CN112098578B - 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可区分鹿皮胶与鹿角胶的特征肽段及其检测方法，本发明通过大量实验筛选，以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽3呈线性，建立标准曲线方程为y=1.034x+0.0157，R²=0.9908；鹿角胶占比与A肽2/A肽3也呈线性，建立标准曲线方程为y=0.7883x+0.0949，R²=0.9905；鹿角胶掺入比例与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值相关，根据A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的比值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种鹿源特征肽段及其检测方法，具体涉及区分鹿皮胶与鹿角胶，以及鹿角胶中掺有鹿皮胶的样品、掺入鹿皮胶的比例的特征肽段和检测方法。
技术背景
胶类药材包括阿胶、鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶等，80％以上的成分为不同类别的胶原蛋白，包括I型胶原α1链(COL1A1)、I型胶原α2链(COL1A2)、II型胶原α1链(COL2A1)、III型胶原α1链(COL3A1)等，其中以COL1A2来源的肽段为主。COL1A2作为高保守蛋白质，广泛存在于不同动物种体内，是构成胶类药材的重要蛋白类成分之一。
鹿角胶与鹿皮胶均来源于梅花鹿或马鹿，两者为名贵胶类中药材，鹿角胶为梅花鹿或马鹿角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，鹿皮胶为梅花鹿或马鹿的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。鹿角为马鹿或梅花鹿已骨化的角，价格远高于鹿皮，市场上存在以鹿皮胶掺入鹿角胶以次充好的现象。如何将鹿皮胶与鹿角胶进行区分，着实是胶类药材鉴定研究的难题，给鹿角胶与鹿皮胶鉴别，以及鹿角胶掺入鹿皮胶的伪品鉴别都带来了挑战。
鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，且两者均来源于梅花鹿或马鹿，其蛋白质组成相同，因此，通过寻找专属性肽段来区分两者基本不可能。
发明内容
发明目的：本发明通过大量是实验筛选，研究确定3条鹿源肽段相对含量的比值，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段，所述的特征肽段由如下所述的肽1-3组成，其中，肽1:
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys
肽2：
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys
肽3：
Gly-Asp-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将特征肽段配成混合对照品溶液；
(2)将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)特征肽段混合对照品溶液注入液质联用仪，以特征肽段对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4、肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4进行检测、肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4进行检测；以肽1峰面积A肽1与肽3峰面积A肽3的比值或肽2峰面积A肽2与肽3峰面积A肽3的比值确定样品为鹿皮胶或是鹿角胶。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，所述的酶切方法为：取待检测胶类药材样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1％～10％。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm×100mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：m/z 864.0(三电荷)→535.4、m/z 858.7(三电荷)→527.4、m/z 845.4(三电荷)→507.4。
本发明所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，鹿角胶的A肽1/A肽3不得低于1.0，A肽2/A肽3不得低于0.5，鹿皮胶的A肽1/A肽3不得高于0.2，A肽2/A肽3不得高于0.5。
作为优选方案，以上所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，鹿皮胶与鹿角胶所含比例检测的标准曲线方程的建立：
将鹿角胶与鹿皮胶按0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的比例混合，将每批次混胶样品各取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入质量浓度为1％胰蛋白酶，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用；
将不同比例混胶样品酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱，规格2.1μm×100mm，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；
设置特征肽段对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50。
以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽3呈线性，建立标准曲线方程为y＝1.034x+0.0157，R2＝0.9908；鹿角胶占比与A肽2/A肽3也呈线性，建立标准曲线方程为y＝0.7883x+0.0949，R2＝0.9905；鹿角胶掺入比例与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值相关，根据A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。
有益效果：本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明通过大量是实验筛选，研究确定3条鹿源肽段相对含量的比值，并建立的线性方程，从而用来区分鹿皮胶与鹿角胶。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿皮胶与鹿角胶的区分及质量控制。从而可以克服现有技术中，鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，专属性肽段也难以区分的不足，取得了非常好的技术进步。
附图说明
图1为鹿角胶在混合胶中占比与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值关系。
图2为肽1的质谱图。
图3为肽2的质谱图。
图4为肽3的质谱图。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
一种鹿源特征肽，所述的特征肽序列有3个，如序列表1：
肽1:
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys；
肽2：
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys；
肽3：
Gly-Asp-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
实施例2鹿皮胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的测定
取10个批次市售鹿皮胶样品，每批次各取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿皮胶药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
将上述10批次的鹿皮胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50。
10个批次鹿皮胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值见表1，A肽1/A肽3平均值为0.085±0.039，A肽2/A肽3平均值为0.186±0.099。
表1鹿皮胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3结果
实施例3鹿角胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的测定
取10个批次鹿角样品，按照2020版《中国药典》制备鹿角胶方法，获得鹿角胶样品，每批次各取约10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，超声酶解10min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿角胶酶解液，置于-20℃保存，备用。
将10个批次的鹿角胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50。
10个批次鹿角胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值见表2，A肽1/A肽3平均值为1.659±0.453，A肽2/A肽3平均值为0.898±0.167。
表2鹿角胶A肽1/A肽3、A肽2/A肽3结果
实施例4不同比例鹿皮胶与鹿角胶混合样品中A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的测定
将鹿角胶与鹿皮胶按0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的比例混合，将每批次混胶样品各取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％TFA溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用。
将不同比例混胶样品酶解液依次注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱。
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0(三电荷)→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7(三电荷)→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4(三电荷)→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50。
不同比例混胶样品的A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值见表3，鹿角胶在混合胶中占比与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值关系如图1所示。以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽3呈线性，y＝1.034x+0.0157，R2＝0.9908；鹿角胶占比与A肽2/A肽3也呈线性，y＝0.7883x+0.0949，R2＝0.9905。表明鹿角胶掺入比例与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值相关，因此可根据A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的比值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。
表3鹿角胶/鹿皮胶混合样品掺入比例与峰面积关系
序列表
<110> 南京中医药大学
<120> 一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段及其检测方法
<141> 2020-09-01
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Pro Xaa Gly Phe Xaa Gly Ala Xaa Gly Pro Lys
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Pro Xaa Gly Phe Pro Gly Ala Xaa Gly Pro Lys
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Asp Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Thr Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Pro Xaa Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys
20 25 30
Claims (6)
1.一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段，其特征在于，所述的特征肽段由如下所述的肽1-3组成，其中，
肽1:
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Hyp-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys
肽2：
Gly-Ser-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Lys
肽3：
Gly-Asp-Asp-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Pro-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Lys。
2.一种可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1中所述的特征肽段配成混合对照品溶液；
(2)将待检测鹿皮胶与鹿角胶样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)特征肽段混合对照品溶液注入液质联用仪，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱，规格2.1μm×100mm，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；以特征肽段对照，采用ESI正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：肽1：m/z864.0三电荷→535.4、肽2：m/z 858.7三电荷→527.4进行检测、肽3：m/z 845.4三电荷→507.4进行检测；
以肽1峰面积A肽1与肽3峰面积A肽3的比值或肽2峰面积A肽2与肽3峰面积A肽3的比值确定样品为鹿皮胶或是鹿角胶；鹿角胶的A肽1/A肽3不得低于1.0，A 肽2/A肽3不得低于0.5，鹿皮胶的A肽1/A肽3不得高于0.2，A肽2/A肽3不得高于0.5。
3.根据权利要求2所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法为：取待检测胶类药材样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得胶类药材酶解液，置于-20℃保存，备用。
4.根据权利要求3所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1％～10％。
5.根据权利要求3所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。
6.根据权利要求2所述的可区分鹿角胶和鹿皮胶的特征肽段的检测方法，其特征在于，鹿皮胶与鹿角胶所含比例检测的标准曲线方程的建立：
将鹿角胶与鹿皮胶按0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的比例混合，将每批次混胶样品各取10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml 50mM PBS稀释，加入质量浓度为1％胰蛋白酶，摇匀，微波酶解30min，酶解后加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得不同比例混胶样品酶解液，置于-20℃保存，备用；
将不同比例混胶样品酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm C18反相色谱柱，规格2.1μm×100mm，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸，0～3.5min，10～30％A线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％A线性梯度洗脱，4～6min，10％A洗脱；
液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式ESI+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500V；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；
设置特征肽段对应的离子对条件如下：
肽1：m/z 864.0三电荷→535.4，DP＝166.57,CE＝33.95；
肽2：m/z 858.7三电荷→527.4，DP＝160.35,CE＝35.65；
肽3：m/z 845.4三电荷→507.4，DP＝143.27,CE＝31.50；
以鹿角胶在混合胶中占比为横坐标，以A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值为纵坐标作图，鹿角胶占比与A肽1/A肽3呈线性，建立标准曲线方程为y＝1.034x+0.0157，R2＝0.9908；鹿角胶占比与A肽2/A肽3也呈线性，建立标准曲线方程为y＝0.7883x+0.0949，R2＝0.9905；鹿角胶掺入比例与A肽1/A肽3、A肽2/A肽3数值相关，根据A肽1/A肽3、A肽2/A肽3的值确定鹿角胶与鹿皮胶混合比例。
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| Mass spectrometric detection of marker peptides in tryptic digests of gelatin:A new method to differentiate between bovine and porcine gelatin;Guifeng Zhang et al.;《Food Hydrocolloids》;20091231;第23卷;2001–2007页 * |
| 基于"多肽组-修饰组"比较分析鹿皮与鹿皮胶物质基础;刘睿 等;《药学学报》;20200403;第55卷;1882-1888页 * |
| 基于nanoLC-MS/MS法的黄明胶胶原蛋白鉴定研究;张涛 等;《南京中医药大学学报》;20200110;第36卷;105-109页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB202302575D0 (en) | 2023-04-12 |
| CN112098578A (zh) | 2020-12-18 |
| GB2612747A (en) | 2023-05-10 |
| WO2022048049A1 (zh) | 2022-03-10 |
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