CN112098579B - 一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法 - Google Patents

一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112098579B
CN112098579B CN202010906437.7A CN202010906437A CN112098579B CN 112098579 B CN112098579 B CN 112098579B CN 202010906437 A CN202010906437 A CN 202010906437A CN 112098579 B CN112098579 B CN 112098579B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
gly
glue
ala
deer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010906437.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112098579A (zh
Inventor
蔡朔
刘睿
蒋梦彤
赵珂璇
段金廒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University of Chinese Medicine
Original Assignee
Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University of Chinese Medicine filed Critical Nanjing University of Chinese Medicine
Priority to CN202010906437.7A priority Critical patent/CN112098579B/zh
Priority to US18/040,497 priority patent/US20230266339A1/en
Priority to PCT/CN2020/131797 priority patent/WO2022048048A1/zh
Publication of CN112098579A publication Critical patent/CN112098579A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112098579B publication Critical patent/CN112098579B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/944—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha-1, 6-glucosidic bonds, e.g. isoamylase, pullulanase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鹿源特征肽段及其检测方法，本发明通过大量是实验筛选，研究确定2条鹿源肽段相对含量的比值，并以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽2数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽2呈线性，建立标准曲线方程为y=4.7903x+0.4106，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。从而可以克服现有技术中，鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，专属性肽段也难以区分的不足。对保证含有鹿皮胶或鹿角胶的药品、保健食品、健康食品等的质量具有重要意义。

Description

一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，具体涉及区分鹿皮胶与鹿角胶，以及鹿角胶中掺有鹿皮胶的样品、掺入鹿皮胶的比例的特征肽段和检测方法。
技术背景
胶类药材包括阿胶、鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶等，80％以上的成分为不同类别的胶原蛋白，包括I型胶原α1链(COL1A1)、I型胶原α2链(COL1A2)、II型胶原α1链(COL2A1)、III型胶原α1链(COL3A1)等，其中以COL1A2来源的肽段为主。COL1A2作为高保守蛋白质，广泛存在于不同动物种体内，是构成胶类药材的重要蛋白类成分之一。
鹿角胶与鹿皮胶均来源于梅花鹿或马鹿，两者为名贵胶类中药材，鹿角胶为梅花鹿或马鹿角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，鹿皮胶为梅花鹿或马鹿的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。鹿角为马鹿或梅花鹿已骨化的角，价格远高于鹿皮，市场上存在以鹿皮胶掺入鹿角胶以次充好的现象。如何将鹿皮胶与鹿角胶进行区分，着实是胶类药材鉴定研究的难题，给鹿角胶与鹿皮胶鉴别，以及鹿角胶掺入鹿皮胶的伪品鉴别都带来了挑战。
鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，且两者均来源于梅花鹿或马鹿，其蛋白质组成相同，因此，通过寻找专属性肽段来区分两者基本不可能。
发明内容：
发明目的：本发明通过大量实验筛选，研究确定2条鹿源肽段相对含量的比值，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段，所述的特征肽为：
肽1：
Gly-Asn-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys；
肽2：
Gly-Asn-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，包括以下步骤：
(1)将上述的2个区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段配成混合对照品溶液；
(2)将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段混合对照品溶液注入液质联用仪，以区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式进行检测，选择的离子对包括：肽1：m/z 850.4(三电荷)→515.4、肽2：m/z 845.0(三电荷)→507.3；以肽1峰面积A肽1与肽2峰面积A肽2的比值确定样品为鹿皮胶或是鹿角胶。
作为优选方案，以上所述的区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，所述的酶切方法包括以下步骤：取待检测胶类药材样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。加入胰蛋白酶的量w/v为0.1％～10％。所述的酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。
作为优选方案，以上所述的区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1mm×100mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：m/z 850.4(三电荷)→515.4、m/z 845.0(三电荷)→507.3。
作为优选方案，以上所述的区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，鹿角胶的A肽1/A肽2不得低于5.5，鹿皮胶的A肽1/A肽2不得高于1.2。
本发明提供的鹿皮胶与鹿角胶所含比例的检测方法，其包括以下步骤：
(1)线性关系的建立
将鹿角胶与鹿皮胶按0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100％的比例混合，将每批次混胶样品各取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入质量浓度1％胰蛋白酶，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用；
将不同比例混胶样品酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱，规格2.1mm×100mm，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；
设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 850.4(三电荷)→515.4，DP＝162.49,CE＝32.87；
肽2：m/z 845.0(三电荷)→507.3，DP＝162.52,CE＝31.51；
以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽2数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽2呈线性，建立标准曲线方程为y＝4.7903x+0.4106，R2＝0.9669；鹿角胶掺入比例与肽1、肽2峰面积呈线性相关，可根据标准曲线方程计算出A肽1与A肽2的比值，确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。
有益效果：本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明通过大量实验筛选，研究确定2条鹿源肽段相对含量的比值，并建立的线性方程，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。从而可以克服现有技术中，鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，专属性肽段也难以区分的不足，取得了非常好的技术进步。
附图说明
图1为鹿角胶在混合胶中占比与A肽1/A肽2数值关系图；
图2为肽1的质谱图；
图3为肽2的质谱图。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段，所述的特征肽序列有2个，如序列表1：
肽1：
Gly-Asn-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys；
肽2：
Gly-Asn-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
实施例2鹿皮胶肽1与肽2比例关系
取10个批次市售鹿皮胶样品，每批次各取约10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿皮胶药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
将各批次的鹿皮胶酶解液注入液质联用仪进行检测，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1mm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。如图2和图3所示质谱图。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 850.4(三电荷)→515.4，DP＝162.49,CE＝32.87；
肽2：m/z 845.0(三电荷)→507.3，DP＝162.52,CE＝31.51。
10个批次鹿皮胶A肽1/A肽2数值见表1，A肽1/A肽2平均值为0.612±0.282。
表1鹿皮胶A肽1/A肽2结果
Figure GDA0003290160160000041
实施例3鹿角胶肽1与肽2比例关系
取10个批次鹿角样品，按照2020版《中国药典》制备鹿角胶方法，获得鹿角胶样品，每批次各取约10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，超声酶解10min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿角胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将各批次的鹿角胶酶解液注入液质联用仪进行检测，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1mm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。如图2和图3所示质谱图。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 850.4(三电荷)→515.4，DP＝162.49,CE＝32.87；
肽2：m/z 845.0(三电荷)→507.3，DP＝162.52,CE＝31.51。
10个批次鹿角胶A肽1/A肽2数值见表2，A肽1/A肽2平均值为7.428±1.617。
表2鹿角胶A肽1/A肽2结果
Figure GDA0003290160160000051
实施例4不同比例鹿皮胶与鹿角胶混合样品中肽1与肽2比例关系
将鹿角胶与鹿皮胶按0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的比例混合，每批次混胶样品各取约10mg，分别加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用。
将不同比例混胶样品酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1mm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。如图2和图3所示质谱图。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 850.4(三电荷)→515.4，DP＝162.49,CE＝32.87；
肽2：m/z 845.0(三电荷)→507.3，DP＝162.52,CE＝31.51。
不同比例混胶样品的A肽1/A肽2数值见表3，鹿角胶在混合胶中占比与A肽1/A肽2数值关系如图1所示。以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽2数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽2呈线性，y＝4.7903x+0.4106，R2＝0.9669。表明鹿角胶掺入比例与肽1、肽2峰面积相关，因此可根据A肽1与A肽2的比值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。
表3鹿角胶/鹿皮胶混合样品掺入比例与峰面积关系
Figure GDA0003290160160000061
序列表
<110> 南京中医药大学
<120> 一种鹿源特征肽段及其检测方法
<141> 2020-09-01
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Thr Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Pro Xaa Gly Phe Xaa Gly Ala Val Gly Ala Lys
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Thr Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Pro Xaa Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys
20 25 30

Claims (5)

1.一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将肽1和肽2特征肽段配成混合对照品溶液；
（2）将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤（1）肽1和肽2特征肽段混合对照品溶液注入液质联用仪，以肽1和肽2特征肽段对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式进行检测，选择的离子对包括：肽1：m/z 850.4三电荷→515.4、肽2：m/z 845.0三电荷→507.3；以肽1峰面积A肽1与肽2峰面积A肽2的比值确定样品为鹿皮胶或是鹿角胶；鹿角胶的 A肽1/A肽2不低于5.5，鹿皮胶的 A肽1/A肽2不高于1.2；
所述的肽1为：
Gly-Asn-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys；
所述的肽2为：
Gly-Asn-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys；
所述的液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1mm ×100 mm，上样量为2μl，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸，流速0.3ml/min，0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱。
2.根据权利要求1所述的区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，所述的酶切包括以下步骤：取待检测胶类药材样品10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mMPBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10% TFA溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
3.根据权利要求2所述的区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，加入胰蛋白酶的量w/v为0.1%~10%。
4.根据权利要求2所述的区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解和酶固定化酶解。
5.一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）线性关系的建立
将鹿角胶与鹿皮胶按0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100%的比例混合，将每批次混胶样品各取10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000 rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入质量浓度1%胰蛋白酶，摇匀，微波酶解30 min，酶解后加入10% TFA溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用；
将不同比例混胶样品酶解液注入液质联用仪，进样量为1 μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱，规格2.1 mm × 100 mm，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸，0~3.5 min，10~30%A线性梯度洗脱，3.5~4 min，30~10%A线性梯度洗脱，4~6 min，10%A洗脱；
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；
设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 850.4三电荷→515.4，DP=162.49, CE=32.87；
肽2：m/z 845.0三电荷→507.3，DP=162.52, CE=31.51；
以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽2数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽2呈线性，建立标准曲线方程为y = 4.7903x + 0.4106，R² = 0.9669；鹿角胶掺入比例与肽1、肽2峰面积呈线性相关，根据标准曲线方程计算出A肽1与A肽2的比值，确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例；鹿角胶的 A肽1/A肽2不低于5.5，鹿皮胶的 A肽1/A肽2不高于1.2；
所述的肽1为：
Gly-Asn-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys；
所述的肽2为：
Gly-Asn-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
CN202010906437.7A 2020-09-01 2020-09-01 一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法 Active CN112098579B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010906437.7A CN112098579B (zh) 2020-09-01 2020-09-01 一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法
US18/040,497 US20230266339A1 (en) 2020-09-01 2020-11-26 Deer-derived specific peptide and detection method therefor
PCT/CN2020/131797 WO2022048048A1 (zh) 2020-09-01 2020-11-26 一种鹿源特征肽段及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010906437.7A CN112098579B (zh) 2020-09-01 2020-09-01 一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112098579A CN112098579A (zh) 2020-12-18
CN112098579B true CN112098579B (zh) 2021-11-23

Family

ID=73756943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010906437.7A Active CN112098579B (zh) 2020-09-01 2020-09-01 一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230266339A1 (zh)
CN (1) CN112098579B (zh)
WO (1) WO2022048048A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112898400B (zh) * 2021-01-23 2022-08-23 南京中医药大学 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
CN112898384B (zh) * 2021-01-23 2022-08-26 南京中医药大学 一种鹿角特征肽段及其检测方法
CN113173971B (zh) * 2021-04-20 2022-08-23 江阴天江药业有限公司 用于鉴别含有鹿角或鹿皮的配方颗粒的特征肽段及其检测方法
CN113173972B (zh) * 2021-04-20 2022-08-26 江阴天江药业有限公司 用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法
CN114539360B (zh) * 2022-03-24 2023-04-28 山东省食品药品检验研究院 一种驼鹿源特征多肽及其应用
CN114591399B (zh) * 2022-03-25 2023-05-09 山东省食品药品检验研究院 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用
CN114778736B (zh) * 2022-04-24 2024-05-14 山东省食品药品检验研究院 一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法及其应用
CN115248277B (zh) * 2022-06-27 2024-01-09 山东省食品药品检验研究院 刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法
CN116046923B (zh) * 2022-11-07 2023-09-01 中国计量科学研究院 一种血清中降钙素原的定值方法
CN115792243A (zh) * 2022-11-25 2023-03-14 北京同仁堂(辽宁)科技药业有限公司 一种利用专属离子对检测鹿胶的方法及应用
CN116106554B (zh) * 2022-11-30 2023-08-01 山东省食品药品检验研究院 一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法
CN117147881B (zh) * 2023-10-30 2024-01-02 山东省食品药品检验研究院 一种狍鹿角特征肽段及检测狍鹿角的方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101693737A (zh) * 2009-10-26 2010-04-14 南京中医药大学 一类具有抗氧化活性的角类多肽、其分离方法及用途
CN105273061A (zh) * 2015-10-09 2016-01-27 东阿阿胶股份有限公司 一种动物胶中的共有多肽及其在检测中的应用
CN106841497A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 东阿阿胶股份有限公司 用于检测龟甲胶、鹿角胶、阿胶及其伪品胶中驴皮源成分含量的组合物、试剂盒及检测方法
CN109187835A (zh) * 2018-09-17 2019-01-11 南京中医药大学 一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法
CN111239302A (zh) * 2020-03-04 2020-06-05 南京中医药大学 一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1651275A1 (en) * 2003-08-05 2006-05-03 Fuji Photo Film B.V. Use of recombinant or synthetic gelatin-like proteins as stabiliser in lyophilized pharmaceutical compositions
CN113004374B (zh) * 2018-09-03 2023-01-31 贵州广济堂健康药业有限公司 鹿胶特征肽及鉴定待测样品中是否包含鹿胶的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101693737A (zh) * 2009-10-26 2010-04-14 南京中医药大学 一类具有抗氧化活性的角类多肽、其分离方法及用途
CN105273061A (zh) * 2015-10-09 2016-01-27 东阿阿胶股份有限公司 一种动物胶中的共有多肽及其在检测中的应用
CN106841497A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 东阿阿胶股份有限公司 用于检测龟甲胶、鹿角胶、阿胶及其伪品胶中驴皮源成分含量的组合物、试剂盒及检测方法
CN109187835A (zh) * 2018-09-17 2019-01-11 南京中医药大学 一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法
CN111239302A (zh) * 2020-03-04 2020-06-05 南京中医药大学 一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于"多肽组-修饰组"比较分析鹿皮与鹿皮胶物质基础;刘睿等;《药学学报》;20200812;第55卷(第8期);摘要，第3节 *
基于nano LC-MS/MS法的黄明胶胶原蛋白鉴定研究;张涛等;《南京中医药大学学报》;20200131;第36卷(第1期);第3.3节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112098579A (zh) 2020-12-18
US20230266339A1 (en) 2023-08-24
WO2022048048A1 (zh) 2022-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112098579B (zh) 一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法
CN112098578B (zh) 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
CN112898384B (zh) 一种鹿角特征肽段及其检测方法
CN108456243B (zh) 玉米抗氧化活性肽及其制备方法
CN112098577B (zh) 一种胶类药材的检测方法
Zheng et al. Mechanistic study of CBT-Cys click reaction and its application for identifying bioactive N-terminal cysteine peptides in amniotic fluid
CN112898400B (zh) 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
Esposito et al. Synthesis and characterization of the N‐terminal acetylated 17‐23 fragment of thymosin beta 4 identified in TB‐500, a product suspected to possess doping potential
CN108948176B (zh) 一种骨桥蛋白特征肽及其应用
EP0529604B1 (en) Method of analysing a protein or a peptide
CN113173971B (zh) 用于鉴别含有鹿角或鹿皮的配方颗粒的特征肽段及其检测方法
CN113173972B (zh) 用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法
CN113896770B (zh) 一种鳖甲特征肽段及其检测方法
CN110845575A (zh) 一种多肽及其应用和dpp-ⅳ抑制剂或降血糖药物
Surewicz et al. The conformation of dynorphin A-(1–13) in aqueous solution as studied by fourier transform infrared spectroscopy
Redelius et al. Chemical studies of tissue polypeptide antigen (TPA). II. Partial amino acid sequences of cyanogen bromide fragments of TPA subunit B1
CN115572322A (zh) 一种麋鹿角特征肽段及其检测方法
Yang et al. Protein conformational changes determined by matrix-assisted laser desorption mass spectrometry
Fernlund Synthesis of the red-pigment-concentrating hormone of the shrimp, Pandalus borealis
CN110759971B (zh) 一种源于鹿茸的抗氧化多肽及应用和添加剂
CN114002280A (zh) 一种多巴胺敏化钛酸镁己烯雌酚抗污染型光电化学传感器的制备方法
Pecavar et al. Quantitative evaluation of amino acids using microwave accelerated hydrolysis
Witkowska et al. Intact noncovalent dimer of estrogen receptor ligand-binding domain can be detected by electrospray ionization mass spectrometry
CN116106554B (zh) 一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法
Stefanik et al. Quantitative analysis of therapeutic peptides by CZE using multiple sample injection in hydrodynamically closed separation system

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant