主要蛋白质，在加热条件下肌原纤维蛋白发生凝胶化，使鱼糜蛋白表现出液体黏性和固体弹性两种形态之间的性质，从溶胶状态变成高黏弹性的凝胶网络结构。在鱼糜制品的生产过程中，常利用鱼肉内含的内源性转谷氨酰胺酶及添加的外源性微生物转谷氨酰胺酶促进肌球蛋白产生ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸(ε-(γ-glutamyl)lysine，G-L)异肽键交联，从而增强鱼糜制品的质构特性。目前已有研究表明转谷氨酰胺酶导致的G-L异肽键交联可以改变蛋白质的构象及凝胶的微观结构，进一步会影响食物的消化特性和营养特性，而其内在原因尚不明确。随着人们生活水平的提高和对食物健康和营养需求的提高，对食物的消化吸收特性的研究非常迫切，因此从分子层面了解G-L异肽键交联位点对于研究交联结构对消化特性的影响机制具有非常重要的意义。
目前，蛋白组学技术，如化学交联结合质谱的方法常被用来研究化学交联的位点。这些方法通常利用同位素标记、荧光标记等方法标记特定的氨基酸或蛋白质，然后在已知交联规律的情况下列出可能发生交联后的肽段的分子量，利用质谱鉴定的结果进行匹配计算，或利用已有的商业软件对发生交联的位点和交联产物的氨基酸序列进行鉴定。然而这些方法很少利用到鉴定食物中的交联位点，因为食物中的成分非常复杂，利用蛋白组学技术鉴定食物中发生交联的位点可能面临很多困难：1)可发生交联的位点很多，较难预测；2)发生交联后的产物复杂，分子量跨度大；3)交联后的片段在被胰蛋白酶消化后不能被平均水解，产生的丰度较低的肽段容易被忽视。综上，利用蛋白组学技术较难直接对食物中产生交联的聚合物及发生交联的位点进行鉴定。并且，由于胰蛋白酶无法水解G-L异肽键交联，因此通过直接鉴定交联后聚合物氨基酸序列的方法分析交联位点非常复杂，目前国内外关于此内容的研究几乎没有。
在研究转谷氨酰胺酶诱导的G-L异肽键交联位点的领域，目前国内外研究中仅能鉴定到交联所属的大致区域，如肌原纤维蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)中的S1区域(subfragment-1,S1)，S2区域(subfragment-2,S2)或轻酶解肌球蛋白区域(lightmeromyosin,LMM)，而不能精确到具体的氨基酸位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，根据未发生G-L交联的赖氨酸的一级结构不发生改变，不含G-L交联，被胰蛋白酶水解后含有赖氨酸的肽段会被鉴定到，与谷氨酰胺发生分子内或分子间的交联的赖氨酸的一级结构发生变化，被胰蛋白酶水解后的肽段不会被鉴定到，测定鱼糜凝胶中ε-氨基相对于生鱼糜中ε-氨基的减少量获得数据结果，对所述数据结果在对应的物种库中进行检索，鉴定得到置信区间在95％以上的肽段序列，并在相应的蛋白质的氨基酸序列上进行标记；将鱼糜凝胶中未被鉴定到的赖氨酸与未发生交联的生鱼糜中未被鉴定到的赖氨酸进行比较，额外增加的赖氨酸即为发生交联的赖氨酸。
进一步的，所述数据分析使用ProteinPilot 4.0软件AB SCIEX Foster City,CA,USA进行分析。
进一步的，所述数据统计与分析所使用的数据库来自https://www.uniprot.org。
进一步的，所述数据获得的具体步骤为：
(1)交联鱼糜凝胶样本制备：取未加工生鱼糜样本加入NaCl和TGase斩拌后真空脱气，灌入肠衣，加热，得到交联鱼糜凝胶样本；
(2)未加工生鱼糜及鱼糜凝胶交联样本胰蛋白酶水解：取步骤(1)中的未加工生鱼糜及交联鱼糜凝胶样本，切碎均质后加水，水浴条件下搅拌，调pH为7.5，加入胰蛋白酶水解后沸水浴终止反应，反应产物离心后取上清液得到未加工生鱼糜及交联鱼糜凝胶胰蛋白酶水解液；
(3)反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱分析：取步骤(2)中的未加工生鱼糜及交联鱼糜凝胶胰蛋白酶水解液脱盐后，采用反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱对样品进行检测得到数据。
进一步的，在所述步骤(1)中，所述加热为分段加热法，具体步骤为40℃加热1、2、12h后，90℃加热30min。交联食品样本放于4℃冰箱中保存
进一步的，在所述步骤(2)中，所述均质后水浴为分段水浴，先在75℃下水浴15min，再在85℃下水浴2h；所述避光水浴为50℃1h。
进一步的，在所述步骤(2)中，所述交联程度按如下公式计算：
Figure BDA0002745180690000041
进一步的，在所述步骤(3)中，所述水浴的温度为37℃。
进一步的，在所述步骤(3)中，所述胰蛋白酶的消化时间为6h。
进一步的，在所述步骤(4)中，所述反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱检测在混合四极-TOF质谱仪上进行，所述混合四极-TOF质谱仪配备了nano系统；所述反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱检测的具体步骤为：脱盐后，先将多肽加到C18 trap柱上，然后洗脱到C18分析柱上；洗脱缓冲液A和B，流量为300nL/分钟,洗脱程序为：0分钟5％B,65分钟流动相B从5到23％B,20分钟流动相B从23-52％B,1分钟流动相B从52-80％B；维持4分钟流动相B为80％,然后0.1分钟流动相B从80到5％B，最后10分钟流动相B为5％；MS扫描在133.4-2000amu之间进行，时间跨度为250ms；对于MS/MS分析，每个扫描周期包括一个全扫描的质谱，m/z从133.4到2000，电荷态从2到5，随后是40个MS/MS；将阈值计数设置为120，并将之前的目标离子排除设置为18s；所述洗脱缓冲液A为3％DMSO溶液、97％水,0.1％甲酸；所述洗脱缓冲液B为ACN DMSO溶液的3％,97％,0.1％甲酸。
本发明公开了以下技术效果：本发明提出了一种利用液相色谱结合二级质谱的方法(LC-MS/MS)间接对鱼糜中转谷氨酰胺酶诱导的G-L异肽键交联位点进行鉴定，此方法所需材料和方法简单，无需任何标记即可鉴定出参与G-L异肽键交联的赖氨酸的位点，对于研究转谷氨酰胺酶诱导交联的食物提供了理论基础，为开发更健康的酶促交联食品提供了技术指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为鉴定鱼糜中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法原理图，其中a为未发生G-L交联的肽段，b为发生分子间G-L交联的肽段，c为发生分子内G-L交联的肽段；
图2为不同方法制备的鱼糜凝胶的交联程度；
图3为不同交联程度鱼糜凝胶的交联位点和数量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
1.1交联鱼糜凝胶样本制备
冷冻白鲢鱼糜，购于洪湖市井力水产鱼糜有限公司。微生物转谷氨酰胺酶(3000U/g)，购于瑞士科提纳公司。
取500g冷冻鱼糜4℃解冻后，加入12.5g NaCl(鱼糜质量的2.5％)和TGase(添加量分别控制在0U/g蛋白、9.0U/g蛋白)，在10℃斩拌3min后真空脱气，灌入直径为20mm肠衣中，采用分段加热法加热，即40℃加热1、2、12h后，90℃加热30min，得到鱼肠样本，鱼肠样本放于4℃冰箱中保存。
1.2鱼糜凝胶交联样本的交联程度测定
取2g解冻后的生鱼糜或鱼糜凝胶加10mL磷酸缓冲液(pH 8.2)，均质后分段水浴(先在75℃下水浴15min，再在85℃下水浴2h)，过滤后得原液，取所述原液0.25mL加2mL磷酸缓冲液和2mL TNBS(三硝基苯磺酸)，用铝箔纸避光水浴(50℃)1h，加4mL盐酸(0.100M)终止反应。冷却后30min内在340nm下比色，测得游离氨基的浓度，每组做三个平行，交联程度按如下公式计算：
Figure BDA0002745180690000071
1.3鱼糜凝胶交联样本胰蛋白酶水解
取解冻后的生鱼糜和1.1中制备的鱼肠样本(去除肠衣)切碎均质，分别加水(样品：水为1：40mg/ml)后置于磁力搅拌水浴锅(37℃)中，用饱和NaHCO3调至PH为7.5，加入胰蛋白酶水解6h后沸水浴10min终止反应，反应产物离心后取上清液得到交联鱼糜凝胶样本水解液和生鱼糜交联样本水解液，取部分水解液进一步分析。
1.4鱼糜凝胶交联样本水解液液相色谱-质谱/质谱分析(LC-MS/MS分析)
取1.3中制备的消化液用ZipTip移液管脱盐，然后采用反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱对样品进行检测。LC-MS/MS检测在混合四极-TOF质谱仪上进行，该质谱仪配备了nano系统。
先将上述消化液加到C18 trap柱上(5μm,5×0.3mm)，然后洗脱到C18分析柱上(75μm×150mm,3μm粒径，
Figure BDA0002745180690000072
孔径)。洗脱缓冲液分别为A(3％DMSO溶液、97％水,0.1％甲酸)和B(3％ACN DMSO溶液,97％水,0.1％甲酸)，流量为300nL/分钟,洗脱程序为：0分钟5％B,65分钟流动相B从5到23％B,20分钟流动相B从23到52％B,1分钟流动相B从52到80％B；维持4分钟流动相B为80％,然后0.1分钟流动相B从80到5％B，最后10分钟流动相B为5％。MS扫描在350-1500amu之间进行，时间跨度为250ms。对于MS/MS分析，每个扫描周期包括一个全扫描的质谱(m/z从350到1500，电荷态从2到5)，随后是40个MS/MS。将阈值计数设置为120，并将之前的目标离子排除设置为18s。
使用ProteinPilot 4.0软件(AB SCIEX Foster City,CA,USA)分析来自5600+的原始数据。在UniProt的Hypophthalmichthys molitrix(http://www.uniprot.org/)数据库对消化液中的肽段的序列进行分析。
1.5鱼糜凝胶交联位点的分析
使用统计分析系统软件(SAS 9.0Institute Inc.，Cary,NC,USA)进行统计分析。初始数据分析使用Microsoft Excel 2013进行。得到的结果在对应的Hypophthalmichthysmolitrix物种库中进行检索，鉴定得到置信区间在95％以上的肽段序列，并在相应的蛋白质(MHC)的氨基酸序列上进行标记。将鱼糜凝胶中未被鉴定到的赖氨酸与未发生交联的生鱼糜中未被鉴定到的赖氨酸进行比较，额外增加的赖氨酸即为可能发生交联的赖氨酸。
1.6原理、结果与分析
1.6.1原理
若赖氨酸未发生G-L交联，则在胰蛋白酶水解后，含有赖氨酸的肽段仍然可以被鉴定到，因为其一级结构并未发生改变。然而，若赖氨酸与谷氨酰胺发生分子内或分子间的交联，则发生交联的赖氨酸在被胰蛋白酶酶水解后不会被鉴定到，因为其一级结构已经发生变化。因此对应的蛋白质的氨基酸序列上未被鉴定到的赖氨酸即为可能发生交联的位点。基于此，本发明提出一种利用LC-MS/MS的方法间接鉴定鱼糜中参与G-L交联的赖氨酸及其位点，同时，为了排除胰蛋白酶水解后产生的过大与过小的肽段或氨基酸，导致其中包含的未被交联的赖氨酸也不能被鉴定到的影响，本发明将未发生交联的天然蛋白中未被鉴定到的赖氨酸作为对照，发生交联的鱼糜中增加的未被鉴定到的赖氨酸即为可能发生交联的赖氨酸，因为未发生交联的天然蛋白被默认为几乎不含G-L交联。原理示意图如图1所示。
1.6.2鱼糜凝胶的交联度分析
交联度的测定原理是根据1.1中的鱼糜凝胶中ε-氨基相对于1.2中的生鱼糜中ε-氨基的减少量来确定的。随着凝胶化时间的延长和微生物转谷氨酰胺酶的添加，鱼糜凝胶的交联程度从18.52％逐渐增加到79.11％。由于鱼肉内所含有的内源性转谷氨酰胺酶，即使在不添加外源性转谷氨酰胺酶的情况下，通过延长凝胶化时间也可以促进内源性转谷氨酰胺酶诱导的G-L异肽键交联，从而达到增强交联程度的目的。在此基础上，添加微生物转谷氨酰胺酶进一步促进了G-L异肽键交联，显著的提高了鱼糜凝胶的交联程度。为了方便分析，后续分析中将这四种鱼糜凝胶以他们各自的平均交联程度进行命名，即18.52％gel，34.76％gel，62.87％gel及79.11％gel，不同方法制备的鱼糜凝胶的交联程度如图2所示。
1.6.3鱼糜凝胶的交联位点分析
不同交联程度鱼糜凝胶的交联位点和数量分别如图3和表1所示。将白鲢的肌球蛋白重链(MHC)分为1、2、3型进行分析。图中氨基酸序列中圆圈圈出的即为可能参与交联的赖氨酸。随着交联度的提高，鱼糜凝胶中可能参与交联的赖氨酸位点的数量逐渐从18.52％gel的25个增加到79.11％gel的47个；同时，位于MHC杆部的位点占比从18.52％gel的66％增加到79.11％gel的91％。
鱼糜中的肌球蛋白占比很大，且由于富含赖氨酸及谷氨酰胺成为转谷氨酰胺酶作用的最佳底物。许多文献也证明，MHC是转谷氨酰胺酶的主要交联蛋白，因此本研究采用MHC作为对象研究交联位点。肌球蛋白的杆部在热处理过程中发生解旋，随着凝胶化时间的延长和微生物转谷氨酰胺酶的添加，杆部的交联位点逐渐增多。
表1不同交联程度鱼糜凝胶可能的交联位点数量统计分析
Figure BDA0002745180690000101
利用本发明提出的方法，可以简便的鉴定出鱼糜凝胶中可能产生G-L异肽键交联的位点，且结果与交联程度的测定结果相对应。
1.7本发明方法与现有技术的一般方法的比较
表2本发明方法与现有技术的一般方法的比较
Figure BDA0002745180690000102
Figure BDA0002745180690000111
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于，根据未发生G-L交联的赖氨酸的一级结构不发生改变，不含G-L交联，被胰蛋白酶水解后含有赖氨酸的肽段会被鉴定到，与谷氨酰胺发生分子内或分子间的交联的赖氨酸的一级结构发生变化，被胰蛋白酶水解后的肽段不会被鉴定到，测定鱼糜凝胶中ε-氨基相对于生鱼糜中ε-氨基的减少量获得数据结果，对所述数据结果在对应的物种库中进行检索，鉴定得到置信区间在95％以上的肽段序列，并在相应的蛋白质的氨基酸序列上进行标记；将鱼糜凝胶中未被鉴定到的赖氨酸与未发生交联的生鱼糜中未被鉴定到的赖氨酸进行比较，额外增加的赖氨酸即为发生交联的赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于：所述鱼糜凝胶交联位点的分析使用ProteinPilot 4.0软件AB SCIEX FosterCity,CA,USA进行分析。
3.根据权利要求1所述的鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于：所述鱼糜凝胶交联位点的分析使用的数据库来自https://www.uniprot.org。
4.根据权利要求1所述的鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于，所述数据获得的具体步骤为：
(1)交联鱼糜凝胶样本制备：取未加工生鱼糜样本加入NaCl和TGase斩拌后真空脱气，灌入肠衣，加热，得到交联鱼糜凝胶样本；
(2)未加工生鱼糜及鱼糜凝胶交联样本胰蛋白酶水解：取步骤(1)中的未加工生鱼糜及交联鱼糜凝胶样本，切碎均质后加水，水浴条件下搅拌，调pH为7.5，加入胰蛋白酶水解后沸水浴终止反应，反应产物离心后取上清液得到未加工生鱼糜及交联鱼糜凝胶胰蛋白酶水解液；
(3)反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱分析：取步骤(2)中的未加工生鱼糜及交联鱼糜凝胶胰蛋白酶水解液脱盐后，采用反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱对样品进行检测得到数据。
5.根据权利要求4所述的鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述加热为分段加热法，具体步骤为40℃加热1、2、12h后，90℃加热30min。
6.根据权利要求4所述的鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述水浴的温度为37℃。
7.根据权利要求4所述的鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述胰蛋白酶的水解时间为6h。
8.根据权利要求4所述的鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱检测在混合四极-TOF质谱仪上进行，所述混合四极-TOF质谱仪配备了nano系统。
9.根据权利要求4所述的鉴定鱼糜凝胶中转谷氨酰胺酶诱导的交联位点的分析方法，其特征在于：所述反相液相色谱-电喷雾电离-质谱/质谱检测的具体步骤为：脱盐后，先将多肽加到C18 trap柱上，然后洗脱到C18分析柱上；洗脱缓冲液A和B，流量为300nL/分钟,洗脱程序为：0分钟5％B,65分钟流动相B从5到23％B,20分钟流动相B从23到52％B,1分钟流动相B从52到80％B；维持4分钟流动相B为80％,然后0.1分钟流动相B从80到5％B，最后10分钟流动相B为5％；MS扫描在133.4-2000amu之间进行，时间跨度为250ms；对于MS/MS分析，每个扫描周期包括一个全扫描的质谱，m/z从133.4到2000，电荷态从2到5，随后是40个MS/MS；将阈值计数设置为120，并将之前的目标离子排除设置为18s；
所述洗脱缓冲液A为3％DMSO溶液、97％水,0.1％甲酸；所述洗脱缓冲液B为ACN DMSO溶液的3％,97％,0.1％甲酸。
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