CN112898400B - 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可区分鹿皮胶与鹿角胶的特征肽段及其检测方法，本发明通过大量实验筛选，以非标记多肽定量方法、主成分分析及含量比较法，确定能够区分鹿皮胶与鹿角胶的特征肽段Pep‑1与Pep‑2，根据Pep‑1、Pep‑2与参比肽Pep‑R相的对含量限度，可区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。

Description

一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种鹿源特征肽段及其检测方法，具体涉及区分鹿皮胶与鹿角胶的特征肽段及其检测方法。
技术背景
胶类药材包括阿胶、鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶等，80%以上的成分为不同类别的胶原蛋白，包括I型胶原α1链（COL1A1）、I型胶原α2链（COL1A2）、II型胶原α1链（COL2A1）、III型胶原α1链（COL3A1）等，其中以COL1A2来源的肽段为主。COL1A2作为高保守蛋白质，广泛存在于不同动物种体内，是构成胶类药材的重要蛋白类成分之一。
鹿角胶与鹿皮胶均来源于梅花鹿或马鹿，两者为名贵胶类中药材，鹿角胶为梅花鹿或马鹿角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，鹿皮胶为梅花鹿或马鹿的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。鹿角为马鹿或梅花鹿已骨化的角，价格远高于鹿皮，市场上存在以鹿皮胶掺入鹿角胶以次充好的现象。如何将鹿皮胶与鹿角胶进行区分，着实是胶类药材鉴定研究的难题，给鹿角胶与鹿皮胶鉴别，以及鹿角胶掺入鹿皮胶的伪品鉴别都带来了挑战。
鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，且两者均来源于梅花鹿或马鹿，其蛋白质组成相同，因此，通过寻找专属性肽段来区分两者基本不可能。
发明内容：
发明目的：本发明通过大量是实验筛选，研究筛选出2条鹿源肽段与参比肽段的相对含量的比值，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段，其特征在于，所述的特征肽为：
Pep-1:
Gly-Asp-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ile-Gly-Asn-Val-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Arg；
Pep-2：
Gly-Gly-Hyp-Gly-Gly-Hyp-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys；
Pep-R：
Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Ser-Gly-Arg。
一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将上述的Pep-1和Pep-2 两个鹿源特征肽及参比肽Pep-R配成混合对照品溶液；
（2）将待检测鹿皮胶与鹿角胶的胶类样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤（1）鹿源特征肽混合对照品溶液注入液质联用仪，以鹿源特征肽对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：Pep-1：m/z 864.7（三电荷）→568.1、m/z 864.7（三电荷）→398.3；Pep-2：m/z 583.6（双电荷）→526.8、m/z 583.6（双电荷）→342.2进行检测；Pep-R：m/z 916.9（双电荷）→772.4、m/z 916.9（双电荷）→715.3。以Pep-1峰面积A1与Pep-R峰面积AR比值或Pep-2峰面积A2与Pep-R峰面积AR比值确定样品为鹿皮胶或鹿角胶。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，所述的酶切方法为：所述的酶切方法为：取待检测鹿皮胶与鹿角胶的胶类药材样品，加入磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，离心，取上清液，置于离心管中，以 PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入三氟乙酸溶液终止反应，离心，即得胶类药材酶解液，冷藏保存，备用。
作为更加优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，所述的酶切方法为：取待检测胶类药材样品10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10% 三氟乙酸溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1%~10%。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm × 100 mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，流动相A（乙腈），流动相B（0.1%甲酸），0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：Pep-1：m/z 864.7（三电荷）→568.1；Pep-2：m/z 583.6（双电荷）→526.8；Pep-R：m/z916.9（双电荷）→772.4。
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。
设置特征肽对应的离子对条件如下：
Pep-1：m/z 864.7（三电荷）→568.1，DP=185.91, CE=36.97；
Pep-1：m/z 864.7（三电荷）→398.3，DP=165.95, CE=43.17；
Pep-2：m/z 583.6（双电荷）→526.8，DP=65.94, CE=26.91；
Pep-2：m/z 583.6（双电荷）→342.2，DP=66.25, CE=27.99；
Pep-R：m/z 916.9（双电荷）→772.4，DP=132.42, CE=38.60；
Pep-R：m/z 916.9（双电荷）→715.3，DP=130.46, CE=37.57。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，鹿角胶的 A1/AR不得低于5.0，A 2/AR不得高于0.5；鹿皮胶的A1/AR不得高于1.0，A 2/AR不得低于0.8。
有益效果：本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明通过大量是实验筛选，研究筛选出2条鹿源肽段与参比肽段的相对含量的比值在鹿角胶和鹿皮胶中不同，从而来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。从而可以克服现有技术中，鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，专属性肽段也难以区分的不足，取得了非常好的技术进步。
附图说明
图1为LFQ肽段的散点图。
图2为Pep-1的质谱图。
图3为Pep-2的质谱图。
图4为Pep-R的质谱图。
图5为Pep-1、Pep-2在鹿皮胶(DCG)与鹿角胶（DHG）中的含量。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
一种鹿源特征肽，所述的特征肽序列有3个，如序列表NO1~NO3：
Pep-1:
Gly-Asp-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ile-Gly-Asn-Val-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Arg
Pep-2：
Gly-Gly-Hyp-Gly-Gly-Hyp-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys
Pep-R：
Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Ser-Gly-Arg。
实施例2 Pep-1、Pep-2、Pep-R的确定
1.鹿皮胶和鹿角胶酶解液的制备：
取5批次鹿皮胶样品和5批次鹿角胶样品，每批次各取10 mg，分别加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入1%胰蛋白酶（w/v），摇匀，37℃恒温酶解12 h，酶解后加入10% TFA溶液60 μl终止反应，Seppak C18脱盐处理，离心浓缩干燥，以纯水复溶，测定多肽浓度，再次离心浓缩干燥，置于-20℃保存，得到5批次鹿皮胶和5批次鹿角胶的酶解样品，备用。
2、用戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5 μm Reprosil C18AQ（75μm× 150 mm），LC-MS/MS质谱系统分析样品。
用初始流动相复溶5批次的鹿皮胶与鹿角胶酶解样品，调整多肽浓度为1 μg/μl，上样2 μl，流速400 nL/min，流动相A（乙腈/甲酸/水=2/0.2/98，v/v/v），流动相B（乙腈/甲酸/水=80/0.2/20，v/v/v），2~30%B线性梯度洗脱120 min。Thermo Q-Exactive Orbitrap质谱仪用于进行肽段分析，喷雾电压为2.5 kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 300~2000，分离宽度为3；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离（CID）二级串联质谱，每个样品重复进样1次。采用Xcalibur（3.0.63）软件进行数据采集。
串联质谱数据用PEAKS 8.5软件进行搜库分析，选择鹿胶原蛋白数据库搜索，检索参数设置为：前体离子误差10；子离子误差1；翻译后修饰（PTM）的设置参数为：脯氨酸的羟基化（+15.99）；天门冬酰胺与谷氨酰胺的脱酰胺（+0.98）；允许2个位点误切，假阳性率（FDR）≤1%；选择胰蛋白酶酶切（Trypsin），在上述检索条件下所得分值有显著性意义（P <0.05）被认定为有效的鉴定结果。
Label free定量（LFQ）通过比较提取离子色谱（XIC）和PEAK Studio 8.5计算峰面积，计算相对表达水平的变化。采集的LC-MS/MS数据首先通过软件进行校准。以其中一个样品为参照，以总离子流（TIC）对每一个鉴定肽的峰面积进行归一化，对鉴定肽的相对含量进行定量分析。
将肽段的LFQ结果以Fold change（FC）取log2为横坐标，显著性差异P值取−log10为纵坐标，作散点图，取FC > 3，P < 0.01的肽段为鹿皮胶与鹿角胶中显著变化的肽段。如图1所示，Pep-1与Pep-2为离散点，即在鹿皮胶与鹿角胶中含量差异大，且可用来区分鹿皮胶与鹿角胶。Pep-1、Pep-2、Pep-R的MS/MS图分别见图2、图3和图4。
实施例3 鹿皮胶与鹿角胶A1/AR、A 2/AR的测定
取10批次鹿皮胶样品、10批次鹿角胶样品，每批次各取10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入1%胰蛋白酶（w/v），摇匀，37℃恒温酶解12 h，酶解后加入10%TFA溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得10批次的鹿皮胶、鹿角胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将上述10批次的鹿皮胶和鹿角胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1 μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱（2.1 μm × 100 mm），流速0.3ml/min，流动相A（乙腈），流动相B（0.1%甲酸），0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式（ESI+），质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
Pep-1：m/z 864.7（三电荷）→568.1，DP=185.91, CE=36.97；
Pep-2：m/z 583.6（双电荷）→526.8，DP=65.94, CE=26.91；
Pep-R：m/z 916.9（双电荷）→772.4，DP=132.42, CE=38.60。
10个批次鹿皮胶、鹿角胶A1/AR、A 2/AR数值见表1和图5，鹿皮胶的A1/AR、A 2/AR平均值分别为0.53±0.09、1.33±0.34，鹿角胶的A1/AR、A 2/AR平均值分别为7.48±2.12、0.21±0.09。
根据结果规定：鹿角胶的 A1/AR不得低于5.0，A 2/AR不得高于0.5，鹿皮胶的A1/AR不得高于1.0，A 2/AR不得低于0.8。
表1 鹿皮胶、鹿角胶的A1/AR、A 2/AR结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
序列表
<110> 南京中医药大学
<120> 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Ala Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Gly Arg
20

Claims (4)

1.一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段为：
Pep-1:
Gly-Asp-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ile-Gly-Asn-Val-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys-Gly-Ala-Arg
Pep-2：
Gly-Gly-Hyp-Gly-Gly-Hyp-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys
参比肽Pep-R：
Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Ser-Gly-Arg；
将特征肽段Pep-1、Pep-2及参比肽Pep-R配成混合对照品溶液；
（2）将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤（1）混合对照品溶液注入液质联用仪，以Pep-1和Pep-2对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：Pep-1：m/z 864.7三电荷→568.1、m/z 864.7三电荷→398.3；Pep-2：m/z 583.6双电荷→526.8、m/z 583.6双电荷→342.2进行检测；Pep-R：m/z 916.9双电荷→772.4、m/z 916.9双电荷→715.3；以Pep-1峰面积A1与Pep-R峰面积AR比值或Pep-2峰面积A2与Pep-R峰面积AR比值确定样品为鹿皮胶或鹿角胶；鹿角胶的 A1/AR不得低于5.0，A 2/AR不得高于0.5，鹿皮胶的A1/AR不得高于1.0，A 2/AR不得低于0.8；
所述的液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm ×100 mm，上样量为2μl，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸，流速0.3ml/min，0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱。
2.根据权利要求1所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，加入磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，离心，取上清液，置于离心管中，以 PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入三氟乙酸溶液终止反应，离心，即得酶解液，冷藏保存，备用。
3.根据权利要求2所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1%~10%。
4.根据权利要求2所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的检测方法，其特征在于，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解或酶固定化酶解。
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CN112098578A (zh) * 2020-09-01 2020-12-18 南京中医药大学 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
CN112098579A (zh) * 2020-09-01 2020-12-18 南京中医药大学 一种鹿源特征肽段及其检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (2)

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Title
基于"多肽组-修饰组"比较分析鹿皮与鹿皮胶物质基础;刘睿等;《药学学报》;20201231(第08期);第1882-1888页 *
基于"蛋白质/肽组学-修饰组学"研究动物药功效物质基础的思路与方法;刘睿等;《药学学报》;20201231(第08期);第1735-1743页 *

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