CN115894613A - 鹿胶特征肽及其在鹿胶制品鉴别中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开鹿胶特征肽及其在鹿胶制品鉴别中的应用。当采用液相色谱‑串联质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测时，本发明的鹿胶特征肽的母离子为854.07，且子离子为858.43、630.34；或母离子为408.21，且子离子为556.32、449.30；或母离子为786.82，且子离子为772.33、657.30。本发明的鹿胶特征肽能够辨识、鉴定鹿胶药材，基于此可建立以特征肽段离子对为指标的高效液相‑串联质谱快速检测方法(HPLC‑MS/MS)。此外，本发明方法可快速、灵敏地鉴定鹿胶及其制品，为鹿胶的市场应用与推广提供支撑。

Description

鹿胶特征肽及其在鹿胶制品鉴别中的应用

技术领域

本发明属于医药与食品检测技术领域，具体涉及一种鹿胶特征肽及其在鹿胶制品鉴别中的应用。

背景技术

鹿胶(亦称鹿皮胶)是由马鹿Cervuselaphus Linnaeus或梅花鹿CervusnipponTemminck的皮经熬制加工而成的特殊中药材，具有补肾壮阳，补血止血之功效。《本草纲目》中记载“鹿皮无毒，治一切漏疮，妇女白带，血崩不止，肾虚滑精”。自古以来鹿胶便是人们滋补养身的功能性保健食品，近些年随着生活水平的提高，鹿胶药材及其产品受到了越来越多的关注。

由于鹿胶功效显著，价格较贵，原料又相对短缺，市场上出现了采用其它动物皮或杂皮胶违法生产而成的伪品鹿胶，使得目前市场上鹿胶类药材的质量参差不齐。但鹿胶现行的药材质量标准十分简单，仅通过鉴别氨基酸类成分或仅通过控制氨基酸成分来进行质量控制，其质量控制缺乏专属性鉴别方法和高灵敏度的检测技术，同时由于鹿胶是鹿皮经高温加热熬制而成，其蛋白质已变性破坏，常用的动物类药材鉴定技术DNA-PCR亦无法对此进行鉴别，使得目前鹿胶缺乏有效的真伪鉴别方法。

近些年质谱多肽识别技术在动物胶类的鉴定、辨识中的应用越来越广泛。如程显隆等在特征肽段检测技术用于胶类药材专属性鉴别方法研究(中国中药杂志，2015，50(2):104-108)中公开了利用酶切技术及质谱识别技术对阿胶和新阿胶、黄明胶、龟甲胶进行了对比研究，并对特征肽进行检识，建立了几种胶类药材的鉴别方法。例如，CN105842375A公开了一组鉴别阿胶及其制品中驴源性成分的多肽，并利用特征多肽建立了以液质联用的阿胶及其制品的快速鉴定方法。

然而，针对鹿胶药材及其制品的质谱鉴别研究尚为空白，且国际上蛋白质序列库中没有鹿胶原蛋白完整的序列库，无法进行完整的谱库检索。因此，基于质谱建立鉴定鹿胶的方法存在困难。

发明内容

为解决现有技术中的少部分技术问题，本发明通过特定酶组合处理后的得到的鹿胶片段及其它动物胶进行分析，并进行系统的检测、比较、验证后，发现了能够辨识、鉴定鹿胶药材的特征性肽段，可以用于鹿胶真伪的鉴别，避免了当前仅用性状、外观进行鉴别容易出现假阳性的技术缺陷。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种鹿胶特征肽，当采用液相色谱-串联质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测时，所述鹿胶特征肽的母离子为854.07，且子离子为858.43、630.34；或所述鹿胶特征肽的母离子为408.21，且子离子为556.32、449.30；或所述鹿胶特征肽的母离子为786.82，且子离子为772.33、657.30。

在某些实施方案中，根据本发明所述的鹿胶特征肽，其中，所述液相色谱-串连质谱的条件包括：

以C₁₈色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B；

质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V和锥孔电压为500V。

本发明第二方面，提供一种鹿胶特征肽，其中所述鹿胶特征肽选自序列为SEQ IDNo:1、SEQ ID No:2和/或SEQ ID No:3的肽中的至少一种。

本发明的第三方面，提供一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的组合物，其包括根据本发明第二方面所述的鹿胶特征肽。

本发明的第四方面，提供一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括检测根据本发明第二方面所示的鹿胶特征肽的步骤。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括以下步骤：

(1)待测样品的处理步骤：取待测样品加铵溶液处理，经复合蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到待测样品溶液；

(2)采用液相色谱-串联质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测所述待测样品中是否存在鹿胶特征肽，其中液相色谱-串联质谱法的条件包括以C₁₈色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B，质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V；

(3)如果检测到母离子为854.07，且子离子为858.43、630.34；或母离子为408.21，且子离子为556.32、449.30；或母离子为786.82，且子离子为772.33、657.30，则判定所述待测样品包含鹿胶。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其包括以下步骤：

(1’)鹿胶对照溶液的制备：取鹿胶作为对照物，加铵溶液处理，经复合蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，脱盐，挥干，以初始流动相复溶得到鹿胶对照溶液；

(2’)待测样品溶液的制备：取待测样品，以与步骤(1’)相同的方式制备得到待测样品溶液；

(3’)将所述步骤(1’)得到的鹿胶对照溶液与(2’)得到的待测样品溶液，采用液相色谱-串联质谱法，以电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择m/z854.07→858.43、630.34，或m/z 408.21→556.32、449.30，或m/z 786.82→772.33、657.30作为检测离子对进行检测；

(4’)在待测样品的液相色谱-串联质谱图中，如果呈现与所述鹿胶对照色谱保留时间一致的质谱峰，则判定所述待测样品包含鹿胶；如果不出现相应的质谱峰，则判定所述待测样品不包含鹿胶。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中所述铵溶液为选自由碳酸氢铵、醋酸铵和甲酸铵组成的组中的一种或多种物质的水溶液。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中所述复合蛋白酶包括胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶所形成的复合酶。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其中C₁₈固相萃取脱盐是指将酶解后的溶液加入C₁₈固相萃取柱，以0.01-0.5％三氟乙酸水溶液淋洗除去无机盐。

本发明的技术效果包括但不限于：

本发明的鹿胶特征肽能够辨识、鉴定鹿胶药材，基于此可建立以特征肽段离子对为指标的高效液相-串联质谱快速检测方法(HPLC-MS/MS)。另外，本发明的鉴定方法采用高效液相-串连质谱技术，其检测的灵敏度高，不仅可以用于单一鹿胶的鉴别，还可以辨别标识含鹿胶的制品中是否含有鹿胶成分，扩大了本技术方法的应用范围。需要说明的是，本发明从鉴定的2000多条肽段中筛选了一组鹿胶特征肽，其具有优异的检测效果，能够在鹿胶中被检测到，而在伪品中无法检测出。

附图说明

图1为特征肽峰面积比值与掺伪比例曲线。

图2为鹿胶特征肽一质谱离子图。

图3为鹿胶特征肽二质谱离子图。

图4为鹿胶特征肽三质谱离子图。

图5为MRM模式下鹿胶特征肽一检测的质谱图。

图6为MRM模式下鹿胶特征肽二检测的质谱图。

图7为MRM模式下鹿胶特征肽三检测的质谱图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

动物胶是指由动物组织例如由动物皮制得的明胶。虽然动物来源不同，但是这些动物胶的主要成分均为胶原蛋白。因此，在蛋白质水平上很难将不同动物来源的明胶进行有效区分。发明人将不同来源的动物胶经铵溶液处理，然后经复合蛋白酶处理得到了大量短的肽片段，在通过高效液相-串联质谱快速检测方法(HPLC-MS/MS)进行肽段鉴定时意外发现部分肽片段仅存在于鹿科动物明胶中，而不存于其他哺乳动物的明胶或其酶解物中。至少部分地基于此完成了本发明。

本发明所述的“鹿胶”是指由鹿科动物的皮制得的明胶，因此，有时称作“鹿皮胶”。鹿胶的制备方法是本领域已知的。另外，可参考驴皮制备阿胶的工艺来制备。其中鹿科动物的实例包括但不限于马鹿Cervuselaphus Linnaeus或梅花鹿CervusnipponTemminck。

本发明所述的“鹿胶特征肽”包括后面所述的第一鹿胶特征肽、第二鹿胶特征肽和第三鹿胶特征肽，是指仅在鹿胶中存在，而不存在于其他动物，特别是在其他动物的皮制得的胶中不存在的肽。在优选的实施方案中，其他动物的实例包括但不限于驴、牛、猪、马和羊。因此，本发明的鹿胶特征肽优选至少不存在于驴皮胶(阿胶)、牛皮胶(黄明胶)、猪皮胶(新阿胶)、马皮胶和羊皮胶中，也不存在于这些胶的分解物中。即鹿胶特征肽并非这些胶中的蛋白的片段。

在某些实施方案中，本发明所用的蛋白酶为复合酶，优选为胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶两者的复合酶。所述复合酶与本发明的鹿胶特征肽不发生酶切反应。

在某些实施方案中，本发明的鹿胶特征肽为小分子肽段，例如由8-35个氨基酸组成的肽片段。

鹿胶特征肽

本发明的第一方面，提供第一鹿胶特征肽，其为通过液相色谱-串连质谱表征的特征肽。具体地，当通过液相色谱-串联质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测时，其仅显示存在于鹿胶中，至少不存在于驴皮胶(阿胶)、牛皮胶(黄明胶)、猪皮胶(新阿胶)、马皮胶和羊皮胶中。第一鹿胶特征肽可以是一种肽段，也可以是多种肽段的组合物。优选地，本发明的第一鹿胶特征肽为肽段。还优选地，所述肽段具有SEQ ID NO：1所示的序列。

在某些实施方案中，对于该肽段，当采用液相色谱-串联质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测时，在一级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z 854.07具有最大响应值。即，该肽段的母离子m/z值为854.07。在二级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z 858.43、m/z 630.34具有最大的两个响应值。即，该肽段的子离子m/z值为858.43、630.34。

本发明的第二方面，提供第二鹿胶特征肽。优选地，所述第二鹿胶特征肽具有SEQID NO：2所示的序列。在某些实施方案中，对于该肽段，在一级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z408.21具有最大响应值。即，该肽段的母离子m/z值为408.21。在二级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z 556.32、449.30具有最大的两个响应值。即，该肽段的子离子m/z值为556.32、449.30。

本发明的第三方面，提供第三鹿胶特征肽。优选地，所述第三鹿胶特征肽具有SEQID NO：3所示的序列。在某些实施方案中，对于该肽段，在一级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z 786.82具有最大响应值。即，该肽段的母离子m/z值为786.82。在二级质谱的m/z 100-2000全扫描范围内，在m/z 772.33、657.30具有最大的两个响应值。即，该肽段的子离子m/z值为772.33、657.30。

在某些实施方案中，本发明的液相色谱-串连质谱的条件包括：以C₁₈色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B。质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V。

用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的组合物

本发明的第四方面，提供用于鉴定鹿胶的组合物(有时简称为“本发明的组合物”)，其包含本发明的第一鹿胶特征肽、第二鹿胶特征肽和/或第三鹿胶特征肽作为参考物或内标物。本发明的参考物或内标物是指在鉴定鹿胶制品时作为比较对象的物质。本发明的组合物可用于判断待测样品是否为鹿胶制品，也可用于检测待测样品中是否包含鹿胶成分或鹿胶成分的含量。

本发明的组合物还可包含检测鹿胶的其他成分和/或装置。其他成分的实例包括但不限于铵溶液、蛋白酶、质谱检测所用的试剂(例如流动相)等。装置的实例包括但不限于色谱柱例如C₁₈色谱柱、小瓶或小管。其他成分或装置可采用本领域已知的产品或试剂。

用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法

本发明的第五方面，提供一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法(有时称作“本发明的方法”)，其包括检测本发明第一鹿胶特征肽、第二鹿胶特征肽和/或第三鹿胶特征肽的步骤。用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法包括鉴定待测样品是否为鹿胶的情形，即鉴定鹿胶真伪的情形，也包括鉴定待测样品中是否包含鹿胶的情形。

在示例性鉴定方法中，本发明的方法包括以下步骤：

(1)待测样品的处理步骤：取待测样品加铵溶液处理后，经复合蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到待测样品溶液；

(2)采用液相色谱-串联质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测所述待测样品中是否存在鹿胶特征肽，其中液相色谱-串联质谱法的条件包括以C₁₈色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B，质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V；

(3)如果检测到母离子为854.07，且子离子为858.43、630.34；或母离子为408.21，且子离子为556.32、449.30；或母离子为786.82，且子离子为772.33、657.30，则判定所述待测样品包含鹿胶。

在另外的示例性鉴定方法中，本发明的方法包括以下步骤：

(1’)鹿胶对照溶液的制备：取鹿胶作为对照物，加铵溶液处理后，经复合蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到鹿胶对照溶液；

(2’)待测样品溶液的制备：取待测样品，以与步骤(1)相同的方式制备得到待测样品溶液；

(3’)将所述步骤(1’)得到的鹿胶对照溶液与(2’)得到的待测样品溶液，采用液相色谱-串联质谱法，以电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择选择m/z 854.07→858.43、630.34，或m/z 408.21→556.32、449.30，或m/z 786.82→772.33、657.30作为检测离子对进行检测；

(4’)在待测样品的液相色谱-串联质谱图中，如果呈现与所述鹿胶对照色谱保留时间一致的质谱峰，则判定所述待测样品包含鹿胶；如果不出现相应的质谱峰，则判定所述待测样品不包含鹿胶。

上述两种示例性方法中使用的试剂或条件相同，并且可适用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的所有其他类似的方法。

在某些实施方案中，C₁₈固相萃取过程为，将酶解后溶液，加入C₁₈固相萃取小柱，以0.01-0.5％，优选0.05-0.2％，最优选0.1％的有机酸水溶液淋洗除去无机盐，再以80％-100％甲醇或乙腈洗脱，洗脱液经离心浓缩挥干，加水溶解，即得。其中，有机酸优选为含氟乙酸，还优选为三氟乙酸。

本发明的铵溶液为用于处理鹿胶的溶液，优选为无机铵的水溶液。本发明发现将动物胶进行铵溶液处理后，经复合蛋白酶酶解可以得到能够区分鹿胶与其他动物胶的肽段。其中铵溶液的pH一般为7-8，优选7.4-7.8。优选地，铵溶液为选自由碳酸氢铵、醋酸铵和甲酸铵组成的组中的一种或多种物质的水溶液。铵溶液中无机铵的浓度一般为1-10重量％，优选2-8重量％，更优选5-6重量％。铵溶液的浓度越高，越有利于酶解得到所需的特征肽。每100ml铵溶液中动物胶的用量为0.1-5g，优选0.2-3g。铵溶液处理时间一般为5分钟至5小时，优选10分钟至60分钟。在某些实施方案中，铵溶液在温度为30-50℃，优选35-45℃的密封环境中进行处理。

本发明的复合酶中的蛋白酶可为已知的酶。蛋白酶包括但不限于：胰蛋白酶、Lys-C蛋白酶。本发明的酶解条件是重要的。其包括每100μl样品液中含5μg-20μg，优选10-15μg的复合蛋白酶浓度，酶解温度为30-40℃，优选35-38℃，更优选37℃，酶解的时间为10-24小时，优选15-20小时。

本发明的多反应监测的裂解电压为80-120V，优选80-90V，且碰撞能量为25-40V，优选30-35V。

实施例1

本实施例为基于特征肽的鹿胶与其它胶类药材的鉴别，具体方法如下：

1、试剂与仪器

十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵、胰蛋白酶(Promega质谱测序级)、Lys-C蛋白酶(Promega质谱测序级)、乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级(德国Merck公司)。

高分离度快速液相色谱仪串联三重四极杆质谱(美国AB公司)。离心浓缩仪(美国Labconco公司)；ZipTipC18 Pipette Tips(美国Millipore公司)。

2、胶类药材样品

收集鹿胶(鹿皮胶)、驴皮胶(阿胶)、牛皮胶(黄明胶)、猪皮胶(新阿胶)、马皮胶、羊皮胶等胶类药材，具体信息见表1。

鹿胶对照药材，由梅花鹿皮制备而得。

3、样品处理

取各种胶类药材粉末0.1g，加pH＝7.5醋酸铵溶液50ml，加热超声处理30分钟，用微孔滤膜滤过，取药液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶+Lys-C蛋白酶复合酶(浓度0.15μg/μL)溶液10μL，加1％碳酸氢铵溶液制成每l ml中含l mg的溶液，临用时配制，摇匀，37℃恒温酶解12小时，用C₁₈固相萃取脱盐，样品液氮气吹干，加水溶解，备用。同法制备阴性样品。

4、检测条件

液相条件：色谱柱为Waters C₁₈(2.1mm×50mm，1.8μm)，流速为0.3ml/min，流动相为以0.1％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱：0-4.5min，5％B-30％B；4.5-5min，30％B；

质谱条件：ESI正离子检测模式，雾化器温度：350℃，雾化器流速：10L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压：3500V，鞘流气温度：350℃，鞘流气流速：12L/min，毛细管电压4500V，锥孔电压：500V；

多反应监测(MRM)模式条件如下表所示：

5、专属性实验

分别以鹿皮胶对照药材为对照，鹿胶、驴皮胶、牛皮胶、猪皮胶、马皮胶、羊皮胶为样品，选择鹿皮胶特征离子对进行测定。

本实施例使用的特征性肽段序列如下表所示。其中序列为SEQ ID No:1的肽有时也称作肽段一，序列为SEQ ID No:2的肽有时也称作肽段二，序列为SEQ ID No:3的肽有时也称作肽段三。

表1鹿胶及其它各类胶药材的检测结果

注：“+”表示检测有色谱峰；“-”表示检测无明显色谱峰。

如图2-7所示，结果显示，在待测样品液相色谱-质谱图中，五批鹿胶样品中同时呈现与鹿胶对照药材样品色谱保留时间一致的两个色谱峰，但其它各类伪品胶中均未检测到相应的色谱峰。说明该鹿胶特征肽及检测方法可以很好地鉴别鹿胶及其它胶类药材。

实施例2

本实施例为基于特征肽的鹿胶掺入牛皮胶的鉴别，具体如下。

1、试剂与仪器

十二烷基硫酸钠(SDS)，二硫苏糖醇(DTT)，碳酸氢铵，胰蛋白酶(Promega质谱测序级)，Lys-C蛋白酶(Promega质谱测序级)、乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级(德国Merck公司)。

高分离度快速液相色谱仪串联三重四极杆质谱(美国AB公司)。离心浓缩仪(美国Labconco公司)；ZipTipC18 Pipette Tips(美国Millipore公司)。

2、胶类药材及样品处理

取鹿胶(鹿皮胶)与牛皮胶粉末，将牛皮胶按照5％，10％，20％，50％及80％的比例掺入鹿胶，混合均匀。取各比例的混合胶类药材粉末0.l g，加pH＝7.5醋酸铵溶液50ml，加热超声处理30分钟，用微孔滤膜滤过，取药液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶+Lys-C蛋白酶复合酶(浓度0.15μg/μL)溶液10μL(取序列分析用复合蛋白酶(浓度0.15μg/μL)，加1％碳酸氢铵溶液制成每l ml中含l mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，用C₁₈固相萃取脱盐，样品液氮气吹干，加水溶解，备用。同法制备阴性样品。

3、检测条件

液相条件：色谱柱为Waters C₁₈(2.1mm×50mm，1.8μm)，流速为0.3ml/min，流动相为以0.1％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱：0-4.5min，5％B-30％B；4.5-5min，30％B；

质谱条件：ESI正离子检测模式，雾化器温度：350℃，雾化器流速：10L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压：3500V，鞘流气温度：350℃，鞘流气流速：12L/min，毛细管电压4500V，锥孔电压：500V；

多反应监测(MRM)模式条件如下表：

4、掺伪比例计算

对不同掺伪比例的样品进行分析检测，掺伪样品中同时存在鹿胶特征肽Pep-3与牛皮胶特征肽Pep-10，将特征肽Pep-3与Pep-10的峰面积比值(APep-3/APep-10)与掺伪比例绘制曲线，如图1所示，曲线线性良好，表明掺伪比例与特征肽峰面积之间关系密切，也可据此对鹿胶中掺入牛皮胶的样品进行分析鉴定，确定掺伪比例。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (10)

1.一种鹿胶特征肽，其特征在于，当采用液相色谱-串联质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测时，所述鹿胶特征肽的母离子为854.07，且子离子为858.43、630.34；或者所述鹿胶特征肽的母离子为408.21，且子离子为556.32、449.30；或者所述鹿胶特征肽的母离子为786.82，且子离子为772.33、657.30。

2.根据权利要求1所述的鹿胶特征肽，其特征在于，所述液相色谱-串连质谱的条件包括：

以C₁₈色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B；

质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V和锥孔电压为500V。

3.一种鹿胶特征肽，其特征在于，所述鹿胶特征肽选自序列为SEQ ID No:1、SEQ IDNo:2和SEQ ID No:3的肽中的至少一种。

4.一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的组合物，其包括根据权利要求1-3任一项所述的鹿胶特征肽。

5.一种用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其特征在于，其包括检测根据权利要求1-3任一项所示的鹿胶特征肽的步骤。

6.根据权利要求5所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)待测样品的处理步骤：取待测样品加铵溶液处理，经复合蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，得到待测样品溶液；

(2)采用液相色谱-串联质谱法以电喷雾正离子模式进行多反应检测所述待测样品中是否存在鹿胶特征肽，其中液相色谱-串联质谱法的条件包括以C₁₈色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，且所述流动相A为0.1体积％甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-10min，5-50体积％流动相B，10-15min，50体积％的流动相B，质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10L/min，雾化器压力为35psi，毛细管电压为3500V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12L/min，毛细管电压为4500V，和锥孔电压为500V；

(3)如果检测到母离子为854.07，且子离子为858.43、630.34；或母离子为408.21，且子离子为556.32、449.30；或母离子为786.82，且子离子为772.33、657.30，则判定所述待测样品包含鹿胶。

7.根据权利要求5所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1’)鹿胶对照溶液的制备：取鹿胶作为对照物，加铵溶液处理，经复合蛋白酶酶解，C₁₈固相萃取，脱盐，挥干，以初始流动相复溶得到鹿胶对照溶液；

(2’)待测样品溶液的制备：取待测样品，以与步骤(1’)相同的方式制备得到待测样品溶液；

(3’)将所述步骤(1’)得到的鹿胶对照溶液与(2’)得到的待测样品溶液，采用液相色谱-串联质谱法，以电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择m/z854.07→858.43、630.34，或m/z 408.21→556.32、449.30，或m/z 786.82→772.33、657.30作为检测离子对进行检测；

(4’)在待测样品的液相色谱-串联质谱图中，如果呈现与所述鹿胶对照色谱保留时间一致的质谱峰，则判定所述待测样品包含鹿胶；如果不出现相应的质谱峰，则判定所述待测样品不包含鹿胶。

8.根据权利要求6或7所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其特征在于，其中所述铵溶液为选自由碳酸氢铵、醋酸铵和甲酸铵组成的组中的一种或多种物质的水溶液。

9.根据权利要求6或7所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其特征在于，所述复合蛋白酶包括胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶。

10.根据权利要求9所述的用于鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法，其特征在于，其中C₁₈固相萃取脱盐是指将酶解后的溶液加入C₁₈固相萃取柱，以0.01-0.5％有机酸水溶液淋洗除去无机盐。

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