CN105588909A

CN105588909A - 基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法

Info

Publication number: CN105588909A
Application number: CN201510937689.5A
Authority: CN
Inventors: 李莹莹; 张颖颖; 赵文涛; 马燕红; 王守伟; 郭文萍; 任南; 李志刚; 李慧晨; 段姗姗
Original assignee: CHINA MEAT COMPREHENSIVE RESEARCH CENTER
Current assignee: CHINA MEAT COMPREHENSIVE RESEARCH CENTER
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: CN105588909B

Abstract

本发明提供一种基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法，包括样品前处理，各种标准肉样特征多肽的筛选以及高效液相色谱-质谱联用检测待测肉样中的特征多肽等步骤。采用本发明提供的方法可实现对多种动物源性肉类成分的鉴别，该技术充分发挥液质质谱强大的扫描功能，通过监测选择离子监测模式实时采集信号，利用二级子离子强度触发，采集对应母离子二级碎裂全扫描谱图，获得更确切的定性信息的功能，避免复杂基质的干扰，降低假阳性概率，此外该方法前处理简单，便于批量样品的操作。

Description

基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体地说，涉及一种基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法。

背景技术

近年来，肉制品掺假成为全球广泛关注的食品安全问题。肉类掺假事件多次曝光，一些不法商贩为了谋取不正当利益，以次充好，不法经营者使用相对廉价的鸭肉，鸡肉，猪肉等低价肉类原料替代高价肉如牛肉，羊肉进行销售。这种掺假行为属于商业欺诈，扰乱了市场秩序，同时涉及到民族饮食禁忌等问题，严重侵犯了消费者的合法权益，因此建立准确、高效的肉类掺假的检测方法具有重要的现实意义。

目前，国内外开展肉种鉴别的方法主要包括基于抗体抗原的酶联免疫技术(ELISA)、基于核酸的聚合酶链反应(PCR)技术等，其中实时荧光PCR方法的应用最为广泛，也是现行国家和行业标准中指定的主要方法之一。但ELISA技术容易受制于抗体的制备，加工过程蛋白变性，复杂基质导致假阳性；PCR技术容易受到DNA降解，复杂基质的干扰和样品提取与扩增方法的影响。

随着生物质谱检测技术的成熟，大规模的定性和定量研究蛋白表达的技术已经很成熟。因此，利用质谱技术寻找不同肉类样品特征多肽，并进行定量，能够避免复杂基质干扰及假阳性判别的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法。

为了实现本发明目的，本发明的基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法，包括样品前处理，各种标准肉样特征多肽的筛选以及高效液相色谱-质谱联用检测待测肉样中的特征多肽等步骤。

样品前处理包括以下步骤：

1)提取样品总蛋白：将待测肉样剪碎或分割成小块，向2g样品中加入5mL提取液，冰水浴均质1min，再用5mL提取液洗刀头合并，12000r/min离心20min，取上清液；

2)还原及烷基化：取100μL上清液，加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL，56℃振荡反应1h，放置室温，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20μL，暗处反应30min，再加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液15μL，暗处反应15min；

3)酶切：向上述反应体系中加入25mmol/LTris-HCl，pH8.0缓冲溶液750μL，然后加入20μg胰蛋白酶，调节pH为8.0，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入0.4％TFA终止反应，并加入1mL水，所得溶液用于过柱除盐；

4)过柱除盐：将步骤3)所得溶液用C₁₈固相萃取柱除盐，收集洗脱液过0.22μm滤膜，准备上机。

其中，步骤1)中所述提取液为0.05mol/LTris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH8.0。

优选地，步骤4)中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C₁₈固相萃取柱，将步骤3)所得溶液上样，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱。

利用EasynLC1000液相色谱系统和QExactiveHF质谱仪检测并筛选各种标准肉样中的特征多肽，具体步骤如下：

色谱条件：C18色谱柱内径75μm，流动相：A相为0.1％FA(阿魏酸)；B相为0.1％ACN(乙腈)；色谱梯度为：0min，3％B相；2min，8％B相；48min，22％B相；53min，40％B相；55min，80％B相；59min，80％B相；61min，0％B相；65min，0％B相，进样量为10μL，每个样品至少采集三次数据。

质谱条件：喷雾电压2100V，毛细管温度275℃，FullScan分辨率60000，扫描质量范围为350～1600，AGC值为1E6，IT时间为50ms，二级扫描，topN为30，分辨率为15000，AGC值为1E5，IT时间为60ms，NCE为27。

质谱数据分析：用Maxquant对各种标准肉样进行非标记定量分析，检索Uniprot数据库，最多漏切位点设为2，可变修饰为Oxidation(Methionin),Acetylation(ProteinN-term)，固定修饰为Carbamidomethyl(Cysteinine)；选择异亮氨酸等于亮氨酸设置(I＝L)，peptideforquantitation选择all，其他参数为默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有MissCleavage的多肽，获得相对特异性多肽，即各种标准肉样的特征多肽。

高效液相色谱-质谱联用检测待测肉样中的特征多肽，并与标准肉样的特征多肽进行比较，从而判定对应的肉样组分，具体步骤如下：

液质联用三重串联四极杆质谱仪(TSQultraEMR)进行检测：

色谱条件：色谱柱HypersilGOLDC₁₈(2.1mm×100mm，1.9μm)；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样量50μL；流动相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/ACN，色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B。

质谱条件：喷雾电压3500V；鞘气38Arb；辅气15Arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；传输线温度275℃；离子源温度380℃；采集周期为0.3s；碰撞气为1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均为0.7。

通过对每个物种的特征多肽进行母离子扫描以及SRM扫描，根据保留时间，多个定性离子匹配以及丰度信息，最终判定对应的肉样组分。

前述的方法，所述待测肉样来自猪肉、鸡肉、牛肉、鸭肉、羊肉、驴肉、兔肉、马肉等。

采用本发明方法获得的不同动物源性肉类的特征多肽，羊肉、鸭肉、牛肉、猪肉、鸡肉的多肽信息分别如表1所示。

表1羊肉、鸭肉、牛肉、猪肉、鸡肉的特征多肽信息

本发明基于高效液相色谱-质谱联用技术建立了一种特征性多肽识别方法，从而实现对多种动物源性肉类成分的鉴别，该方法充分发挥液质质谱强大的扫描功能，通过监测选择离子监测模式实时采集信号，利用二级子离子强度触发，采集对应母离子二级碎裂全扫描谱图，获得更确切的定性信息的功能，避免复杂基质的干扰，降低假阳性概率。其优点在于：

(一)通过SRM扫描方式，可以同时准确定性多种物种来源的肉类。

(二)测定不同物种的前处理步骤相同，简化了处理过程，便于批量样品的操作。

(三)该方法测定的多肽链即使在复杂的肉类加工过程中也不会发生变性，确保准确性。

附图说明

图1为本发明实施例1中鸭肉的总离子流图和提取离子流图。

图2为本发明实施例1中羊肉的总离子流图和提取离子流图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法

包括以下步骤：

1、样品前处理：

标准肉样：分别称取鸭肉2g，羊肉2g；混合肉样：称取鸭肉0.1鸭肉和1.9g羊肉。按下列步骤进行前处理。

总蛋白提取：加入提取液(0.05mol/LTris-HCl，7mol/L尿素，2mol/L硫脲，pH8.0)，冰水浴均质1min，再用5mL提取液洗刀头合并，12000r/min离心20min。

还原及烷基化：吸取100μL上清液，加入10μL的二硫苏糖醇溶液(50mmol/L)，56℃振荡反应1h。放置室温，加入20μL的碘乙酰胺溶液(100mmol/L)，暗处反应30min。再加入15μL的二硫苏糖醇溶液(50mmol/L)，暗处反应15min。

酶切：加入750μL25mmol/LTris-HCl，pH8.0缓冲溶液，加入20μg胰蛋白酶，调节pH为8.0，37℃反应过夜。

过柱除盐：放置室温后，加入0.4％TFA终止反应，并加入1mL水，所得溶液用于过柱除盐。依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C₁₈固相萃取柱除盐，上样，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，过0.22μm滤膜，准备上机。

2、鸭肉、羊肉标准肉样特征多肽的筛选：

利用EasynLC1000液相色谱系统和QExactiveHF质谱仪检测并分别筛选鸭肉、羊肉标准肉样中的特征多肽，具体步骤如下：

色谱条件：C18色谱柱内径75μm，流动相：A相为0.1％FA；B相为0.1％ACN；色谱梯度为：0min，3％B相；2min，8％B相；48min，22％B相；53min，40％B相；55min，80％B相；59min，80％B相；61min，0％B相；65min，0％B相，进样量为10μL，每个样品采集三次数据。

质谱数据分析：用Maxquant分别对鸭肉、羊肉标准肉样进行非标记定量分析，检索Uniprot数据库，最多漏切位点设为2，可变修饰为Oxidation(Methionin),Acetylation(ProteinN-term)，固定修饰为Carbamidomethyl(Cysteinine)；选择异亮氨酸等于亮氨酸设置(I＝L)，peptideforquantitation选择all，其他参数为默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有MissCleavage的多肽，获得相对特异性多肽，即鸭肉、羊肉标准肉样中的特征多肽。

高效液相色谱-质谱联用检测混合肉样中的特征多肽，并与鸭肉、羊肉标准肉样的特征多肽进行比较，从而判定对应的肉样组分，具体步骤如下：

液质联用三重串联四极杆质谱仪(TSQultraEMR)进行检测：

色谱条件：色谱柱HypersilGOLDC₁₈(2.1mm×100mm，1.9μm)；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样量50μL；流动相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/ACN，色谱梯度为：0～0.2min，3％B～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％B～80％B；17.5～18.5min，80％B～3％B。

通过对混合肉样的特征多肽进行母离子扫描以及SRM扫描，根据保留时间，多个定性离子匹配以及丰度信息，最终选取羊肉多肽20条，鸭肉多肽20条作为定性离子的母离子。

混合肉样样品中检测出羊肉多肽8条，鸭肉多肽10条，每个母离子下有3个子离子(表2)。图1分别列举了鸭肉和羊肉的总离子流图(TIC图)，以及多肽Duck_2和Sheep_5的三个子离子选择离子流图。结果表明，混合肉样样本中检测出羊肉成分及鸭肉成分。

表2样品检测的离子对信息

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法，其特征在于，包括样品前处理，各种标准肉样特征多肽的筛选以及高效液相色谱-质谱联用检测待测肉样中的特征多肽的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样品前处理包括以下步骤：

4)过柱除盐：，将步骤3)所得溶液用C₁₈固相萃取柱除盐，收集洗脱液过0.22μm滤膜，准备上机；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C₁₈固相萃取柱，将步骤3)所得溶液上样，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，利用EasynLC1000液相色谱系统和QExactiveHF质谱仪检测并筛选各种标准肉样中的特征多肽，具体步骤如下：

色谱条件：C₁₈色谱柱内径75μm，流动相：A相为0.1％FA；B相为0.1％ACN；色谱梯度为：0min，3％B相；2min，8％B相；48min，22％B相；53min，40％B相；55min，80％B相；59min，80％B相；61min，0％B相；65min，0％B相，进样量为10μL，每个样品至少采集三次数据；

质谱条件：喷雾电压2100V，毛细管温度275℃，FullScan分辨率60000，扫描质量范围为350～1600，AGC值为1E6，IT时间为50ms，二级扫描，topN为30，分辨率为15000，AGC值为1E5，IT时间为60ms，NCE为27；

质谱数据分析：用Maxquant对各种标准肉样进行非标记定量分析，检索Uniprot数据库，最多漏切位点设为2，可变修饰为Oxidation,Acetylation，固定修饰为Carbamidomethyl；选择异亮氨酸等于亮氨酸设置，peptideforquantitation选择all，其他参数为默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有MissCleavage的多肽，获得相对特异性多肽，即各种标准肉样的特征多肽。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，高效液相色谱-质谱联用检测待测肉样中的特征多肽，并与标准肉样的特征多肽进行比较，从而判定对应的肉样组分，具体步骤如下：

液质联用三重串联四极杆质谱仪进行检测：

色谱条件：色谱柱HypersilGOLDC₁₈，规格2.1mm×100mm，1.9μm；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样量50μL；流动相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/ACN，色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；

质谱条件：喷雾电压3500V；鞘气38Arb；辅气15Arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；传输线温度275℃；离子源温度380℃；采集周期为0.3s；碰撞气为1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均为0.7；

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述待测肉样来自猪肉、鸡肉、牛肉、鸭肉、羊肉、驴肉、兔肉、马肉。

7.基于权利要求1-6任一项所述方法获得的不同动物源性肉类的特征多肽，其特征在于，羊肉、鸭肉、牛肉、猪肉、鸡肉的多肽信息分别如下：