CN109187783B - 鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法。当采用液相色谱‑串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测时，本发明的鹿胶特征肽的母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或者母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38。本发明的鹿胶特征肽能够辨识、鉴定鹿胶药材，基于此可建立以特征肽段离子对为指标的高效液相‑串联质谱快速检测方法(HPLC‑MS/MS)。

Description

鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法

技术领域

本发明属于医药与食品检测技术领域，具体涉及一种用高效液相-串连质谱技术鉴别鹿胶及其制品真伪的检测技术。

背景技术

鹿胶(亦称鹿皮胶)是由马鹿Cervus elaphus Linnaeus或梅花鹿CervusnipponTemminck的皮经熬制加工而成的特殊中药材，具有补肾壮阳，补血止血之功效。《本草纲目》中记载“鹿皮无毒，治一切漏疮，妇女白带，血崩不止，肾虚滑精”。自古以来鹿胶便是人们滋补养身的功能性保健食品，近些年随着生活水平的提高，鹿胶药材及其产品受到了越来越多的关注。

由于鹿胶功效显著，价格较贵，原料又相对短缺，市场上出现了采用其它动物皮或杂皮胶违法生产而成的伪品鹿胶，使得目前市场上鹿胶类药材的质量参差不齐、市场秩序混乱，甚至出现了劣药驱逐良药的恶况。但鹿胶现行的药材质量标准十分简单，仅通过鉴别氨基酸类成分或仅通过控制氨基酸成分来进行质量控制，其质量控制缺乏专属性鉴别方法和高灵敏度的检测技术，同时由于鹿胶是鹿皮经高温加热熬制而成，其蛋白质已变性破坏，常用的动物类药材鉴定技术DNA-PCR亦无法对此进行鉴别，使得目前鹿胶缺乏有效的真伪鉴别方法。

近些年质谱多肽识别技术在动物胶类的鉴定、辨识中的应用越来越广泛。如程显隆等在特征肽段检测技术用于胶类药材专属性鉴别方法研究(中国中药杂志，2015，50(2)：104-108)中公开了利用酶切技术及质谱识别技术对阿胶和新阿胶、黄明胶、龟甲胶进行了对比研究，并对特征肽进行检识，建立了几种胶类药材的鉴别方法。CN105842375A公开了一组鉴别阿胶及其制品中驴源性成分的多肽，并利用特征多肽建立了以液质联用的阿胶及其制品的快速鉴定方法。

然而，针对鹿胶药材及其制品的质谱鉴别研究尚为空白，且国际上蛋白质序列库中没有鹿胶原蛋白完整的序列库，无法进行完整的谱库检索。因此，基于质谱建立鉴定鹿胶的方法存在困难。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明将鹿胶及其它动物胶进行分析，并进行系统的检测、比较、验证后，发现了能够辨识、鉴定鹿胶药材的特征性肽段，可以用于鹿胶真伪的鉴别，避免了当前仅用性状、外观进行鉴别容易出现假阳性的技术缺陷。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种鹿胶特征肽，当采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测时，所述鹿胶特征肽的母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或所述鹿胶特征肽的母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38。

根据本发明第一方面所述的鹿胶特征肽，优选地，所述液相色谱-串连质谱的条件包括：

以C18色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B；

质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V。

本发明的第二方面，提供一种鹿胶特征肽，其中所述鹿胶特征肽选自序列为SEQID No：1或SEQ ID No：2的肽中的至少一种。

本发明的第三方面，提供一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的组合物，其包括本发明第一方面或第二方面所述的鹿胶特征肽。

本发明的第四方面，提供一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括检测第一方面或第二方面所述的鹿胶特征肽的步骤。

根据本发明第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括以下步骤：

(1)待测样品的处理步骤：取待测鹿胶制品，加铵溶液处理，经胰蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到待测样品溶液；

(2)采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测所述待测样品中是否存在鹿胶特征肽，其中液相色谱-串连质谱法的条件包括以C18色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B、10-15min，50体积％的流动相B，质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V；

(3)如果检测到母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38，则判定所述待测样品包含鹿胶制品。

根据本发明第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其还优选包括以下步骤：

(1’)鹿胶对照溶液的制备：取鹿胶作为对照物，加铵溶液处理，经胰蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到鹿胶对照溶液；

(2’)待测样品溶液的制备：取待测样品，以与步骤(1’)相同的方式制备得到待测样品溶液；

(3’)将所述步骤(1’)得到的鹿胶对照溶液与(2’)得到的待测样品溶液，采用液相色谱-串连质谱法，以电喷雾负离子模式，进行多反应监测，选择m/z 732.84→875.42、818.40，或m/z 675.99→914.46、746.38作为检测离子对进行检测；

(4’)在待测样品的液相色谱-串联质谱图中，如果呈现与所述鹿胶对照色谱保留时间一致的质谱峰，则判定所述待测样品包含鹿胶；如果不出现相应的质谱峰，则判定所述待测样品不包含鹿胶。

根据本发明第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中所述铵溶液为选自由碳酸氢铵、醋酸铵和甲酸铵组成的组中的一种或几种物质的水溶液。

根据本发明第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中所述胰蛋白酶酶解条件包括酶浓度为每100μl样品液中含5μg-20μg，酶解温度为30-40℃，酶解的时间为10-24小时。

根据本发明第四方面所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中所述多反应监测的裂解电压为120V，且碰撞能量为35V；或者裂解电压为100V，碰撞能量为25V。

本发明的鹿胶特征肽能够辨识、鉴定鹿胶药材，基于此可建立以特征肽段离子对为指标的高效液相-串联质谱快速检测方法(HPLC-MS/MS)。另外，本发明的鉴定方法采用高效液相-串连质谱技术，其检测的灵敏度高，不仅可以用于单一鹿胶的鉴别，还可以辨别标识含鹿胶的制品中是否含有鹿胶成分，扩大了本技术方法的应用范围。

附图说明

图1为本发明一种示例性鹿胶特征肽的质谱离子图。

图2为本发明另一种示例性鹿胶特征肽的质谱离子图。

图3为MRM模式下一种示例性鹿胶特征肽的m/z732.84→875.42检测的质谱图。

图4为MRM模式下一种示例性鹿胶特征肽的m/z732.84→818.40检测的质谱图。

图5为MRM模式下另一种示例性鹿胶特征肽的m/z675.99→914.46检测的质谱图。

图6为MRM模式下另一种示例性鹿胶特征肽的m/z675.99→746.38检测的质谱图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

动物胶是指由动物组织例如由动物皮制得的明胶。虽然动物来源不同，但是这些动物胶的主要成分均为胶原蛋白。因此，在蛋白质水平上很难将不同动物来源的明胶进行有效区分。发明人将不同来源的动物胶经铵溶液处理，然后经胰蛋白酶处理得到了大量短的肽片段，在通过高效液相-串联质谱快速检测方法(HPLC-MS/MS)进行肽段鉴定时意外发现部分肽片段仅存在于鹿科动物明胶中，而不存于其他哺乳动物的明胶或其酶解物中。至少部分地基于此完成了本发明。

本发明所述的“鹿胶”是指由鹿科动物的皮制得的明胶，因此，有时称作“鹿皮胶”。鹿胶的制备方法是本领域已知的。另外，可参考驴皮制备阿胶的工艺来制备。其中鹿科动物的实例包括但不限于马鹿Cervus elaphus Linnaeus或梅花鹿Cervus nippon Temminck。

本发明所述的“鹿胶特征肽”包括后面所述的第一鹿胶特征肽和第二鹿胶特征肽，是指仅在鹿胶中存在，而不存在于其他动物，特别是在其他动物的皮制得的胶中不存在的肽。在优选的实施方案中，其他动物的实例包括驴、牛、猪、马和羊。因此，本发明的鹿胶特征肽优选至少不存在于驴皮胶(阿胶)、牛皮胶(黄明胶)、猪皮胶(新阿胶)、马皮胶和羊皮胶中，也不存在于这些胶的分解物中。即鹿胶特征肽并非这些胶中的蛋白的片段。优选地，蛋白酶(例如胰蛋白酶)与本发明的鹿胶特征肽不发生酶切反应。优选地，本发明的鹿胶特征肽为小分子肽段，例如由10-35个氨基酸组成的肽片段。

[第一鹿胶特征肽]

本发明的第一方面，提供第一鹿胶特征肽，其为通过液相色谱-串连质谱表征的特征肽。具体地，当通过液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测时，其仅显示存在于鹿胶中，至少不存在于驴皮胶(阿胶)、牛皮胶(黄明胶)、猪皮胶(新阿胶)、马皮胶和羊皮胶中。第一鹿特征肽可以是一种肽段，也可以是多种肽段的组合物。优选地，本发明的第一鹿胶特征肽为多种肽段的组合物。例如，至少两种不同肽片段的组合物。在示例性实施方案中，第一鹿胶特征肽包括肽段1和肽段2。对于肽段1，当采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测时，在一级质谱的m/z100-2000全扫描范围内，在m/z732.84具有最大响应值。即，肽段1的母离子m/z值为732.84。在二级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z875.42、m/z818.40具有最大的两个响应值。即，肽段1的子离子m/z值为875.42、818.40。另外，对于肽段2，在一级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z675.99具有最大响应值。即，肽段2的母离子m/z值为675.99。在二级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z914.46、746.38具有最大的两个响应值。即，肽段2的子离子m/z值为914.46、746.38。

在某些实施方案中，本发明的液相色谱-串连质谱的条件包括：以C₁₈色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B。质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V。

[第二鹿胶特征肽]

本发明的第二方面，提供第二鹿胶特征肽，其为通过氨基序列表征的特征肽。优选地，第二鹿胶特征肽包括肽段A和肽段B。其中肽段A的氨基酸序列如SEQ IDNo：1所示，肽段B的氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。如第一鹿胶特征肽类似，第二鹿胶特征肽可以是单独的肽段A或单独的肽段B，或者肽段A和肽段B的组合。

在某些实施方案中，本发明的第二鹿胶特征肽同时还具有第一鹿胶特征肽中所述的特征。例如，肽段A的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，同时其母离子m/z值为732.84，子离子m/z值为875.42、818.40。再例如，肽段B的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，同时其母离子m/z值为675.99，子离子m/z值为914.46、746.38。

[用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的组合物]

本发明的第三方面，提供用于鉴定鹿胶的组合物(有时简称为“本发明的组合物”)，其包含本发明的第一鹿胶特征肽或第二鹿胶特征肽作为参考物或内标物。本发明的参考物或内标物是指在鉴定鹿胶制品时作为比较对象的物质。本发明的组合物可用于判断待测样品是否为鹿胶制品，也可用于检测待测样品中是否包含鹿胶成分或鹿胶成分的含量。

本发明的组合物还可包含检测鹿胶的其他成分和/或装置。其他成分的实例包括但不限于铵溶液、胰蛋白酶、质谱检测所用的试剂(例如流动相)等。装置的实例包括但不限于色谱柱例如C₁₈色谱柱、小瓶或小管。其他成分或装置可采用本领域已知的产品或试剂。

[用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法]

本发明的第四方面，提供一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法(有时称作“本发明的方法”)，其包括检测本发明第一鹿胶特征肽或第二鹿胶特征肽的步骤。用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法包括鉴定待测样品是否为鹿胶的情形，即鉴定鹿胶真伪的情形，也包括鉴定待测样品中是否包含鹿胶的情形。

在示例性鉴定方法中，本发明的方法包括以下步骤：

(1)待测样品的处理步骤：取待测样品加铵溶液处理后，经胰蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到待测样品溶液；

(2)采用液相色谱-串连质谱法以电喷雾负离子模式进行多反应检测所述待测样品中是否存在鹿胶特征肽，其中液相色谱-串连质谱法的条件包括以C₁₈色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B，质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V；

(3)如果检测到母离子为732.84，且子离子为875.42、818.40；或母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38，则判定所述待测样品包含鹿胶。

在另外的示例性鉴定方法中，本发明的方法包括以下步骤：

(1’)鹿胶对照溶液的制备：取鹿胶作为对照物，加铵溶液处理后，经胰蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到鹿胶对照溶液；

(2’)待测样品溶液的制备：取待测样品，以与步骤(1)相同的方式制备得到待测样品溶液；

(3’)将所述步骤(1’)得到的鹿胶对照溶液与(2’)得到的待测样品溶液，采用液相色谱-串连质谱法，以电喷雾负离子模式，进行多反应监测，选择m/z732.84→875.42、818.40和/或m/z675.99→914.46、746.38作为检测离子对进行检测；

(4’)在待测样品的液相色谱-串联质谱图中，如果呈现与所述鹿胶对照色谱保留时间一致的质谱峰，则判定所述待测样品包含鹿胶；如果不出现相应的质谱峰，则判定所述待测样品不包含鹿胶。

上述两种示例性方法中使用的试剂或条件相同，并且可适用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的所有其他类似的方法。

本发明的铵溶液为用于处理鹿胶的溶液，优选为无机铵的水溶液。本发明发现将动物胶进行铵溶液处理后，经胰蛋白酶酶解可以得到能够区分鹿胶与其他动物胶的肽段。其中铵溶液的pH一般为7-8，优选7.4-7.8。优选地，铵溶液为选自由碳酸氢铵、醋酸铵和甲酸铵组成的组中的一种或多种物质的水溶液。铵溶液中无机铵的浓度一般为1-10重量％，优选2-8重量％，更优选5-6重量％。铵溶液的浓度越高，越有利于酶解得到所需的特征肽。每100ml铵溶液中动物胶的用量为0.1-5g，优选0.2-3g。铵溶液处理时间一般为5分钟至5小时，优选10分钟至60分钟。在某些实施方案中铵溶液在温度为30-50℃，优选35-45℃的密封环境中进行处理。

本发明的胰蛋白酶可为已知的酶。本发明的酶解条件是重要的。其包括每100μl样品液中含5μg-20μg，优选10-15μg的胰蛋白酶浓度，酶解温度为30-40℃，优选35-38℃，更优选37℃，酶解的时间为10-24小时，优选15-20小时。

本发明的多反应监测的裂解电压为120V，且碰撞能量为35V；或者裂解电压为100V，碰撞能量为25V。

实施例1

本实施例为鹿胶特征肽的筛选与鉴定，具体方法如下：

1、试剂与仪器

十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵、胰蛋白酶(Promega质谱测序级)、乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级(德国Merck公司)。

纳升级液相色谱系统：Eksigentekspert^TMnanoLC液相系统，EksigentsoftwareV.3.12液相工作站。高分辨质谱系统：TripleTOF5600，配有电喷雾离子源(ESI)、AnalystTF1.6色谱工作站、Peak View1.2质谱分析软件和ProteinPilot4.5蛋白质分析软件(美国AB Sciex公司)。离心浓缩仪(美国Labconco公司)；ZipTipC18 Pipette Tips(美国Millipore公司)。

2、胶类药材样品

收集鹿胶(鹿皮胶)、驴皮胶(阿胶)、牛皮胶(黄明胶)、猪皮胶(新阿胶)、马皮胶、羊皮胶等胶类药材，具体信息见下表。

表1胶类药材信息

3、胶类药材酶解

取各种胶类药材粉末0.1g，置于50ml锥形瓶中加入1％NH₄HCO₃溶液定容至刻度，使其溶解，配制胰蛋白酶溶液(胰酶100μg用Resuspension Buffer 1ml重新溶解)，取胶类药液100μl加入配制好的胰蛋白酶溶液10μl，37℃酶解12h，90℃孵育5min进行灭活，离心(10000r/min)，用C₁₈固相萃取脱盐，样品液氮气吹干，加水溶解，备用。

4、色谱分析

Eksigentekspert^TMnano-LC液相系统，色谱柱为5μmReprosil C₁₈ AQ(75μm×150mm)，LC-MS/MS系统分析不同胶类样品。上样量为5μL，流速400nL/min，流动相A(乙腈/甲酸/水＝2/0.2/98，v/v/v)，流动相B(乙腈/甲酸/水＝80/0.2/20，v/v/v)，2-30％B线性梯度洗脱60min。

AB SCIEXTripleTOF5600，ESI源，正离子扫描，喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 100-2000，分离宽度为3Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱。采用ProteinPilot蛋白质分析软件进行数据分析。选择Laurasiatheria数据库(Uniprot数据库下载)，检索参数设置为：前体离子误差10ppm；子离子误差1Da；允许2个位点误切，假阳性率(FDR)≤1％；酶切方式选择胰酶(Trypsin)，唯一肽段数(unique peptides)≥2；其他参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义(P＜0.05)被认定为有效的鉴定结果。

从表1样品中鉴定多肽：其中鹿胶样品中鉴定了280-611个肽段；阿胶中鉴定了183-326个肽段；牛皮胶中鉴定了365-513个肽段；猪皮胶中鉴定了348-510个肽段；马皮胶中鉴定了181-502个肽段；羊皮胶中鉴定了169-466个肽段；

筛选确定特征性肽段的策略分以下3步：①比较确定鹿皮胶样品中共性肽段信息，为集合A；②分别取不同类别样品胶中全部肽段信息(如不同批次阿胶样品肽段取并集)为集合B；③将集合A与集合B交叉分析，集合A中排除A、B交集的成分为集合A特异性成分，将各特异性成分进行分析，即可获得鹿胶中专属性多肽。

5、特征肽段序列的鉴定与结构分析

二级质谱数据采用PEAKS 7.5软件进行搜库鉴定分析，检索参数设置为：前体离子误差10ppm；子离子误差1Da；半胱氨酸残基固定修饰(氨甲酰甲基化57.02Da)；甲硫氨酸残基可变修饰(氧化+15.99Da)；N-端乙酰化(+42.01Da)；氨基甲酰化(+43.01Da)；允许2个位点误切，假阳性率(FDR)≤1％；选择胰蛋白酶酶切(Trypsin)；其他参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义(P＜0.05)被认定为有效的鉴定结果。

特征性肽段的鉴定图见图1和图2，肽段序列如表2所示。其中序列为SEQ ID No：1的肽有时也称作肽段一，序列为SEQ ID No：2的肽有时也称作肽段二。

表2

序号	肽段序列	分子量	m/z	来源
					SEQ ID No：1	SGETGASGPP(Hyp)GFAGEK	1463.65	732.84	鹿胶
SEQ ID No：2	GEVGPAGPDGFAGPAGAAGQSGAK	2024.96	675.99	鹿胶

实施例2

本实施例为基于特征肽的鹿胶与其它胶类药材的鉴别

1、试剂与仪器

十二烷基硫酸钠(SDS)，二硫苏糖醇(DTT)，碳酸氢铵，胰蛋白酶(Promega质谱测序级)，乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级(德国Merck公司)。

高分离度快速液相色谱仪串联三重四极杆质谱(美国AB公司)。离心浓缩仪(美国Labconco公司)；ZipTipC₁₈ Pipette Tips(美国Millipore公司)。

2、鹿胶及其它胶类药材

收集鹿胶(鹿皮胶)、驴皮胶(阿胶)、牛皮胶(黄明胶)、猪皮胶(新阿胶)、马皮胶、羊皮胶等胶类药材，见表1。

鹿胶对照药材，由梅花鹿皮制备而得。

3、样品处理

取各胶类药材粉末0.1g，加pH＝7.5醋酸铵溶液(3％)50ml，加热超声处理30分钟，用微孔滤膜滤过，取药液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液10μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，用C₁₈固相萃取脱盐，样品液氮气吹干，加水溶解，备用。同法制备阴性样品。

3、检测条件

液相条件：色谱柱为Waters C₁₈(2.1mm×50mm，1.8μm)，流速为0.3ml/min，流动相为以0.1％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱：0-10min，5％B-50％B；10-15min，50％B；

质谱条件：ESI正离子检测模式，雾化器温度：350℃，雾化器流速：10L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压：3500V，鞘流气温度：350℃，鞘流气流速：12L/min，毛细管电压4500V，锥孔电压：500V。

表3多反应监测(MRM)模式条件

4、专属性实验

分别以鹿皮胶对照药材为对照，鹿胶、驴皮胶、牛皮胶、猪皮胶、马皮胶、羊皮胶为样品，选择鹿皮胶特征离子对进行测定。

表4鹿胶及其它各类胶药材的检测结果

注：“+”表示检测有色谱峰；“-”表示检测无明显色谱峰。

结果显示，在待测样品液相色谱-质谱图中，五批鹿胶样品中同时呈现与鹿胶对照药材样品色谱保留时间一致的两个色谱峰，但其它各类伪品胶中均未检测到相应的色谱峰。说明该鹿胶特征肽及检测方法可以很好地鉴别鹿胶及其它胶类药材。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州广济堂药业有限公司

<120> 鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法

<130> 180080011ZC

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Cervus nippon Temminck

<400> 1

Ser Gly Glu Thr Gly Ala Ser Gly Pro Hyp Gly Phe Ala Gly Glu Lys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> Cervus nippon Temminck

<400> 2

Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asp Gly Phe Ala Gly Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gln Ser Gly Ala Lys

20

Claims (6)

1.一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿皮胶的方法，其包括检测鹿皮胶特征肽的步骤：

其中，所述鹿皮胶特征肽为SEQ ID No:2的肽。

2.根据权利要求1所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿皮胶的方法，其包括以下步骤：

(1)待测样品的处理步骤：取待测样品加铵溶液处理，经胰蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到待测样品溶液；

(2)采用液相色谱-串连质谱法检测所述待测样品中是否存在鹿皮胶特征肽；

(3)如果检测到母离子为675.99，且子离子为914.46、746.38，则判定所述待测样品包含鹿皮胶。

3.根据权利要求1所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿皮胶的方法，其包括以下步骤：

(1’)鹿皮胶对照溶液的制备：取鹿皮胶作为对照物，加铵溶液处理，经胰蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到鹿皮胶对照溶液；

(2’)待测样品溶液的制备：取待测样品，以与步骤(1’)相同的方式制备得到待测样品溶液；

(3’)将所述步骤(1’)得到的鹿皮胶对照溶液与(2’)得到的待测样品溶液，采用液相色谱-串连质谱法，以电喷雾负离子模式，进行多反应监测，选择m/z675.99→914.46、746.38作为检测离子对进行检测；

(4’)在待测样品的液相色谱-串联质谱图中，如果呈现与所述鹿皮胶对照色谱保留时间一致的质谱峰，则判定所述待测样品包含鹿皮胶；如果不出现相应的质谱峰，则判定所述待测样品不包含鹿皮胶。

4.根据权利要求2或3所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿皮胶的方法，其中所述铵溶液为选自由碳酸氢铵、醋酸铵和甲酸铵组成的组中的一种或多种物质的水溶液。

5.根据权利要求2或3所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿皮胶的方法，其中所述胰蛋白酶酶解条件包括酶浓度为每100μl样品液中含5μg-20μg，酶解温度为30-40℃，酶解的时间为10-24小时。

6.根据权利要求5所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿皮胶的方法，其中所述多反应监测的裂解电压为120V，且碰撞能量为35V；或者裂解电压为100V，碰撞能量为25V。

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