CN113848259A - 基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法及应用，所述蛋白类泛素化修饰位点检测方法包括以下步骤：步骤S1：构建获得体外SUMO化修饰反应体系，以获得目标蛋白；步骤S2：对步骤S1所获得的目标蛋白进行胰蛋白酶酶切，获得酶切后的多肽肽段；步骤S3：将步骤S2获得的多肽通过液相色谱质谱联用分析采集得到多肽质谱数据，经数据解析，得到修饰位点以及核心肽段的序列；步骤S4：化学合成含有SUMO化修饰位点的同位素标记肽段序列，采用PRM方法进行位点确证，确定一套母‑子离子对；步骤S5：用步骤S4建立的母‑子离子对对内源修饰位点进行检测；所述SUMO化修饰是指SUMO1类泛素化修饰。

Description

基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法及应用

技术领域

本发明涉及蛋白质翻译后修饰位点的检测，更具体地讲，涉及蛋白质类泛素化修饰位点的检测及应用。

背景技术

蛋白翻译后修饰(post-translational modifications，PTMs)是一种蛋白功能调节的重要方式，对生理和病理条件下蛋白质的结构和功能都至关重要。具体是指蛋白质从翻译起始到形成有功能的蛋白过程中，其氨基酸序列的特定位置与化学基团或者小分子蛋白发生共价结合的过程，通过增减特定修饰基团来改变蛋白质的分子量、疏水性、构象以及稳定性从而影响蛋白质的功能，这些修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化、甲基化等。翻译后修饰已经被证明参与基因表达、信号传导、细胞分裂等多种生命进程。其中泛素化修饰介导真核细胞中大部分蛋白质的选择性降解。泛素(ubiquitin，UB)是一类高度保守的小分子量蛋白质，含有76个氨基酸残基，广泛存在于真核细胞中，可与底物蛋白的赖氨酸残基共价连接，形成多聚泛素链从而被蛋白酶体识别而降解。而类泛素蛋白结构与泛素类似，具有保守的泛素结构域，在真核细胞中广泛存在。

类泛素化修饰(SUMOylation)是一种小的泛素相关修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier，SUMO)在E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶的协同作用下通过可逆的共价结合连接到目标蛋白上的过程。该修饰控制蛋白质的构象、稳定性、相互作用和亚细胞定位，因此涉及多个关键的细胞过程，包括细胞周期、凋亡、代谢和应激适应等。类泛素化酶的功能异常可能导致细胞增殖和基因组稳定性的严重缺陷，诱导产生多种类型的肿瘤。此外，已有报道显示抑制类泛素化可诱导myc过表达实体肿瘤的死亡，使得已经产生化疗抵抗性的白血病细胞凋亡，表明SUMO通路是抗癌靶点。类泛素化修饰在肿瘤发生发展过程中发挥着至关重要的作用，定性和定量分析蛋白SUMO化修饰位点对于探究蛋白质SUMO化修饰的生物学效应，寻找疾病治疗靶点具有重要意义。但是目前相对于泛素化，对于类泛素化修饰位点鉴定及定量的研究极少。

一直以来对蛋白质类泛素化修饰位点鉴定的难点在于SUMO化修饰的不稳定性，细胞内源SUMO化修饰会被SENP(SUMO-specific protease)介导的反应消除，导致蛋白SUMO化修饰的可检测量极低，在进一步的鉴定中如何排除非修饰蛋白干扰是一个重要挑战。

目前针对蛋白质类泛素化修饰位点的鉴定方法，主要是利用修饰或者蛋白特异性的抗体对内源性的修饰蛋白/肽段进行富集。然而，基于抗体的检测方法会受到抗体特异性以及通量的限制，难以进行大规模应用。并且，抗体检测精度较低，难以确定赖氨酸残基上修饰发生的位置，无法满足对于位点特异性研究的需求。

另外，位点突变法分析修饰也是常用的鉴定方法之一，该方法的缺陷是必须建立各种突变位点的文库，将所有可能的赖氨酸都突变成精氨酸，此方法工作量大、成本高，并且后期依然要基于抗体进行蛋白免疫印迹(Western blot)验证。

此外，随着质谱技术的发展，质谱方法也逐渐被应用到翻译后修饰位点的分析中，但是由于SUMO化修饰由很长的氨基酸酸支链构成，在质谱中碎裂后的二级谱图极其复杂，另一方面受限于离子化效率，常规分析方法较难获得完整的碎片离子信号，目前仍没有商业化的软件可以直接进行数据分析，是SUMO化修饰位点鉴定的另一挑战。

例如：公开号为：CN104749143A，公开日为2015年7月1日，名称为“一种蛋白质类泛素化修饰的检测方法”的中国专利文献公开了一种检测方法。但是该专利文献所公开的技术方案存在如下缺陷：1.仅基于双砷染料标记，通过单分子成像技术分析待检测蛋白是否发生类泛素化修饰，但是无法明确发生类泛素化修饰的氨基酸位点。2.由于待检测的蛋白是通过外源转入，不能真实反应内源性的修饰水平。即使量化分析，仅能分析独立样本中单泛素化和多聚泛素化的水平。3、该技术方案无法进行不同样本间如不同生理、病理状态下的量化比较。

又例如：公开号为CN103776909A，公开日为2014年5月7日，名称为“一种蛋白质类泛素化修饰位点鉴定方法”的中国专利文献公开了一种蛋白类泛素化修饰位点鉴定方法。该专利文献所公开的技术方案虽然也是基于质谱的检测方法，但是缺陷在于需要基于抗体对待测蛋白进行富集，此方法会受到抗体特异性以及通量的限制，并且前期需要对游离赖氨酸进行标记，成本高，操作繁琐。另外，抗体富集的重复性、稳定性不易控制，使得对于修饰水平的量化分析无法实现。

基于此，期望获得一种新的蛋白类泛素化修饰位点的检测方法，该检测方法是可以明确泛素化修饰的特定氨基酸位点，并对此位点发生的内源性泛素化修饰水平进行量化，并且可以做到绝对定量。此外，该检测方法不依赖于抗体，大大降低了成本。在质谱采集方法上创新性的采用数据非依赖(SWATH/DIA)的采集方法，避免遗漏低丰度的离子，因为类泛素化修饰侧链的离子化效率极低，传统的质谱采集方法很难采集到全面的碎片离子信息。并且基于MRM方法可以实现高灵敏度、高通量的量化分析。此外，所期望获得的基于高精度质谱的蛋白类泛素化检测方法为鉴定蛋白类泛素化修饰位点提供了有用的工具，具有现有鉴定方法不具备的优势，能够应用于更多的类泛素化修饰位点的鉴定和定量中。

发明内容

基于现有蛋白类泛素化修饰位点的鉴定方法存在的技术限制或缺陷，本发明的目的在于提供一种基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法及应用。该蛋白类泛素化修饰位点检测方法是一种蛋白SUMO化位点鉴定方法，其可以成功应用于肿瘤细胞和临床样本的鉴定中。本发明所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法不依赖于特异性抗体对修饰蛋白或肽段的富集，通过在体外构建蛋白SUMO化反应系统，提高了目标蛋白的含量，并排除了SENP介导的去修饰化对SUMO化修饰的影响，提高了可检测修饰水平。同时，体外反应体系只包含目标蛋白及催化该反应的蛋白酶，极大程度的降低了非修饰信号及其他杂蛋白的干扰，因而，使得本案的方法成本更低，适用范围更广。体外反应体系中的蛋白经过酶解获得多肽序列，然后采用数据非依赖方法(SWATH/DIA)方法采集肽段信息，可以获得更全面的SUMO侧链及核心肽段的碎片离子信息。更重要的是，本发明所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法具有一套人工解谱的分析流程，兼容已有质谱分析软件，可在已有软件下进行SUMO化数据分析，获得可靠的修饰肽段序列，节约了成本。最后通过多重反应监测技术(MRM，Multiple-reaction monitoring)确证内源性肽段序列。本发明的MRM方法相较于传统基于免疫沉淀(IP)和Western Blot的验证方法具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽、自动化、高通量的突出优点，既可以实现相对定量，又可以基于合成同位素标肽实现绝对定量。

为了实现上述目的，本发明从以下几个方面实现：

第一方面、本发明提出了一种基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，所述蛋白类泛素化修饰位点检测方法包括以下步骤：

步骤S1：构建获得体外SUMO化修饰反应体系，以获得目标蛋白；

步骤S2：对步骤S1所获得的目标蛋白进行胰蛋白酶酶切，获得酶切后的多肽肽段，其中，胰蛋白酶的加入质量与目标蛋白的反应比例为1∶10～1∶100；

步骤S3：将步骤S2获得的多肽通过液相色谱质谱联用分析采集得到多肽质谱数据，经数据解析，得到修饰位点以及核心肽段的序列；

步骤S4：化学合成含有SUMO化修饰位点的同位素标记肽段序列，采用PRM方法进行位点确证，确定一套母-子离子对；

步骤S5：用步骤S4建立的母-子离子对对内源修饰位点进行检测；

所述SUMO化修饰是指SUMO1类泛素化修饰。

优选地，在所述步骤S1中，具体包括如下步骤：

步骤S11：根据需要的目标蛋白，通过基因克隆技术获得目标蛋白的目标基因，并将目标基因克隆进入表达载体从而构建融合表达质粒；

步骤S12：将步骤S10构建获得的融合表达质粒，转入外源基因表达系统中进行外源表达，得到融合蛋白；

步骤S13：纯化所述融合蛋白。

优选地，在所述步骤S30的纯化为亲和色谱柱纯化。

优选地，在所述步骤S3中，所述液相色谱质谱联用分析采用基于EksigentNanoLC-Triple TOF 5600色谱质谱串联系统，采用数据非依赖采集模式。

优选地，在所述步骤S4中，具体包括如下步骤：

步骤S31：采用ChopNspice软件预测经酶切之后的SUMO1侧链的碎片离子，采用b系列离子作为诊断离子；

步骤S32：采用Peakview软件在所有采集到的二级质谱图中提取诊断离子信号，根据诊断离子的XIC的峰形、强度和一致性，锁定潜在的SUMO化修饰肽段并确定对应二级质谱图的保留时间和扫描质量范围；

步骤S33：在上述质量范围及保留时间内对一级质谱图进行解卷积处理，计算出潜在的肽段母离子精确分子量；

步骤S34：采用GPMAW软件对目标蛋白的fasta序列进行理论酶切，并采用ChopNspice软件模拟修饰，随后匹配成功的多肽肽段为目标肽段

步骤S35：将目标肽段通过Peakview软件模拟目标肽段的碎片离子并与诊断离子对应的二级谱图进行匹配，完美匹配上的肽段为含有类泛素化修饰位点的序列，得到修饰位点以及核心肽段。

优选地，在步骤S2中，进行胰蛋白酶酶切时，允许一个漏切位点，过滤掉所有只含有1个K的肽段或者仅在C端出现一个K/R的肽段，酶切后获得的多肽肽段采用ChopNspice软件模拟修饰，即将胰蛋白酶酶切后的SUMO1残基肽链，序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ IDNO.1实际为ELGMEEEDVIEVYQEQTGG。

优选地，在所述步骤S3中，位点确证方法采用MRM质谱采集方法基于nano-HPLC-Triple Quad 5500plus检测系统完成；所述nano-HPLC-Triple Quad 5500plus测系统采用AB Sciex。

优选地，所述MRM质谱采集方法具体步骤如下：

步骤S41：化学合成稳定同位素标记肽段，肽段序列即为中匹配成功的氨基酸序列，包括修饰侧链及核心肽段序列，同位素标记采用C13和N15；

步骤S42：将步骤S41获得的稳定同位素标记肽段作为标准，配置成一定浓度的工作液，首先经Eksigent NanoLC-Triple TOF 5600色谱质谱串联系统采用PRM(平行反应监测，Parallel Reaction Monitoring)质谱采集方法采集肽段的二级谱图，挑选其中信号强度最高的3-6个碎片离子建立母-子离子对；(即transitions)

步骤S43：：将标准品掺入到待检测样本中，基于MRM质谱采集方法，采集步骤S42中的母-子离子对，利用Skyline软件进行数据分析，结合软件打分和人工确认提取目标母-子离子对的信号并确认其保留时间；

步骤S44：利用步骤S43中确认的母-子离子对及精确保留时间，即可建立一套类泛素化位点鉴定的检测方法。

第二方面，本发明还提出了一种蛋白质类泛素化修饰的分析试剂盒，所述分析试剂盒包括：

待测蛋白质表达质粒、蛋白质纯化试剂以及标准品；

所述分析试剂盒进行分析时采用上述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法进行检测。

第三方面，本发明提出了一种上述的分析试剂盒在肿瘤相关检测产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明可以明确泛素化修饰的特定氨基酸位点，并对此位点发生的内源性泛素化修饰水平进行量化，并且可以做到绝对定量。

(2)本发明不依赖于抗体，大大降低了成本。在质谱采集方法上创新性的采用数据非依赖(SWATH/DIA)的采集方法，避免遗漏低丰度的离子，因为类泛素化修饰侧链的离子化效率极低，传统的质谱采集方法很难采集到全面的碎片离子信息。并且基于MRM方法可以实现高灵敏度、高通量的量化分析。

(3)本发明的基于高精度质谱的蛋白类泛素化检测方法为鉴定蛋白类泛素化修饰位点提供了有用的工具，具有现有鉴定方法不具备的优势，能够应用于更多的类泛素化修饰位点的鉴定和定量中。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为SUMO修饰位点鉴定流程示意图；

图2为SUMO化修饰侧链诊断离子；

图3为SUMO诊断离子的XIC提取谱图；

图4为ChopNspice软件预测的修饰肽段的分子量与在保留时间31.04min的带4个电荷，分子量为883.44的峰完美匹配；

图5为SUMO化修饰肽段(ELGMEEEDVIEVYQEQTGG)IISKIENHEGVR的预测二级质谱图与带4个电荷，分子量为883.44的二级谱图完美匹配；

图6为多反应监测质谱(MRM)分析白血病细胞系中的sumo化PKM2；

图7为多反应监测质谱(MRM)分析来自AML患者的原发性骨髓单个核细胞(BMMC)样本中的sumo化PKM2。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

术语解释

DDA技术：Data Dependent Acquisition，数据非依赖采集模式，质谱数据采集模式的一种。在这种模式下，质谱根据离子化的肽段母离子的强度，依次选择10到20个强度最大的离子进入串联质谱，进行进一步碎裂，然后经过与理论蛋白质数据库匹配进行肽段及蛋白的氨基酸序列鉴定。这种方法无疑丢失了大量有用的肽段母离子信息。由于质谱选择离子的随机性，造成鉴定的重复度较低，即同样的样品，同样的仪器，两次不同采集，其鉴定结果差别较大。又由于空间电荷效应的存在，大大限制了分析的动态范围，一些重要的低丰度蛋白得不到解析。

SWATH技术：Sequential Windowed Acquisition of all Theoreticalfragmentions，质谱数据采集模式的一种。SWATH采集模式是一种新型的质谱扫描技术，它将样品中所有离子化的肽段母离子的质量范围划分为若干个连续的扫描窗口，每个扫描窗口内所有的肽段母离子都会进入串联质谱进行进一步碎裂，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息。与传统的DDA技术相比，SWATH采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂，从而获得完整的肽段信息。因此，SWATH技术是一种真正全景式的、高通量的质谱技术。同时也解决了DDA重复性差的缺点。

DIA技术：Data-Independent Acquisition，与SWATH技术原理相同，仅基于不同的质谱平台而言。

MRM技术：质谱多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)技术，是一项经典的靶向蛋白质组检测技术，也是靶向蛋白组的金标准。是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。对于MRM技术而言关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子，然后只将选定的特异性母离子进行碎裂，最后去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。通过在样本中加入已知含量的同位素标记肽段作为内参，MRM技术还可用于目标蛋白的绝对定量。MRM适合多种质谱仪，如高分辨质谱仪Q-TOF，Orbitrap和低分辨质谱仪如三重四级杆质谱。MRM可替代Western blot技术，高通量地在大生物样本量中验证蛋白。

PRM技术：平行反应监测技术(parallel reaction monitoting，PRM)是MRM的衍生技术，也可在复杂生物样品中同时对多个目标蛋白进行相对或者绝对定量检测。PRM不需要预先根据目标蛋白设计母离子和子离子对，而是对子离子进行全扫描。PRM可替代Westernblot技术，高通量地在大生物样本量中验证蛋白。PRM和MRM可检测低至amol级别的蛋白信号。

IP：免疫沉淀(Immunoprecipitation)是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G(ProteinA/G)和二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。免疫沉淀的成功依赖于抗原的纯度以及制备抗体的难易，主要受两方面因素的影响：1、抗原原液的丰度，2、抗体对抗原的亲和力。

Western blot：蛋白质印迹法(免疫印迹试验)。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich MiescherInstitute)的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。最低可检测pg级别的蛋白信号。

丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase，PK)是调节糖酵解最后一步反应的关键酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和ADP反应生成丙酮酸和ATP。丙酮酸激酶包括由PKLR基因编码的红细胞/肝型丙酮酸激酶(PKLR)和PKM基因编码的肌肉型丙酮酸激酶(PKM)，其中PKLR激酶由PKL亚型和PKR亚型激酶组成；PKM激酶由PKM1和PKM2亚型激酶组成。PKM1激酶主要存在于骨骼肌、脑和心脏等需要高能量的人体组织中，以四聚体的形式发挥活性；而在肿瘤组织中，表达量较高的丙酮酸激酶主要是PKM2，其在果糖-1，6-二磷酸(FBP)的调控作用下以高活性的四聚体形式或者低活性的二聚体形式存在。研究表明PKM2的异常表达，可促进肿瘤细胞的生长。PKM2与p53的相互作用，导致基因组不稳定性，从而促进肿瘤生长。并且，在肿瘤发生和发展的各种应激过程中，都伴随PKM2的多种翻译后修饰的发生，如乙酰化、磷酸化、甲酰化、氧化和O-糖基化。因此，精准检测PKM2激酶的构象及翻译后修饰水平的变化，对研究肿瘤的发生和发展具有重要意义。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、

图1为SUMO修饰位点鉴定流程示意图。如图1所示，本实施例提供了一种检测蛋白类泛素化修饰位点的方法，其包含以下步骤：

(1)针对需要研究的目标蛋白，通过基因克隆技术构建目标基因融合表达质粒；

(2)将步骤(1)中构建的融合表达质粒转入外源基因表达系统中进行外源表达；

(3)利用亲和色谱法纯化步骤(2)中表达的融合蛋白；

(4)构建体外SUMO化修饰反应体系；

(5)对反应体系中的蛋白进行胰蛋白酶酶切；

(6)液相色谱质谱串联采集步骤(5)获得的多肽的质谱数据；

(7)质谱数据解析，得到修饰位点及核心肽段的序列；

(8)化学合成含有SUMO化修饰位点的同位素标记肽段序列，采用PRM方法进行位点确证，确定一套母-子离子对(transition)；

(9)用步骤(8)建立的母-子离子对(transition)对内源修饰位点进行检测。

所述SUMO化修饰是指SUMO1类泛素化修饰。

其中，步骤(5)所述胰蛋白酶与蛋白的反应比例推荐在1∶10-1∶100之间，视酶活性及反应时间而定。

步骤(6)质谱数据采集基于Eksigent NanoLC-Triple TOF 5600色谱质谱串联系统，采用数据非依赖(SWATH)采集模式，这种采集模式既可以避免数据依赖(DDA)采集模式的弊端即半随机性质的选取母离子而遗漏低丰度前体离子，又可以借助于质谱分析软件抽提离子色谱谱图(XIC)的功能，找到含有潜在SUMO化修饰肽段的隔离窗口。数据非依赖(SWATH)采集策略如下：先进行多肽的一级信号全扫描，根据一级扫描的质荷比范围，将二级扫描的窗口划分为若干个隔离窗口，依次进行二级信号扫描。用传统的质谱鉴定肽段的方法：即经胰蛋白酶酶解，数据依赖模式(DDA)采集质谱信号，并按SUMO1酶切后肽段分子量作为可变翻译后修饰，采用质谱分析软件直接进行分析无法找到SUMO化修饰肽段及其位点。

步骤(7)数据解析无需开发新软件，基于目前已有的质谱数据分析软件建立了一套低成本、易操作、适用广的数据解析方法，具体步骤如下：

(1)采用ChopNspice软件预测经步骤(5)酶切之后的SUMO1侧链的碎片离子，采用b系列离子作为诊断离子；

(2)采用Peakview软件在所有采集到的二级质谱图中提取诊断离子信号，根据诊断离子的XIC的峰形、强度和一致性，锁定潜在的SUMO化修饰肽段并确定对应二级质谱图的保留时间和扫描质量范围；

(3)在上述质量范围及保留时间内对一级质谱图进行解卷积处理，计算出潜在的肽段母离子精确分子量；

(4)采用GPMAW软件对目标蛋白的fasta序列进行理论酶切。设置参数为：胰蛋白酶酶切，允许一个漏切位点，过滤掉所有只含有1个K的肽段或者仅在C端出现一个K/R的肽段。获得的肽段采用ChopNspice软件模拟修饰，即将胰蛋白酶酶切后的SUMO1残基肽链(ELGMEEEDVIEVYQEQTGG)融合到上述肽段N端，并输出该融合肽段的分子量信息。与步骤(3)获得的所有前体离子分子量进行匹配，匹配成功的肽段即为可能的SUMO化修饰肽段；

(5)采用Peakview软件模拟步骤(4)获得的目标肽段的碎片离子并与诊断离子对应的二级谱图进行匹配，完美匹配上的肽段为含有类泛素化修饰位点的序列。

步骤(8)位点确证方法采用MRM质谱采集方法，基于nano-HPLC-Triple Quad5500plus(AR Sciex)检测系统完成。基于传统策略进行验证必须首先合成位点特异性抗体，特异性差、成本高是此类方法的弊端。而MRM方法则是一种最优的解决方案。具体步骤如下：

(1)化学合成稳定同位素标记肽段，肽段序列即为步骤(5)中匹配成功的氨基酸序列，包括修饰侧链及核心肽段序列，同位素标记采用C13和N15；

(2)将步骤(1)中合成的稳定同位素标记肽段，配置成一定浓度的工作液。首先Eksigent NanoLC-Triple TOF 5600色谱质谱串联系统采用PRM(平行反应监测，ParallelReaction Monitoring)质谱采集方法采集肽段的二级谱图，挑选其中信号强度最高的3-6个碎片离子建立母-子离子对(transitions)；

(3)将稳定同位素标记肽段掺入到待检测样本中，基于MRM质谱采集方法，采集步骤(2)中的transitions。利用Skyline软件进行数据分析，结合软件打分和人工确认提取目标transition的信号并确认其保留时间；

(4)利用步骤(3)中确认的transition及精确保留时间，即可建立一套类泛素化位点鉴定的检测方法。

根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，构建PKM2-His标签蛋白表达质粒

将编码PKM2蛋白的基因(所述的基因片段为SEQ ID NO.3所示，所编码的PKM2蛋白序列为SEQ ID NO.4所示)克隆进入带有His标签的pSUMO3质粒载体中，构建PKM2-his融合蛋白表达质粒。

外源诱导表达PKM2蛋白

将步骤1构建的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行外源表达。外源表达的条件为30℃，0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂。

纯化PKM2蛋白

采用亲和色谱法，利用Ni-NTA琼脂糖亲和介质(QIAGEN)将PKM2蛋白纯化出来。

构建体外反应体系

纯化得到的重组PKM2与SUMO E1(SUMO活化酶亚基1，SAE1/UBA2)、E2(SUMO接合酶9，UBC9)和SUMO1蛋白孵育，进行体外SUMO化反应。反应条件为25℃，反应3小时。反应结束后，加入2X SDS裂解缓冲液终止体外反应。

酶解

往步骤4中收集的蛋白溶液加入变性缓冲液，变性缓冲液成分为8M尿素，其中含0.1M Tris-HCl，pH 8.5。将所得蛋白溶液转移到YM-10超滤装置中，20℃条件下，14000g离心20分钟，重复该步骤3次。加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为10mM，室温(RT)下反应1小时，然后加入碘乙酰胺(IAA)至终浓度为55mM，在黑暗条件下烷基化1小时。加入50mM NH₄HCO₃，20℃，14 000g离心20分钟，重复该步骤三次。随后，加入测序级胰蛋白酶与蛋白的质量比为1∶50，37℃酶解过夜。20℃条件下，14000g，离心20分钟收集酶解好的肽段。加入1％三氟乙酸(TFA)进行酸化处理，用C18 Ziptips除盐，在含0.1％TFA的50～70％乙腈中洗脱。洗脱后的肽段用SpeedVac(ThermoSavant)冻干，用10μl上样缓冲液(1％甲酸，5％乙腈)复溶。

数据非依赖模式采集肽段质谱信息

复溶后的肽段经Triple TOF 5600plus质谱仪(ABsciex)进行数据鉴定。首先肽段经C18反相色谱柱(粒径3μm，内径75um，长15cm)以60min梯度进行分离。流速为300nl/min，采用线性梯度，B相(0.1％甲酸/乙腈80％)由5％升高至38％。质谱设置参数如下：curtaingas＝25，gas 1＝3，gas 2＝0，离子喷雾电压为2100V，采用CID碎裂模式。采用SWATH方法进行数据采集，一级扫描范围600-1250m/z，共设置26个固定窗口，每个隔离窗口设为25m/z。

质谱数据解析

利用胰酶酶切后的SUMO1残基侧链(即SEQ ID NO.1所示的ELGMEEEDVIEVYQEQTGG序列)理论上可以产生的b离子系列作为SUMO1修饰化支链肽段的诊断离子(具体参考图2，图2为SUMO化修饰侧链诊断离子。)，对质谱采集到的所有二级谱图进行诊断离子信号提取，在SUMO1诊断离子的XIC抽提谱图中发现了有多个成簇的离子峰，根据由多个诊断离子形成的峰形、强度和一致性，提示保留时间31.04分钟的这个时间窗口可能有SUMO1化修饰肽段(具体参考图3，图3为SUMO诊断离子的XIC提取谱图)。采用GPMAW软件对PKM2蛋白的fasta序列进行理论胰蛋白酶酶切，允许一个漏切，共得到61个符合条件的肽段，过滤掉所有只含有1个K的肽段或者仅在C端出现一个K/R的肽段，最终得到34条潜在肽段。同时借助于chopNspice软件，将胰酶酶切后的SUMO1残基肽链(即SEQ ID NO.1所示的ELGMEEEDVIEVYQEQTGG)融合到可能的胰酶酶切的底物肽段N端，并输出该融合直链的分子量信息(具体参考图4，图4为ChopNspice软件预测的修饰肽段的分子量与在保留时间31.04min的带4个电荷，分子量为883.44的峰完美匹配)，通过人工匹配由chopNspice输出的分子量和所有在保留时间31.04的母离子分子量，我们发现在874-900的扫描窗口有带4个电荷，分子量为883.44的峰，正好和可能的SUMO1修饰肽段“(ELGMEEEDVIEVYQEQTGG)IISKIENHEGVR”的分子量吻合，最后模拟的直链SUMO1修饰肽段的理论碎片离子分子量完美的匹配了883.44的二级谱图中的实际子离子分子量(具体参考图5，图5为SUMO化修饰肽段(ELGMEEEDVIEVYQEQTGG)IISKIENHEGVR的预测二级质谱图与带4个电荷，分子量为883.44的二级谱图完美匹配)，最终确定了PKM2-K270位是SUMO1修饰的位点。

根据上述步骤中得到的肽段序列，通过化学合成方法获得含同位素标记的标准肽段，其氨基酸序列为：EL(C13N15)GMEEEDVIEVYQEQTGG(IIS)KIENHEGV(C13N15)R(即SEQ IDNO.2)。将标准品配置成一定浓度的工作液。首先Eksigent NanoLC-Triple TOF 5600色谱质谱串联系统采用PRM(平行反应监测，Parallel Reaction Monitoring)质谱采集方法采集肽段的二级谱图，在采集到的二级谱图中挑选信号最强的4个碎片离子构成目标Transition依次为：y’2-757.92(+2)、y’3-808.44(+2)、y’5-936.99(+2)和b4-862.42(+3)，由此得到4个内源性肽段的目标transition依次为：y’2-754.92(+2)、y’3-805.44(+2)、y’5-933.99(+2)和b4-860.08(+3)。

基于步骤8中创建的transition，通过MRM质谱采集方法，对多种白血病细胞系(具体参考图6，图6为多反应监测质谱(MRM)分析白血病细胞系中的sumo化PKM2)及AML患者(具体参考图7，图7为多反应监测质谱(MRM)分析来自AML患者的原发性骨髓单个核细胞(BMMC)样本中的sumo化PKM2。)中PKM2的K270位点的类泛素化水平进行定性和定量分析。实验基于nano-HPLC-Triple Quad 5500plus(AB Sciex)检测系统完成。具体步骤如下：

蛋白提取：在收集到的细胞沉淀中加入300μl SDS裂解液，冰上裂解30min；

酶解、除盐同步骤5；

MRM验证

色谱参数如下：肽段经nano-HPLC-Triple Quad 5500plus(AB Sciex)检测系统(ABsciex)进行鉴定。首先肽段经C18反相色谱柱(粒径3μm，内径75um，长15cm)以60min梯度进行分离，流速为300nl/min。A相为含0.1FA的水溶液，B相为浓度0.1％的甲酸乙腈溶液，乙腈浓度为95％。色谱梯度如下：0min-5min，B相线性梯度从5％-20％；6min-45min，B相线性梯度从20％到50％；46min-47min B相线性梯度从50-85％并维持到50min，51min-60min维持5％B进行平衡10min。

质谱设置参数如下：curtain gas＝25，gas 1＝3，gas 2＝0，离子喷雾电压为2100，采用CID碎裂模式。采用MRM方法进行数据采集，transition列表即为步骤8中得到的4对，离子驻留时间设置为100ms，保留时间根据标准品获取。

原始数据经Skyline进行定量分析，峰提取结果同时进行人工确认。如图6和7所示，证实多种白血病细胞系及AML患者的原发性骨髓单个核细胞(BMMC)样本中有PKM2蛋白的SUMO1翻译后修饰，且PKM2蛋白270位赖氨酸残基为SUMO1化修饰位点。

需要说明的是，本发明的保护范围中现有技术部分并不局限于本申请文件所给出的实施例，所有不与本发明的方案相矛盾的现有技术，包括但不局限于在先专利文献、在先公开出版物，在先公开使用等等，都可纳入本发明的保护范围。

此外，本案中各技术特征的组合方式并不限本案权利要求中所记载的组合方式或是具体实施例所记载的组合方式，本案记载的所有技术特征可以以任何方式进行自由组合或结合，除非相互之间产生矛盾。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学医学院

<120> 基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法及应用

<141> 2021-06-16

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Glu Leu Gly Met Glu Glu Glu Asp Val Ile Glu Val Tyr Gln Glu Gln

1 5 10 15

Thr Gly Gly

<210> 2

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Glu Leu Cys Asn Gly Met Glu Glu Glu Asp Val Ile Glu Val Tyr Gln

1 5 10 15

Glu Gln Thr Gly Gly Ile Ile Ser Lys Ile Glu Asn His Glu Gly Val

20 25 30

Cys Asn Arg

35

<210> 3

<211> 1596

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgtcgaagc cccatagtga agccgggact gccttcattc agacccagca gctgcacgca 60

gccatggctg acacattcct ggagcacatg tgccgcctgg acattgattc accacccatc 120

acagcccgga acactggcat catctgtacc attggcccag cttcccgatc agtggagacg 180

ttgaaggaga tgattaagtc tggaatgaat gtggctcgtc tgaacttctc tcatggaact 240

catgagtacc atgcggagac catcaagaat gtgcgcacag ccacggaaag ctttgcttct 300

gaccccatcc tctaccggcc cgttgctgtg gctctagaca ctaaaggacc tgagatccga 360

actgggctca tcaagggcag cggcactgca gaggtggagc tgaagaaggg agccactctc 420

aaaatcacgc tggataacgc ctacatggaa aagtgtgacg agaacatcct gtggctggac 480

tacaagaaca tctgcaaggt ggtggaagtg ggcagcaaga tctacgtgga tgatgggctt 540

atttctctcc aggtgaagca gaaaggtgcc gacttcctgg tgacggaggt ggaaaatggt 600

ggctccttgg gcagcaagaa gggtgtgaac cttcctgggg ctgctgtgga cttgcctgct 660

gtgtcggaga aggacatcca ggatctgaag tttggggtcg agcaggatgt tgatatggtg 720

tttgcgtcat tcatccgcaa ggcatctgat gtccatgaag ttaggaaggt cctgggagag 780

aagggaaaga acatcaagat tatcagcaaa atcgagaatc atgagggggt tcggaggttt 840

gatgaaatcc tggaggccag tgatgggatc atggtggctc gtggtgatct aggcattgag 900

attcctgcag agaaggtctt ccttgctcag aagatgatga ttggacggtg caaccgagct 960

gggaagcctg tcatctgtgc tactcagatg ctggagagca tgatcaagaa gccccgcccc 1020

actcgggctg aaggcagtga tgtggccaat gcagtcctgg atggagccga ctgcatcatg 1080

ctgtctggag aaacagccaa aggggactat cctctggagg ctgtgcgcat gcagcacctg 1140

attgcccgtg aggcagaggc tgccatctac cacttgcaat tatttgagga actccgccgc 1200

ctggcgccca ttaccagcga ccccacagaa gccaccgccg tgggtgccgt ggaggcctcc 1260

ttcaagtgct gcagtggggc cataatcgtc ctcaccaagt ctggcaggtc tgctcaccag 1320

gtggccagat accgcccacg tgcccccatc attgctgtga cccggaatcc ccagacagct 1380

cgtcaggccc acctgtaccg tggcatcttc cctgtgctgt gcaaggaccc agtccaggag 1440

gcctgggctg aggacgtgga cctccgggtg aactttgcca tgaatgttgg caaggcccga 1500

ggcttcttca agaagggaga tgtggtcatt gtgctgaccg gatggcgccc tggctccggc 1560

ttcaccaaca ccatgcgtgt tgttcctgtg ccgtga 1596

<210> 4

<211> 531

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Ser Lys Pro His Ser Glu Ala Gly Thr Ala Phe Ile Gln Thr Gln

1 5 10 15

Gln Leu His Ala Ala Met Ala Asp Thr Phe Leu Glu His Met Cys Arg

20 25 30

Leu Asp Ile Asp Ser Pro Pro Ile Thr Ala Arg Asn Thr Gly Ile Ile

35 40 45

Cys Thr Ile Gly Pro Ala Ser Arg Ser Val Glu Thr Leu Lys Glu Met

50 55 60

Ile Lys Ser Gly Met Asn Val Ala Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Thr

65 70 75 80

His Glu Tyr His Ala Glu Thr Ile Lys Asn Val Arg Thr Ala Thr Glu

85 90 95

Ser Phe Ala Ser Asp Pro Ile Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val Ala Leu

100 105 110

Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Gly Leu Ile Lys Gly Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Glu Val Glu Leu Lys Lys Gly Ala Thr Leu Lys Ile Thr Leu

130 135 140

Asp Asn Ala Tyr Met Glu Lys Cys Asp Glu Asn Ile Leu Trp Leu Asp

145 150 155 160

Tyr Lys Asn Ile Cys Lys Val Val Glu Val Gly Ser Lys Ile Tyr Val

165 170 175

Asp Asp Gly Leu Ile Ser Leu Gln Val Lys Gln Lys Gly Ala Asp Phe

180 185 190

Leu Val Thr Glu Val Glu Asn Gly Gly Ser Leu Gly Ser Lys Lys Gly

195 200 205

Val Asn Leu Pro Gly Ala Ala Val Asp Leu Pro Ala Val Ser Glu Lys

210 215 220

Asp Ile Gln Asp Leu Lys Phe Gly Val Glu Gln Asp Val Asp Met Val

225 230 235 240

Phe Ala Ser Phe Ile Arg Lys Ala Ser Asp Val His Glu Val Arg Lys

245 250 255

Val Leu Gly Glu Lys Gly Lys Asn Ile Lys Ile Ile Ser Lys Ile Glu

260 265 270

Asn His Glu Gly Val Arg Arg Phe Asp Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asp

275 280 285

Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Ile Glu Ile Pro Ala Glu

290 295 300

Lys Val Phe Leu Ala Gln Lys Met Met Ile Gly Arg Cys Asn Arg Ala

305 310 315 320

Gly Lys Pro Val Ile Cys Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Lys

325 330 335

Lys Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Gly Ser Asp Val Ala Asn Ala Val

340 345 350

Leu Asp Gly Ala Asp Cys Ile Met Leu Ser Gly Glu Thr Ala Lys Gly

355 360 365

Asp Tyr Pro Leu Glu Ala Val Arg Met Gln His Leu Ile Ala Arg Glu

370 375 380

Ala Glu Ala Ala Ile Tyr His Leu Gln Leu Phe Glu Glu Leu Arg Arg

385 390 395 400

Leu Ala Pro Ile Thr Ser Asp Pro Thr Glu Ala Thr Ala Val Gly Ala

405 410 415

Val Glu Ala Ser Phe Lys Cys Cys Ser Gly Ala Ile Ile Val Leu Thr

420 425 430

Lys Ser Gly Arg Ser Ala His Gln Val Ala Arg Tyr Arg Pro Arg Ala

435 440 445

Pro Ile Ile Ala Val Thr Arg Asn Pro Gln Thr Ala Arg Gln Ala His

450 455 460

Leu Tyr Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Cys Lys Asp Pro Val Gln Glu

465 470 475 480

Ala Trp Ala Glu Asp Val Asp Leu Arg Val Asn Phe Ala Met Asn Val

485 490 495

Gly Lys Ala Arg Gly Phe Phe Lys Lys Gly Asp Val Val Ile Val Leu

500 505 510

Thr Gly Trp Arg Pro Gly Ser Gly Phe Thr Asn Thr Met Arg Val Val

515 520 525

Pro Val Pro

530

Claims (10)

1.一种基于高精度质谱的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，所述蛋白类泛素化修饰位点检测方法包括以下步骤：

步骤S1：构建获得体外SUMO化修饰反应体系，以获得目标蛋白；

步骤S2：对步骤S1所获得的目标蛋白进行胰蛋白酶酶切，获得酶切后的多肽肽段，其中，胰蛋白酶的加入质量与目标蛋白的反应比例为1∶10～1∶100；

步骤S3：将步骤S2获得的多肽通过液相色谱质谱联用分析采集得到多肽质谱数据，经数据解析，得到修饰位点以及核心肽段的序列；

步骤S4：化学合成含有SUMO化修饰位点的同位素标记肽段序列，采用PRM方法进行位点确证，确定一套母-子离子对；

步骤S5：用步骤S4建立的母-子离子对对内源修饰位点进行检测；

所述SUMO化修饰是指SUMO1类泛素化修饰。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤S1中，具体包括如下步骤：

步骤S11：根据需要的目标蛋白，通过基因克隆技术获得目标蛋白的目标基因，并将目标基因克隆进入表达载体从而构建融合表达质粒；

步骤S12：将步骤S10构建获得的融合表达质粒，转入外源基因表达系统中进行外源表达，得到融合蛋白；

步骤S13：纯化所述融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在所述步骤S30的纯化为亲和色谱柱纯化。

4.根据权利要求1所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述液相色谱质谱联用分析采用基于Eksigent NanoLC-Triple TOF 5600色谱质谱串联系统，采用数据非依赖采集模式。

5.根据权利要求1所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在所述步骤S4中，具体包括如下步骤：

步骤S31：采用ChopNspice软件预测经酶切之后的SUMO1侧链的碎片离子，采用b系列离子作为诊断离子；

步骤S32：采用Peakview软件在所有采集到的二级质谱图中提取诊断离子信号，根据诊断离子的XIC的峰形、强度和一致性，锁定潜在的SUMO化修饰肽段并确定对应二级质谱图的保留时间和扫描质量范围；

步骤S33：在上述扫描质量范围及保留时间内对一级质谱图进行解卷积处理，计算出潜在的肽段母离子精确分子量；

步骤S34：采用GPMAW软件对目标蛋白的fasta序列进行理论酶切，并采用ChopNspice软件模拟修饰，随后匹配成功的多肽肽段为目标肽段

步骤S35：将目标肽段通过Peakview软件模拟目标肽段的碎片离子并与诊断离子对应的二级谱图进行匹配，完美匹配上的肽段为含有类泛素化修饰位点的序列，得到修饰位点以及核心肽段。

6.根据权利要求1所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在步骤S2中，进行胰蛋白酶酶切时，允许一个漏切位点，过滤掉所有只含有1个K的肽段或者仅在C端出现一个K/R的肽段，酶切后获得的多肽肽段采用ChopNspice软件模拟修饰，即将胰蛋白酶酶切后的SUMO1残基肽链，序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求1所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，在所述步骤S3中，位点确证方法采用MRM质谱采集方法基于nano-HPLC-Triple Quad 5500plus检测系统完成；所述nano-HPLC-Triple Quad 5500plus测系统采用AB Sciex。

8.根据权利要求7所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法，其特征在于，所述MRM质谱采集方法具体步骤如下：

步骤S41：化学合成稳定同位素标记肽段，肽段序列即为中匹配成功的氨基酸序列，包括修饰侧链及核心肽段序列，同位素标记采用C13和N15；

步骤S42：将步骤S41获得的稳定同位素标记肽段作为标准，配置成一定浓度的工作液，经Eksigent NanoLC-Triple TOF 5600色谱质谱串联系统采用PRM质谱采集方法采集肽段的二级谱图，挑选其中信号强度最高的3-6个碎片离子建立母-子离子对；

步骤S43：：将标准品掺入到待检测样本中，基于MRM质谱采集方法，采集步骤S42中的母-子离子对，利用Skyline软件进行数据分析，结合软件打分和人工确认提取目标母-子离子对的信号并确认其保留时间；

步骤S44：利用步骤S43中确认的母-子离子对及精确保留时间，即可建立一套类泛素化位点鉴定的检测方法。

9.一种蛋白质类泛素化修饰的分析试剂盒，其特征在于，所述分析试剂盒包括：

待测蛋白质表达质粒、蛋白质纯化试剂、蛋白酶以及标准品；

所述分析试剂盒进行分析时采用如权利要求1-8中任意一项所述的蛋白类泛素化修饰位点检测方法进行检测。

10.一种如权利要求9所述的分析试剂盒在肿瘤相关检测产品中的应用。

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