CN103630621B - 一种胶类中药及其制品中羊源性成分的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胶类中药及其制品中羊源性成分的检测方法，其利用羊亚科动物基因组中具有特异性核苷酸序列或氨基酸序列的不同进行检测，所述特异性氨基酸序列如SEQ.ID No1所示。采用本发明的方法，能够快速检测胶类中药中是否含有羊源性成分，从而分辨真伪，尽管胶类中药中胶原蛋白多肽有一定水解与破坏，但本发明基于其主要成分胶原蛋白中的差异性多肽，其含量高，受破坏程度很小，可对胶类中药及其制品中的羊源性成分进行鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及一种羊源性成分的检测方法，具体涉及一种胶类中药及其制品中羊源性成分的检测方法，属于中药检测领域。
背景技术
胶类中药由动物的皮、骨等熬制而成胶类物质，包括阿胶、龟甲胶、鹿角胶等，具有典型民族特色的传统中药，广泛用于血液、妇科、产科、呼吸、肿瘤等疾病的预防和治疗。
随着胶类中药市场的不断发展，生产胶类中药的厂家也不断增多，生产能力以及产品质量参差不齐。以阿胶为例，由于驴的畜牧价值在不断下降，而其经济价值确未见提高，驴的数量在世界范围内急剧下降，驴皮的供应也逐年紧张，价格不断上涨。市场上出现了很多不法分子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、牛皮、猪皮等，甚至脏皮、烂皮、病死动物之皮等来取代驴皮进行熬制。这类假冒伪劣产品不但没有任何疗效，还对人体危害极大，影响着人们的身心健康。此外，对于其他胶类中药包括龟甲胶、鹿角胶等及其制品，也存在类似情况，这些伪品严重阻碍了整个胶类中药市场的健康发展。
胶类中药一般经长时间高温蒸煮浓缩而成，主要成分非常相近且不同厂家的生产工艺存在差异，采用红外、近红外、X-衍射等方法对胶类中药纯品进行真伪鉴别常存在判断不准确等情况。有报道称从多肽的角度利用质谱检测胶类中药中龟源性、鹿源性、牛源性、驴源性成分，结果准确可靠。但目前还没有从胶原多肽的角度，也没有从DNA的角度对胶类中药及其制品中羊源性成分的检测方法。
胶类中药中主要成分为胶原蛋白多肽，不同动物的胶原蛋白氨基酸序列存在差异，同一物种稳定存在的差异性多肽可作为该物种的特征性多肽，通过限制性内切酶酶切，利用质谱完全可以对胶类中药及其制品进行溯源鉴定。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种胶类中药及其制品中羊源性成分的检测方法，该方法操作简单，特征性强，灵敏度高，可用于胶类中药及其制品中羊源性成分的鉴定。
本发明的技术方案如下：
首先，本发明提供了一种胶类中药及其制品中羊源性成分的检测方法，其利用羊亚科动物基因组中具有特异性核苷酸序列或氨基酸序列的不同进行检测，所述特异性氨基酸序列如SEQ.ID No1所示。
优选的，所述胶类中药选自阿胶、黄明胶、龟甲胶或羊角胶；所述羊亚科动物为羊。
优选的，所述胶类中药制品选自由相应胶类中药制成的食品、保健品或药品。
具体地，该方法包括如下步骤：
(1)选取羊亚科动物基因组中特异性氨基酸序列,所述特异性氨基酸序列如SEQ.ID No1所示；
(2)将胶类中药或其制品溶解，或提取其中的蛋白多肽类成分溶解，加入限制性内切酶进行酶切；
(3)随后放入液质联用仪，以待检测的阴性样品为基质，加入步骤(1)所得氨基酸序列或羊角胶纯品作为对照，选择该对照的母离子m/z751.9及其子离子进行监测。
如果检出该离子的保留时间与对照品一致，且其子离子与对照品的子离子一致，则所述胶类中药或其制品含有羊源性成分；如果没有与对照品保留时间一致的该离子，则不含有羊源性成分。
优选的，步骤(2)中所述溶解所用的试剂是质量百分数为1％、pH值8.0的NH4HCO3溶液；所述限制性内切酶为胰蛋白酶。
采用本发明的方法，能够快速检测胶类中药中是否含有羊源性成分，从而分辨真伪，尽管胶类中药中胶原蛋白多肽有一定水解与破坏，但本发明基于其主要成分胶原蛋白中的差异性多肽，其含量高，受破坏程度很小，可对胶类中药及其制品中的羊源性成分进行鉴定。
本发明还涉及多肽，其氨基酸序列为Thr-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Val-Gly-Glu-Lys，及其由所述多肽与相应载体组成的组合物。此外，还包括所述多肽及其组合物在检测胶类中药及其制品中羊源性成分中的应用。
附图说明
图1是合成多肽及纯品胶SRM扫描模式下选择离子对m/z751.9→608.4、846.6、903.5监测的质谱图；
图2是合成多肽及加入5％羊皮胶的混合胶SRM扫描模式下选择离子对m/z751.9→608.4、846.6、903.5监测的质谱图；
图3是合成多肽及胶类中药制品(以阿胶补血膏为例)在SRM扫描模式下选择离子对m/z751.9→608.4、846.6、903.5监测的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中特异性肽链的获得：
1材料和试剂
材料：纯品胶包括阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶、羊皮胶，分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、龟甲、鹿角、羊皮煎煮获得。
试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)、合成多肽Thr-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Val-Gly-Glu-Lys。
2样品的检测前处理
(1)胶样品酶解溶液的制备
取1.0g待测胶样品于500mL量瓶中，加少量1％NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μL，37℃恒温酶解6h。
(2)合成多肽对照样品酶解溶液的制备
称取一定量的合成多肽，加入1％NH4HCO3溶液(pH8.0)，摇匀，配制成浓度约为0.3μg/mL，微孔滤膜过滤，备用。
3多肽的发现
(1)离子的发现
取5μL酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％甲酸溶液(体积分数)，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％流动相B。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行一级全扫，扫描范围m/z400-m/z1000。
从各自胶样品的质谱全扫图中提取离子m/z751.9，通过对比发现在11.67min左右只有羊皮胶中含有该离子峰，而阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶和鹿角胶中均没有。通过多批次样品的检测与验证表明上述结论正确。说明：可以通过检测胶类中药(阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶)中的离子m/z751.9，来确定是否含有羊源性成分。
(2)多肽的氨基酸序列初步推测
利用三重四极杆质谱，对上述找出的离子进行子离子扫描，确认该离子带双电荷，通过序列拼接，推测出多肽的部分序列。根据推测的部分序列，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库进行序列检索，结合其的特点(羊中有，而驴、马、牛、龟或鹿中均没有，且被胰蛋白酶酶切后分子量约为1502.8)，推导出该多肽可能的序列Thr-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Val-Gly-Glu-Lys。根据肽链的CID断裂理论，计算该多肽可能的子离子如下：
| a | b | c" | Res: | x | y" | z |
| 74.1 | 102.1 | 121.1 | Thr | - | - | - |
| 131.1 | 159.1 | 178.1 | Gly | 1425.6 | 1401.7 | 1382.6 |
| 260.1 | 288.1 | 307.2 | Glu | 1368.6 | 1344.6 | 1325.6 |
| 373.2 | 401.2 | 420.2 | Hyp | 1239.6 | 1215.6 | 1196.6 |
| 430.2 | 458.2 | 477.2 | Gly | 1126.5 | 1102.6 | 1083.5 |
| 501.2 | 529.2 | 548.3 | Ala | 1069.5 | 1045.5 | 1026.5 |
| 572.3 | 600.3 | 619.3 | Ala | 998.5 | 974.5 | 955.5 |
| 629.3 | 657.3 | 676.3 | Gly | 927.4 | 903.5 | 884.4 |
| 726.3 | 754.3 | 773.4 | Pro | 870.4 | 846.4 | 827.4 |
| 839.4 | 867.4 | 886.4 | Hyp | 773.3 | 749.4 | 730.3 |
| 896.4 | 924.4 | 943.4 | Gly | 660.3 | 636.3 | 617.3 |
| 1043.5 | 1071.5 | 1090.5 | Phe | 603.3 | 579.3 | 560.3 |
| 1142.5 | 1170.5 | 1189.6 | Val | 456.2 | 432.2 | 413.2 |
| 1199.6 | 1227.6 | 1246.6 | Gly | 357.1 | 333.2 | 314.1 |
| 1328.6 | 1356.6 | 1375.6 | Glu | 300.1 | 276.2 | 257.1 |
| - | - | - | Lys | 171.1 | 147.1 | 128.1 |
能与羊皮胶中特有离子m/z751.9的子离子全扫图中的吻合。
(3)序列确定
根据推测的氨基酸序列，委托多肽合成公司(吉尔生化有限公司)进行该多肽的合成。然后利用液质联用仪进行合成多肽的子离子全扫，其检测条件与胶样品中相应多肽的子离子全扫条件一致。通过对比合成多肽与羊皮胶的离子出峰时间、子离子全扫图，发现两者完全吻合，从而确定该离子m/z751.9为多肽Thr-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Val-Gly-Glu-Lys。
实施例1
1材料和试剂
材料：纯品胶包括阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶、羊皮胶，分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、龟甲、鹿角、羊皮煎煮获得。
混合胶样品(含质量分数5％羊皮胶的阿胶、质量分数10％羊皮胶的阿胶、质量分数20％羊皮胶的阿胶、质量分数40％羊皮胶的阿胶)由上述纯品胶精确混合制成。
试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)、合成多肽Thr-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Val-Gly-Glu-Lys。
2检测方法
(1)合成多肽对照样品酶解溶液的制备
取1.0g纯品阿胶样品于500mL量瓶中，加少量1％NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL加入合成多肽0.3μg，再加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μL，37℃恒温酶解6h。
(2)胶样品酶解溶液的制备
取1.0g待测胶样品于500mL量瓶中，加少量1％NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μL，37℃恒温酶解6h。
(3)检测
取5μL酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为体积分数为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％流动相B(这里的百分数表示从0分钟到第40分钟，流动B由2％线性渐变为50％、流动相A则由98％渐变为50％)。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)选择进行多反应检测，选择m/z751.9→608.4、846.6、903.5作为检测离子对。
结果见图1，11.67min处只有合成多肽对照样品和羊皮胶中检出相应的离子峰，其他均没有检出。混合胶样品的检测，以羊皮胶的百分含量为横坐标，以m/z751.9→608.4提取离子流图中色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，R2为0.999以上，线性良好。可见该法能够特异性检测羊源性成分，与其他各种动物源性成分包括驴、马、牛、猪、龟、鹿等进行区分。
实施例2
1材料和试剂
材料：混合胶样品由实施例1中的纯品胶样品分别加入5％羊皮胶制成，包括含5％羊皮胶的阿胶、5％羊皮胶的马皮胶、含5％羊皮胶的黄明胶、5％羊皮胶的猪皮胶、含5％羊皮胶的龟甲胶、5％羊皮胶的鹿角胶(百分数为质量分数)。
试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)、合成多肽Thr-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Val-Gly-Glu-Lys。
2检测方法
(1)合成多肽对照样品酶解溶液的制备
取1.0g待测纯品阿胶样品于500mL量瓶中，加少量1％NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL加入合成多肽0.3μg，再加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μL，37℃恒温酶解6h。
(2)胶样品酶解溶液的制备
取1.0g待测样品于500mL量瓶中，加少量1％NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μL，37℃恒温酶解6h。
(3)检测
取5μL酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B(这里的百分数表示从0分钟到第40分钟，流动B由2％线性渐变为50％、流动相A则由98％渐变为50％)。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)选择进行多反应检测，选择m/z751.9→608.4、846.6、903.5作为检测离子对。
结果见图2，11.67min处合成多肽对照样品、加入5％羊皮胶的混合胶样品中均检出相应的离子峰，而实施案例1中的纯品阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶中均没有检出相应的离子峰。可见该法能够特异性检测胶类中药中的羊源性成分。
实施例3
1材料和试剂
材料：羊皮胶、阿胶补血膏(山东东阿阿胶股份有限公司)、加入羊皮胶的阿胶补血膏(自制)
试剂：三氯乙酸(分析纯)、碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)、合成多肽Thr-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Val-Gly-Glu-Lys。
2检测方法
(1)合成多肽对照样品酶解溶液的制备
取1.0g阿胶补血膏加入1％NH4HCO3溶液24mL溶解，加入2g三氯乙酸，4℃放置10min，10000rpm离心5min，弃上清，将沉淀物转入100mL量瓶中，用1％NH4HCO3溶液(pH8.0)溶解并定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL加入合成多肽0.3μg，再加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μL，37℃恒温酶解6h。
(2)待测样品酶解溶液的制备
取1.0g待测样品加入1％NH4HCO3溶液25mL溶解，加入2g三氯乙酸，4℃放置10min，10000rpm离心5min，弃上清，将沉淀物转入100mL量瓶中，用1％NH4HCO3溶液(pH8.0)溶解并定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μL，37℃恒温酶解6h。
(3)检测
取5μL酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B(这里的百分数表示从0分钟到第40分钟，流动B由2％线性渐变为50％、流动相A则由98％渐变为50％)。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应检测，选择m/z751.9→608.4、846.6、903.5作为检测离子对。
结果见图3，11.67min处合成多肽对照样品、羊皮胶和加入羊皮胶的阿胶补血膏检出相应的离子峰，其他没有检出，可见该法能够特异性检测阿胶制品中的羊源性成分，而与其他各种动物源性成分包括驴、马、牛、猪、龟、鹿等进行区分。
Claims (10)
1.一种胶类中药及其制品中羊源性成分的检测方法，其利用羊亚科动物基因组中具有特异性氨基酸序列的不同进行检测，所述特异性氨基酸序列如SEQ.IDNo1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶类中药选自阿胶、黄明胶、龟甲胶或羊角胶；所述羊亚科动物为羊。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶类中药制品选自由相应胶类中药制成的食品、保健品或药品。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其具体包括如下步骤：
(1)选取羊亚科动物基因组中特异性氨基酸序列,所述特异性氨基酸序列如SEQ.ID No1所示；
(2)将胶类中药或其制品溶解，或提取其中的蛋白多肽类成分溶解，加入限制性内切酶进行酶切；
(3)随后放入液质联用仪，以待检测的阴性样品为基质，加入步骤(1)所得氨基酸序列或羊皮胶纯品作为对照，选择该对照的母离子m/z751.9及其子离子进行监测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述溶解所用的试剂为1％、pH值8.0的NH4HCO3溶液；所述限制性内切酶为胰蛋白酶。
6.一种检测胶类中药及其制品中羊源性成分的分子标记物，该分子标记物的氨基酸序列如SEQ.ID No1所示。
7.编码权利要求6所述的氨基酸序列的基因。
8.权利要求6所述的分子标记物在检测胶类中药及其制品中羊源性成分的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含药学有效量的权利要求6所述的氨基酸序列和一种或多种药学上可接受的载体。
10.权利要求9所述的药物组合物在检测胶类中药及其制品中羊源性成分的应用。
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