CN112098577B - 一种胶类药材的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胶类药材的检测方法，本发明采用胰蛋白酶酶切胶类药材，使专属性多肽从胶原蛋白中释放，而后采用液相色谱‑三重四极杆质谱仪检测，如果检测出与专属性多肽保留时间、母离子‑子离子一致，则判定所述胶类药材样品的物种来源与专属性多肽对应的物种一致；并根据专属性多肽的峰面积比值，可判断掺杂样品的掺伪比例。该方法具有专属性强、灵敏度高、操作简单等优点，可用于胶类药材的鉴别与质量控制。

Description

一种胶类药材的检测方法
技术领域
本发明涉及一种胶类药材的检测方法，具体涉及胶类药材的真伪、掺假样品检测及掺假比例。
背景技术
胶类药材包括阿胶、鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶等，80％以上的成分为不同类别的胶原蛋白，包括I型胶原α1链(COL1A1)、I型胶原α2链(COL1A2)、II型胶原α1链(COL2A1)、III型胶原α1链(COL3A1)等，其中以COL1A2来源的肽段为主。COL1A2作为高保守蛋白质，广泛存在于不同动物种体内，是构成胶类药材的重要蛋白类成分之一。
在现有市场上存在假阿胶、假鹿皮胶等胶类药材伪品，并以次充好向市场销售，严重影响了广大人民群众的饮食和用药安全。目前不法企业常以马皮、牛皮、猪皮等掺杂制备阿胶、鹿皮胶、鹿角胶等来以次充好，导致名贵胶类药材的造假事件屡禁不止的原因之一，缺少简单、可行、准确的鉴定技术支持，动物皮经过熬制后，很难鉴别出动物皮的来源。因此，寻找专属性、准确高的方法来快速准确鉴定胶类药材及其制品真伪意义重大。
现代研究表明，通过对胶类药材中胶原蛋白酶切后获得专属性肽段，以专属性肽段来鉴别胶类药材的真伪，如以驴源专属肽段鉴定阿胶的真伪，以鹿源专属肽段鉴定鹿皮胶的真伪等。本发明通过串联质谱方法检测专属离子对，可准确区分鹿皮胶、阿胶、牛皮胶、马皮胶、猪皮胶。该方法为胶类药材质量研究提供了参考与依据，有利于胶类药材及其制品质量标准进一步完善。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种检测胶类专属成分的方法，可快速准确判断鹿皮胶、阿胶、牛皮胶、马皮胶、猪皮胶的真伪及掺杂情况，所述方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于胶类药材的鉴别与质量控制。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提出一种检测胶类药材的方法，其特征在于：将待检测的胶类药材样品用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液注入液质联用仪，以待检测的胶类药材酶解液为基质，分别加入不同物种的专属性多肽对照品，采用ESI正离子模式，多反应监测(MRM)模式，对专属性多肽的母离子与子离子进行检测，如果检测出与专属性多肽对照品保留时间、母离子-子离子一致，则判定所述胶类样品的物种来源于专属性多肽的对应物质一致。
本发明所述胶类药材包括鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶、阿胶、马皮胶、猪皮胶，以及以这些胶类药材生产制备的含胶类的食品、保健品等。
本发明所述的酶切方法如下进行：取待检测胶类药材样品约10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml50mMPBS稀释，加入适量胰蛋白酶，加入胰蛋白酶的量介于0.1％～10％(w/v)，摇匀，充分酶解，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
本发明所述的液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μmC18反相色谱柱(2.1μm ×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～5min，5～25％A线性梯度洗脱，5～6min，25～5％A线性梯度洗脱，6～7min，5％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。选择专属肽对应的离子对进行检测。
本发明专属肽的离子对及质谱条件为：
鹿肽1：m/z724.9(2+)→802.4,去簇电压(DP)＝10～150,碰撞能量(CE)＝10～50；
鹿肽2：m/z765.2(3+)→554.4,DP＝10～150,CE＝10～50；
鹿肽3：m/z765.5(3+)→554.4,DP＝10～150,CE＝10～50；
鹿肽4：m/z765.8(3+)→554.9,DP＝10～150,CE＝10～50；
鹿肽5：m/z670.9(3+)→531.4,DP＝10～150,CE＝10～50；
驴肽1：m/z724.8(2+)→818.4,DP＝10～150,CE＝10～50；
驴肽2：m/z768.0(3+)→694.5,DP＝10～150,CE＝10～50；
驴肽3：m/z518.5(4+)→556.3,DP＝10～150,CE＝10～50；
马肽1：m/z524.1(4+)→556.3,DP＝10～150,CE＝10～50；
牛肽1：m/z746.9(2+)→846.5,DP＝10～150,CE＝10～50；
牛肽2：m/z755.0(3+)→553.4,DP＝10～150,CE＝10～50；
猪肽1：m/z739.9(2+)→818.5,DP＝10～150,CE＝10～50；
猪肽2：m/z736.0(3+)→526.4,DP＝10～150,CE＝10～50；
本发明鉴别胶类药材的依据为：
检测样品中仅有鹿肽1～鹿肽5中的3个或以上专属肽，则样品为鹿皮胶或鹿角胶；
检测样品中仅有专属肽驴肽1、驴肽2，则样品为驴皮胶或马皮胶；
检测样品中仅有专属肽驴肽1、驴肽2，且同时含有驴肽3，则样品为驴皮胶；
检测样品中仅有专属肽马肽1，则样品为马皮胶；
检测样品中仅有专属肽牛肽1、牛肽2，则样品为牛皮胶；
检测样品中仅有专属肽猪肽1、猪肽2，则样品为猪皮胶；
检测样品中含有鹿肽1～鹿肽5中任意一个专属肽，则样品含有鹿皮胶或鹿角胶；
检测样品中含有驴肽1、驴肽2中任意一个专属肽，则样品含有驴皮胶或马皮胶；
检测样品中含有专属肽驴肽3，则样品含有驴皮胶；
检测样品中含有专属肽马肽1，则样品含有马皮胶；
检测样品中含有专属肽牛肽1、牛肽2中任意一个专属肽，则样品含有牛皮胶；
检测样品中含有专属肽猪肽1、猪肽2中任意一个专属肽，则样品含有猪皮胶。
有益效果：
本发明依据鹿皮胶、阿胶、牛皮胶、马皮胶、猪皮胶所含专属性多肽的质谱离子对信息，可快速准确判断鹿皮胶、阿胶、牛皮胶、马皮胶、猪皮胶的真伪，并可根据专属肽的峰面积比值，可判断掺杂样品的掺伪比例。本发明方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于胶类药材的鉴别与质量控制。
附图说明
图1为鹿肽1质谱图；
图2为鹿肽2质谱图；
图3为鹿肽3质谱图；
图4为鹿肽4质谱图；
图5为鹿肽5质谱图；
图6为驴肽1质谱图；
图7为驴肽2质谱图；
图8为驴肽3质谱图；
图9为马肽1质谱图；
图10为牛肽1质谱图；
图11为牛肽2质谱图；
图12为猪肽1质谱图；
图13为猪肽2质谱图；
图14为不同专属肽的XIC图；
图15为鹿皮胶样品XIC图；
图16为阿胶样品XIC图；
图17为牛皮胶正品XIC图；
具体实施例
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
分别各取鹿、驴、马、牛和猪约10mg，分别加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS 稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％TFA溶液60μl 终止反应，12000rpm离心20min，得到鹿、驴、马、牛和猪酶解液，置于-20℃保存。
将鹿、驴、马、牛和猪酶解液依次注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μmC18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～5min，5～25％A线性梯度洗脱，5～6min，25～5％A 线性梯度洗脱，6～7min，5％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。得到鹿、驴、马、牛和猪的专属性多肽质谱图为图1至图14。
通过以上质谱图分析可得到如下鹿、驴、马、牛和猪专属肽的离子对信息如表1；
表1
序号 专属肽 MRM离子对 DP CE
1 鹿肽1 m/z724.9(2+)→802.4 10～150 10～50
2 鹿肽2 m/z765.2(3+)→554.4 10～150 10～50
3 鹿肽3 m/z765.5(3+)→554.4 10～150 10～50
4 鹿肽4 m/z765.8(3+)→554.9 10～150 10～50
5 鹿肽5 m/z670.9(3+)→531.4 10～150 10～50
6 驴肽1 m/z724.8(2+)→818.4 10～150 10～50
7 驴肽2 m/z768.0(3+)→694.5 10～150 10～50
8 驴肽3 m/z518.5(4+)→556.3 10～150 10～50
9 马肽1 m/z524.1(4+)→556.3 10～150 10～50
10 牛肽1 m/z746.9(2+)→846.5 10～150 10～50
11 牛肽2 m/z755.0(3+)→553.4 10～150 10～50
12 猪肽1 m/z739.9(2+)→818.5 10～150 10～50
13 猪肽2 m/z736.0(3+)→526.4 10～150 10～50
实施例2鹿皮胶真伪鉴别及掺杂情况
取4个批次市售鹿皮胶样品，每批次各取约10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％TFA溶液60 μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿皮胶药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
将鹿皮胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μmC18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～5min，5～25％A线性梯度洗脱，5～6min，25～5％A线性梯度洗脱， 6～7min，5％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置专属肽对应的离子对条件如下：
鹿肽1：m/z724.9(2+)→802.4,DP＝28.79,CE＝31.32；
鹿肽2：m/z765.2(3+)→554.4,DP＝55.81,CE＝25.34；
鹿肽3：m/z765.5(3+)→554.4,DP＝70.15,CE＝29.13；
鹿肽4：m/z765.8(3+)→554.9,DP＝66.10,CE＝24.56；
鹿肽5：m/z670.9(3+)→531.4,DP＝76.15,CE＝24.86；
驴肽1：m/z724.8(2+)→818.4,DP＝73.81,CE＝35.95；
驴肽2：m/z768.0(3+)→694.5,DP＝30.06,CE＝27.74；
驴肽3：m/z518.5(4+)→556.3,DP＝50.40,CE＝22.98；
马肽1：m/z524.1(4+)→556.3,DP＝90.02,CE＝18.64；
牛肽1：m/z746.9(2+)→846.5,DP＝79.96,CE＝29.43；
牛肽2：m/z755.0(3+)→553.4,DP＝72.97,CE＝25.85；
猪肽1：m/z739.9(2+)→818.5,DP＝74.65,CE＝30.13；
猪肽2：m/z736.0(3+)→526.4,DP＝84.44,CE＝26.76；
4个批次鹿皮胶的测定结果见表2与图15(图中A为掺牛皮的鹿皮胶；B为鹿皮胶正品)，由表中专属肽检测结果可判断：其中2个批次样品为鹿皮胶正品，1个批次为牛皮胶掺杂样品，1个批次为牛皮胶样品。
表2 4个批次鹿皮胶样品检测结果
批次 鹿肽1 鹿肽2 鹿肽3 鹿肽4 鹿肽5 牛肽1 牛肽2 驴肽1 驴肽2 驴肽3 马肽 猪肽1 猪肽2
1 + + + + + - - - - - - - -
2 + + + + + - - - - - - - -
3 + + + + + + + - - - - - -
4 - - - - - + + - - - - - -
+：表示检测到该肽段；-：表示未检测到该肽段
实施例3阿胶真伪鉴别及掺杂情况
取6个批次市售阿胶样品，每批次各取约10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，超声酶解10min，酶解后加入10％TFA溶液60μl 终止反应，12000rpm离心20min，即得阿胶药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
将阿胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～5min，5～25％A线性梯度洗脱，5～6min，25～5％A线性梯度洗脱，6～7min，5％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体 2，60psi。设置专属肽对应的离子对条件如下：
鹿肽1：m/z724.9(2+)→802.4,DP＝28.79,CE＝31.32；
鹿肽2：m/z765.2(3+)→554.4,DP＝55.81,CE＝25.34；
鹿肽3：m/z765.5(3+)→554.4,DP＝70.15,CE＝29.13；
鹿肽4：m/z765.8(3+)→554.9,DP＝66.10,CE＝24.56；
鹿肽5：m/z670.9(3+)→531.4,DP＝76.15,CE＝24.86；
驴肽1：m/z724.8(2+)→818.4,DP＝73.81,CE＝35.95；
驴肽2：m/z768.0(3+)→694.5,DP＝30.06,CE＝27.74；
驴肽3：m/z518.5(4+)→556.3,DP＝50.40,CE＝22.98；
马肽1：m/z524.1(4+)→556.3,DP＝90.02,CE＝18.64；
牛肽1：m/z746.9(2+)→846.5,DP＝79.96,CE＝29.43；
牛肽2：m/z755.0(3+)→553.4,DP＝72.97,CE＝25.85；
猪肽1：m/z739.9(2+)→818.5,DP＝74.65,CE＝30.13；
猪肽2：m/z736.0(3+)→526.4,DP＝84.44,CE＝26.76；
6个批次阿胶的测定结果见表3和图16(图中A为掺牛皮的阿胶胶；B为掺马皮的阿胶胶；C为阿胶正品)，由表中专属肽检测结果可判断：其中2个批次样品为阿胶正品，1个批次为牛皮胶掺杂样品，1个批次为牛皮胶样品，2个批次为马皮胶样品。
表3 6个批次阿胶样品检测结果
批次 鹿肽1 鹿肽2 鹿肽3 鹿肽4 鹿肽5 牛肽1 牛肽2 驴肽1 驴肽2 驴肽3 马肽 猪肽1 猪肽2
1 - - - - - - - + + + - - -
2 - - - - - - - + + + - - -
3 - - - - - + + + + + - - -
4 - - - - - + + - - - - - -
5 - - - - - - - + + - + - -
6 - - - - - - - + + - + - -
+：表示检测到该肽段；-：表示未检测到该肽段
实施例4黄明胶真伪鉴别
取4个批次市售黄明胶样品，每批次各取约10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％TFA溶液60μl 终止反应，12000rpm离心20min，即得黄明胶药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
将黄明胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～5min，5～25％A线性梯度洗脱，5～6min，25～5％A线性梯度洗脱， 6～7min，5％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置专属肽对应的离子对条件如下：
鹿肽1：m/z724.9(2+)→802.4,DP＝28.79,CE＝31.32；
鹿肽2：m/z765.2(3+)→554.4,DP＝55.81,CE＝25.34；
鹿肽3：m/z765.5(3+)→554.4,DP＝70.15,CE＝29.13；
鹿肽4：m/z765.8(3+)→554.9,DP＝66.10,CE＝24.56；
鹿肽5：m/z670.9(3+)→531.4,DP＝76.15,CE＝24.86；
驴肽1：m/z724.8(2+)→818.4,DP＝73.81,CE＝35.95；
驴肽2：m/z768.0(3+)→694.5,DP＝30.06,CE＝27.74；
驴肽3：m/z518.5(4+)→556.3,DP＝50.40,CE＝22.98；
马肽1：m/z524.1(4+)→556.3,DP＝90.02,CE＝18.64；
牛肽1：m/z746.9(2+)→846.5,DP＝79.96,CE＝29.43；
牛肽2：m/z755.0(3+)→553.4,DP＝72.97,CE＝25.85；
猪肽1：m/z739.9(2+)→818.5,DP＝74.65,CE＝30.13；
猪肽2：m/z736.0(3+)→526.4,DP＝84.44,CE＝26.76；
4个批次黄明胶的测定结果见表4和图17，由表中专属肽检测结果可判断：4个批次样品均为黄明胶。
表4 4个批次黄明胶样品检测结果
批次 鹿肽1 鹿肽2 鹿肽3 鹿肽4 鹿肽5 牛肽1 牛肽2 驴肽1 驴肽2 驴肽3 马肽 猪肽1 猪肽2
1 - - - - - + + - - - - - -
2 - - - - - + + - - - - - -
3 - - - - - + + - - - - - -
4 - - - - - + + - - - - - -
+：表示检测到该肽段；-：表示未检测到该肽段
实施例5鹿皮胶中掺牛皮胶的检测
将牛皮胶按照1，5，10，20，50，80％比例掺入到鹿皮胶中，分别取不同比例的混合胶样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，得到不同比例混合胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将不同比例混合胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～5min，5～25％A线性梯度洗脱，5～6min，25～5％A线性梯度洗脱，6～7min，5％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置专属肽对应的离子对条件如下：
鹿肽3：m/z765.5(3+)→554.4,DP＝70.15,CE＝29.13；
牛肽2：m/z755.0(3+)→553.4,DP＝72.97,CE＝25.85；
不同掺杂比例的混胶样品检测结果见表5，以混胶样品中牛皮胶与鹿皮胶相对含量的比值(牛皮胶比例/鹿皮胶比例)为横坐标，以牛肽2峰面积与鹿肽3峰面积的比值(A牛肽2/A鹿肽3)为纵坐标作图，牛皮胶比例/鹿皮胶比例与A牛肽2/A鹿肽3呈线性，y＝1.3911x+0.0021，R2 ＝0.9999。表明鹿皮胶掺入牛皮胶的比例与牛肽2与鹿肽3峰面积相关，因此可根据A牛肽2与 A鹿肽3的比例关系确定鹿皮胶中掺入牛皮胶的比例。
表5牛皮胶/鹿皮胶混合样品掺入比例与峰面积关系
Figure BDA0002661193480000081
实施例6阿胶中掺马皮胶的检测
将马皮胶按照1，5，10，20，50，80，90，95，99％比例掺入到阿胶中，分别取不同比例的混合胶样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20 min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，得到不同比例混合胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将不同比例混合胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A (乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～5min，5～25％A线性梯度洗脱，5～6min，25～5％A线性梯度洗脱，6～7min，5％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置专属肽对应的离子对条件如下：
驴肽3：m/z518.5(4+)→556.3,DP＝50.40,CE＝22.98；
马肽1：m/z524.1(4+)→556.3,DP＝90.02,CE＝18.64；
不同掺杂比例的混胶样品检测结果见表6，以混胶样品中马皮胶与阿胶相对含量的比值 (马皮胶比例/阿胶比例)为横坐标，以马肽1峰面积与驴肽3峰面积的比值(A马肽1/A驴肽3) 为纵坐标作图，马皮胶比例/阿胶比例与A马肽1/A驴肽3呈线性，y＝0.9242x-0.1753，R2＝0.9990。表明阿胶掺入马皮胶的比例与马肽1与驴肽3峰面积相关，因此可根据A马肽1与A驴肽3的比例关系确定阿胶中掺入马皮胶的比例。
表6马皮胶/阿胶混合样品掺入比例与峰面积关系
Figure BDA0002661193480000091
实施例7鹿皮胶与阿胶伪品中掺伪比例的测定
将实施例2中的第3批次鹿皮胶样品(鹿皮胶-3)、实施例3中的第5批次阿胶样品(阿胶-5)，分别取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，得到不同伪品胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将不同伪品胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～5min，5～25％A线性梯度洗脱，5～6min，25～5％A线性梯度洗脱， 6～7min，5％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置专属肽对应的离子对条件如下：
鹿肽3：m/z765.5(3+)→554.4,DP＝70.15,CE＝29.13；
牛肽2：m/z755.0(3+)→553.4,DP＝72.97,CE＝25.85；
驴肽3：m/z518.5(4+)→556.3,DP＝50.40,CE＝22.98；
马肽1：m/z524.1(4+)→556.3,DP＝90.02,CE＝18.64；
结果见表7与表8，根据检测的A牛肽2与A鹿肽3数值，将A牛肽2/A鹿肽3数值代入方程y＝1.3911x +0.0021，计算牛皮胶/鹿皮胶数值为1.371，则进一步计算出阿胶中掺入马皮的量为57.8％；根据检测的A马肽1与A驴肽3数值，将A马肽1/A驴肽3数值代入方程y＝0.9242x-0.1753，计算马皮胶/阿胶数值为0.612，则进一步计算出阿胶中掺入马皮的量为38.0％。
表7鹿皮胶-3样品检测
Figure BDA0002661193480000101
表8阿胶-5样品检测
Figure BDA0002661193480000102
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种胶类药材的检测方法，其特征在于：将待检测的胶类药材样品用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液注入液质联用仪，采用ESI正离子模式，多反应监测模式进行检测，如果检测出与专属性多肽保留时间、母离子-子离子一致，则判定所述胶类药材样品的物种来源与专属性多肽对应的物种一致；并根据专属性多肽的峰面积比值，判断掺杂样品的掺伪比例；具体包括：
取待检测胶类药材样品10 mg，加入5 ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20 min，取上清液150 μl，置于2 ml离心管中，以1 ml 50 mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10% TFA溶液60 μl终止反应，12000 rpm离心20 min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用；
色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱，规格2.1 mm × 100 mm，流速0.3ml/min，流动相A相为乙腈，流动相B为0.1%甲酸，0~5 min，5~25%A线性梯度洗脱，5~6 min，25~5%A线性梯度洗脱，6~7 min，5%A洗脱；
电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；选择专属肽对应的离子对进行检测；
专属肽的离子对及质谱条件为：
鹿肽1：m/z724.9/2+→802.4, 去簇电压DP=10~150, 碰撞能量CE=10~50；
鹿肽2：m/z765.2/3+→554.4, DP=10~150, CE=10~50；
鹿肽3：m/z765.5/3+→554.4, DP=10~150, CE=10~50；
鹿肽4：m/z765.8/3+→554.9, DP=10~150, CE=10~50；
鹿肽5：m/z670.9/3+→531.4, DP=10~150, CE=10~50；
驴肽1：m/z724.8/2+→818.4, DP=10~150, CE=10~50；
驴肽2：m/z768.0/3+→694.5, DP=10~150, CE=10~50；
驴肽3：m/z518.5/4+→556.3, DP=10~150, CE=10~50；
马肽1：m/z524.1/4+→556.3, DP=10~150, CE=10~50；
牛肽1：m/z746.9/2+→846.5, DP=10~150, CE=10~50；
牛肽2：m/z755.0/3+→553.4, DP=10~150, CE=10~50；
猪肽1：m/z739.9/2+→818.5, DP=10~150, CE=10~50；
猪肽2：m/z736.0/3+→526.4, DP=10~150, CE=10~50。
2.根据权利要求1所述的胶类药材的检测方法，其特征在于，所述胶类药材包括鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶、阿胶、马皮胶、猪皮胶，以及以这些胶类药材生产制备的含胶类的食品、保健品。
3.根据权利要求1所述的胶类药材的检测方法，其特征在于，加入胰蛋白酶的量w/v为0.1%~10%。
4.根据权利要求1所述的胶类药材的检测方法，其特征在于，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解或酶固定化酶解。
5.根据权利要求1所述的胶类药材的检测方法，其特征在于，鉴别胶类药材的依据为：
检测样品中仅有鹿肽1~鹿肽5中的3个或以上专属肽，则样品为鹿皮胶或鹿角胶；
检测样品中仅有专属肽驴肽1、驴肽2，则样品为驴皮胶或马皮胶；
检测样品中仅有专属肽驴肽1、驴肽2，且同时含有驴肽3，则样品为驴皮胶；
检测样品中仅有专属肽马肽1，则样品为马皮胶；
检测样品中仅有专属肽牛肽1、牛肽2，则样品为牛皮胶；
检测样品中仅有专属肽猪肽1、猪肽2，则样品为猪皮胶；
检测样品中含有鹿肽1~鹿肽5中任意一个专属肽，则样品含有鹿皮胶或鹿角胶；
检测样品中含有驴肽1、驴肽2中任意一个专属肽，则样品含有驴皮胶或马皮胶；
检测样品中含有专属肽驴肽3，则样品含有驴皮胶；
检测样品中含有专属肽马肽1，则样品含有马皮胶；
检测样品中含有专属肽牛肽1、牛肽2中任意一个专属肽，则样品含有牛皮胶；
检测样品中含有专属肽猪肽1、猪肽2中任意一个专属肽，则样品含有猪皮胶。
6.根据权利要求1所述的胶类药材的检测方法，其特征在于，判断掺杂样品的掺伪比例： A胶专属肽峰面积/B胶专属肽峰面积与A胶比例/B胶比例呈线性关系，测定A胶专属肽峰面积与B胶专属肽峰面积，通过计算确定混合胶中A胶与B胶的比例；
其中，牛皮胶比例/鹿皮胶比例与A牛肽2/A鹿肽3呈线性，线性方程为：y = 1.3911x +0.0021，R² = 0.9999；
马皮胶比例/阿胶比例与A马肽1/A驴肽3呈线性，线性方程为：y = 0.9242x - 0.1753，R² =0.9990。
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