CN103383383A - 一种胶类中药及其制品中猪源性成分的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胶类中药及其制品中猪源性成分的检测方法,本发明基于猪的胶原蛋白序列中包含其专属性寡肽Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg,经限制性内切酶酶切从胶原蛋白中游离出,然后采用液相色谱-串联质谱对胶类中药及其制品进行检测。该方法具有特征性强,灵敏度高,操作简单,可对胶类中药及其制品中是否混有猪源性成分进行鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪源性成分的检测方法,具体涉及一种胶类中药及其制品中猪源性成分的检测方法,属于中药检测领域。
背景技术
胶类中药由动物的皮、骨等熬制而成胶类物质,包括阿胶、龟甲胶、鹿角胶等,具有典型民族特色的传统中药,广泛用于血液、妇科、产科、呼吸、肿瘤等疾病的预防和治疗。
随着胶类中药市场的不断发展,生产胶类中药的厂家也不断增多,生产能力以及产品质量参差不齐。以阿胶为例,由于驴的畜牧价值在不断下降,而其经济价值确未见提高,驴的数量在世界范围内急剧下降,驴皮的供应也逐年紧张,价格不断上涨。市场上出现了很多不法分子,在生产阿胶时,部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、牛皮、猪皮等,甚至脏皮、烂皮、病死动物之皮等来取代驴皮进行熬制。这类假冒伪劣产品不但没有任何疗效,还对人体危害极大,影响着人们的身心健康。此外,对于其他胶类中药包括龟甲胶、鹿角胶等及其制品,也存在类似情况,这些伪品严重阻碍了整个胶类中药市场的健康发展。
胶类中药一般经长时间高温蒸煮浓缩而成,主要成分非常相近且不同厂家的生产工艺存在差异,采用红外、近红外、X-衍射等方法对胶类中药纯品进行真伪鉴别常存在判断不准确等情况。胶类中药中猪源性成分的鉴别,已有学者从DNA角度进行鉴别,但只是定性,存有假阴性与假阳性现象。有报道称从多肽的角度利用质谱检测胶类中药中龟源性、鹿源性、牛源性、驴源性成分,结果准确可靠。但目前还没有从胶原多肽的角度对胶类中药及其制品中猪源性成分的检测方法。
胶类中药中主要成分为胶原蛋白多肽,不同动物的胶原蛋白氨基酸序列存在差异,同一物种稳定存在的差异性多肽可作为该物种的特征性多肽,通过限制性内切酶酶切,利用质谱完全可以对胶类中药及其制品进行溯源鉴定。
发明内容
本发明针对上述问题,提供了一种胶类中药及其制品中猪源性成分的检测方法,该方法操作简单,特征性强,灵敏度高,不但能鉴定胶类中药及其制品中是否混有猪源性成分。
本发明的技术方案如下:
一种胶类中药及其制品中猪源性成分的检测方法,包括下列步骤:
(1)将胶类中药或其制品用用pH8.0、质量分数为1%NH4HCO3溶液溶解,或提取其中的蛋白多肽类成分用pH8.0、质量分数为1%NH4HCO3溶液溶解,加入胰蛋白酶或精氨酸酶等限制性内切酶进行酶切;
(2)放入液质联用仪,以待检测的阴性样品为基质,加入寡肽Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg或猪皮胶纯品作为对照,选择该寡肽的母离子m/z473.0(双电荷)进行监测;或采用二级质谱模式选择该寡肽的母离子及其子离子进行监测。如果检出该离子的保留时间与对照品一致,且其子离子与对照品的子离子一致,则所述中药含有猪源性成分;如果没有与对照品保留时间一致的该离子,则不含有猪源性成分。
上述胶类中药选自阿胶、黄明胶、龟甲胶或鹿角胶等。
上述胶类中药制品选自由相应胶类中药制成的食品、保健品或药品。
采用本发明的方法,能够快速检测胶类中药中是否混杂有猪源性成分,从而分辨真伪,尽管胶类中药中胶原蛋白多肽有一定水解与破坏,但本发明基于其主要成分胶原蛋白中的差异性寡肽,其含量高,受破坏程度很小,可对胶类中药及其制品中的猪源性成分进行鉴定。
本发明还涉及寡肽,其氨基酸序列为Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg,及其由所述寡肽与可接受的载体组成的组合物。此外,还包括所述寡肽及其组合物在检测胶类中药及其制品中猪源性成分中的应用。
附图说明
图1是合成寡肽及纯品胶SIM扫描模式下选择离子m/z473.0监测的质谱图;
图2是合成寡肽及纯品胶SRM扫描模式下选择离子对m/z473.0→586.3,717.3,529.3监测的质谱图;
图3是合成寡肽及加入质量分数为5%猪皮胶的混合胶SRM扫描模式下选择离子对m/z473.0→586.3,717.3,529.3监测的质谱图;
图4是合成寡肽及阿胶制品(以阿胶补血膏为例)在SRM扫描模式下选择离子对m/z473.0→586.3,717.3,529.3监测的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1胶类中药中猪源性成分的检测
1材料和试剂
材料:纯品胶包括阿胶、黄明胶、猪皮胶、马皮胶、龟甲胶、鹿角胶,分别用驴皮、牛皮、猪皮、马皮、龟甲、鹿角煎煮获得。
试剂:碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯,购自中国药品生物制品检定研究院)、合成寡肽Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg(吉尔生化上海有限公司)。
2检测方法
(1)合成寡肽对照样品酶解溶液的制备
取1.0g待测纯品阿胶样品于500mL量瓶中,加少量质量分数为1%NH4HCO3(pH8.0)溶液,超声使样品完全溶解,用质量分数为1%NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液1mL加入合成寡肽0.3μg,再加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μl,37℃恒温酶解6h。
(2)胶样品酶解溶液的制备
取1.0g待测纯品胶样品于500mL量瓶中,加少量质量分数为1%NH4HCO3(pH8.0)溶液,超声使样品完全溶解,用质量分数为1%NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液1mL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μl,37℃恒温酶解6h。
(3)检测
取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件:C18反相色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm),流动相A为体积分数为0.1%的甲酸溶液,流动相B为乙腈,流速0.3mL/min;梯度洗脱:0~40min,2%~50%流动相B。质谱条件:电喷雾正离子模式(ESI+)选择m/z473.0或774.3进行SIM扫描。
结果见图1,7.4min处只有猪皮胶中检出相应的离子峰,其他均没有检出;可见该法能够特异性检测猪源性成分,而与其他各种动物源性成分包括驴、马、牛、龟、鹿等进行区分。
实施例2胶类中药中猪源性成分的检测
1材料和试剂
材料:纯品胶包括阿胶、黄明胶、猪皮胶、马皮胶、龟甲胶、鹿角胶,分别用驴皮、牛皮、猪皮、马皮、龟甲、鹿角煎煮获得。
试剂:碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯,购自中国药品生物制品检定研究院)、合成寡肽Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg(吉尔生化上海有限公司)。
2检测方法
(1)合成寡肽对照样品酶解溶液的制备
取1.0g待测纯品阿胶样品于500mL量瓶中,加少量质量分数为1%NH4HCO3(pH8.0)溶液,超声使样品完全溶解,用质量分数为1%NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液1mL加入合成寡肽0.3μg,再加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μl,37℃恒温酶解6h。
(2)胶样品酶解溶液的制备
取1.0g待测样品于500mL量瓶中,加少量质量分数为1%NH4HCO3(pH8.0)溶液,超声使样品完全溶解,用质量分数为1%NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液1mL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μl,37℃恒温酶解6h。
(3)检测
取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件:C18反相色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm),流动相A为体积分数为0.1%的甲酸溶液,流动相B为乙腈,流速0.3mL/min;梯度洗脱:0~40min,2%~50%B。质谱条件:电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应检测,选择m/z473.0→586.3,717.3,529.3作为检测离子对。
结果见图2,7.4min处只有猪皮胶中检出相应的离子峰,可选用离子对m/z473.0→586.3根据对照品的峰面积进行定量。可见该法能够特异性检测猪源性成分,而与其他各种动物源性成分包括驴、马、牛、龟、鹿等进行区分。
实施例3掺入猪皮胶的胶类中药中猪源性成分的检测
1材料和试剂
材料:混合胶样品由实施例2中的纯品胶样品分别加入质量分数为5%猪皮胶制成,包括含质量分数为5%猪皮胶的阿胶、含质量分数为5%猪皮胶的黄明胶、质量分数为5%猪皮胶的马皮胶、含质量分数为5%猪皮胶的龟甲胶、含质量分数为5%猪皮胶的鹿角胶。
试剂:碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯,购自中国药品生物制品检定研究院)、合成寡肽Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg(吉尔生化上海有限公司)。
2检测方法
(1)合成寡肽对照样品酶解溶液的制备
取1.0g待测纯品阿胶样品于500mL量瓶中,加少量质量分数为1%NH4HCO3(pH8.0)溶液,超声使样品完全溶解,用质量分数为1%NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液1mL加入合成寡肽0.3μg,再加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μl,37℃恒温酶解6h。
(2)胶样品酶解溶液的制备
取1.0g待测样品于500mL量瓶中,加少量质量分数为1%NH4HCO3(pH8.0)溶液,超声使样品完全溶解,用质量分数为1%NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液1mL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μl,37℃恒温酶解6h。
(3)检测
取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件:C18反相色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm),流动相A为体积分数为0.1%的甲酸溶液,流动相B为乙腈,流速0.3mL/min;梯度洗脱:0~40min,2%~50%B。质谱条件:电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应检测,选择m/z473.0→586.3,717.3,529.3作为检测离子对。
结果见图3,7.4min处加入质量分数为5%猪皮胶的混合胶样品中均检出相应的离子峰,而实施案例2中的纯品阿胶、黄明胶、马皮胶、龟甲胶、鹿角胶中均没有检出相应的离子峰。可见该法能够特异性检测混入猪源性成分的胶类中药。
实施例4胶类中药制品中猪源性成分的检测
1材料和试剂
材料:猪皮胶、阿胶补血膏(山东东阿阿胶股份有限公司)、加入猪皮胶的阿胶补血膏;
试剂:碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯,购自中国药品生物制品检定研究院)、合成寡肽Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg(吉尔生化上海有限公司)。
2检测方法
(1)合成寡肽对照样品酶解溶液的制备
取1.0g阿胶补血膏加入质量分数为1%NH4HCO3(pH8.0)溶液25mL溶解,加入2g三氯乙酸,4℃放置10min,10000rpm离心5min,弃上清,向沉淀物中加入2mL冷丙酮并震荡、离心除去上清,重复洗涤3次,最后将沉淀物转入100mL量瓶中,用质量分数为1%NH4HCO3溶液(pH8.0)溶解并定容至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液1mL加入合成寡肽0.3μg,再加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μl,37℃恒温酶解6h。
(2)待测样品酶解溶液的制备
取1.0g待测样品加入质量分数为1%NH4HCO3(pH8.0)溶液25mL溶解,加入2g三氯乙酸,4℃放置10min,10000rpm离心5min,弃上清,向沉淀物中加入2mL冷丙酮并震荡、离心除去上清,重复洗涤3次,最后将沉淀物转入100mL量瓶中,用质量分数为1%NH4HCO3溶液(pH8.0)溶解并定容至刻度,摇匀,微孔滤膜过滤,精密量取续滤液1mL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100μl,37℃恒温酶解6h。
(3)检测
取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件:C18反相色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm),流动相A为体积分数为0.1%的甲酸溶液,流动相B为乙腈,流速0.3mL/min;梯度洗脱:0~40min,2%~50%B。质谱条件:电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应检测,选择选择m/z473.0→586.3,717.3,529.3作为检测离子对。
结果见图4,7.4min处只有猪皮胶和加入猪皮胶的阿胶补血膏中检出相应的离子峰,阿胶补血膏中没有检出。可见该法能够特异性检测阿胶制品的猪源性成分,而与其他各种动物源性成分包括驴、马、牛、龟、鹿等进行区分。
Claims (7)
1.一种胶类中药及其制品中猪源性成分的检测方法,包括下列步骤:
(1)将胶类中药或其制品用pH8.0、质量分数为1%NH4HCO3溶液溶解,或提取其中的蛋白多肽类成分用pH8.0、质量分数为1%NH4HCO3溶液溶解,加入胰蛋白酶或精氨酸酶等限制性内切酶进行酶切;
(2)放入液质联用仪,以待检测的阴性样品为基质,加入寡肽Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg或猪皮胶纯品作为对照,选择该寡肽的母离子双电荷m/z473.0进行监测;或采用二级质谱模式选择该寡肽的母离子及其子离子进行监测;如果检出该离子的保留时间与对照品一致,且其子离子与对照品的子离子一致,则所述中药含有猪源性成分;如果没有与对照品保留时间一致的该离子,则不含有猪源性成分。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述的胶类中药选自阿胶、黄明胶、龟甲胶或鹿角胶等。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述的胶类中药制品选自由相应胶类中药制成的食品、保健品或药品。
4.一种寡肽,其特征在于,所述寡肽的氨基酸序列为:
Ala-Gly-Val-Met-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ser-Arg。
5.一种组合物,其特征在于,由权利要求4所述的寡肽与可接受的载体组成。
6.权利要求4所述的寡肽在检测胶类中药及其制品中猪源性成分中的应用。
7.权利要求5所述的组合物在检测胶类中药及其制品中猪源性成分中的应用。
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