CN112924699A - 动物物种的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
通过分析肽来鉴定动物物种,提供一种客观的动物物种的鉴定方法和鉴定装置。包含将从鉴定对象样本提取的动物纤维蛋白组(胶原蛋白等),用蛋白水解酶(蛋白酶)水解成肽段后,对肽段的氨基酸序列进行分析的分析步骤,和从分析的所有肽段中,去除与所有鉴定对象的动物物种相同的检出肽段,至少从1种的动物物种中选出被检测出有特异性肽段的选出步骤,和用所选的肽段来鉴定样本的动物物种的鉴定步骤。在所选出的肽段中,首先,根据只在特定的1种动物物种检测到的特异性肽段来鉴定样品的动物物种,然后对还未鉴定的样品,可以使用至少从2种以上的动物物种检测到的特异性肽段来鉴定动物物种。
Description
本申请是申请日为2015年3月30日，申请号为201580078920.8，发明名称为“动物物种的鉴定方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种关于动物物种的客观的识别方法的技术,尤其是关于识别皮革种类的方法。
背景技术
依照家庭用品品质表示法,对皮革制的包、衣服、手套、家具有杂货工业品品质表示的规定。其中,将皮革或合成革作为产品的全部或一部分使用的服装,作为表示对象的6种动物(牛、猪、绵羊、山羊、马、鹿)的鉴定是必须的。
近来,为了可以正确的进行品质表示,越来越多的产品在流通阶段被要求有准确的畜类判定。但是,目前没有法定的鉴定方法。关于这些杂货工业产品的表示,通常作为考试或检查中用于鉴定的方法有外观观察(厚度,大小,颜色或花纹,毛色,光泽,触感等),显微镜观察(毛孔排列,断面结构,毛小皮纹理,毛髄质等),仪器分析(元素,成分,染料,药物分析等),DNA鉴定等(例如专利文献1)。
在此,存在的问题的是,外观观察需要长期的经验,而且缺乏客观的科学根据,缺乏说服力。另外,虽然显微镜观察是当前的主流,但在许多情况下,当纤维结构或银面花纹的差异不明显时,也多难以进行判别。此外,仪器分析仅是辅助手段,并且单独使用进行识别是比较困难的。此外,关于DNA鉴定,在肉类和谷类等方面的精度很高,因此被广泛使用,但是皮革的DNA鉴定却尚未达到实用化的地步。其理由是,在皮革制造过程中,使用石灰性脱毛或脱毛浸灰进行松散皮纤维的工序中会破坏DNA,导致提取困难,有时无法检测出DNA。此外,例如铬鞣皮,为了促进酵素分解而进行脱铬处理,在处理过程中反而使DNA受损。在这种情况下难以检测出DNA,目前的DNA鉴定方法还无法在平常工作中使用。
利用仪器分析的方法,已知的是检查由胶原蛋白衍生的相当于二肽的热分解生成物的热裂解气相色谱和质谱分析法来识别天然皮革的方法(参见非专利文献1)。这种识别方法,虽然可以作为鉴别天然皮革的指标物质,检测出不受污染而产生的分解抑制影响的Hyp衍生的相当于二肽的热分解生成物,但是这些热分解生成物不会因为动物物种的不同而出现显著的差异,难以鉴定动物物种。
【专利文献1】特开2003－125781号公报
【非专利文献1】仓田正治,“采用热裂解气相色谱和质谱分析法对天然皮革小块的识别方法”,BUNSEKI KAGAKU Vol.57,No.7,pp.563-569(2008)
发明内容
发明所要解决的技术问题
鉴于上述情况,本发明的目的在于提供一种能够简便且准确的鉴定动物物种的方法和鉴定装置,以方便鉴定动物的皮革样本。
解决问题的方法
为了达到上述目的,本发明的动物物种的鉴定方法的特征在于：包括
将从鉴定对象样本提取的动物的纤维蛋白质组,用蛋白水解酶(蛋白酶)水解成肽段后,然后对肽段的氨基酸序列进行分析的分析步骤；和从分析的所有肽段中,去除与所有的鉴别动物物种相同的检出肽段,至少从1种的动物物种中选出被检测出有特异性肽段的选出步骤；和用所选肽段来鉴定样本的动物物种的鉴定步骤。
鉴定对象样本有牛、马、猪、绵羊、山羊、鹿6种动物物种的皮革,或鸵鸟、鲑鱼、鲤鱼、鳄鱼等的皮革,狐狸、浣熊、水貂等的毛皮等。纤维状蛋白质与球状蛋白质相比,不容易变性,而且会制造结合组织、肌腱、骨、骨骼肌等。作为纤维蛋白的例子,有胶原蛋白、角蛋白、凝胶等。将纤维蛋白组用蛋白水解酶水解成肽段后,分析肽段的氨基酸序列。关于蛋白水解酶,可以优选使用胰蛋白酶,但不限于此。关于肽段的氨基酸序列的分析方法,可以优选使用质谱分析法(mass spectrometry)、肽的顺序分析、通过检出序列特异的肽抗体等方法。
根据本发明的动物物种鉴定方法,在所选出的肽段中,首先,根据在特定的1种动物物种检测到的特异性肽段来鉴定样品的动物物种,然后对还未鉴定的样品,可以使用至少从2种以上的动物物种检测到的特异性肽段来鉴定样品的动物物种。
首先,根据在特定的1种动物物种中检测到的肽段来鉴定样本的动物物种,能够有效快速的鉴定出对象样本的动物物种。也就是说,如果有在特定的1种动物物种检测到特异性肽段的话,识别是否存在该肽段,如果发现了该肽段的话,就可以确定为特定的一种动物物种。
在上述的氨基酸序列的分析步骤中,如果是通过质谱分析法进行分析时,具体地说,使用液相色谱仪(liquid chromatograph；LC)-质谱分析仪(mass spectrometer；MS)(LC-MS)的串联质谱(MS/MS)检测,测定出肽段的前体离子与产物离子的质荷比(m/z),对氨基酸序列进行分析以确定肽段。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,如果是从牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中选出的至少1种动物的动物皮的鉴定方法时,将从鉴定对象样本中提取的胶原蛋白用胰蛋白酶分解后,在序列号1～38的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,以此来鉴定动物物种。
也就是Collagen Iα1,Collagen Iα2,Collagen IIIα1(以下分别省略为COL1A1,COL1A2,COL3A1)的部分序列,在GEPGPAGLPGPPGER(序列号1)、GEPGPTGLPGPPGER(序列号2)、GFPGADGVAGPK(序列号3)、GFPGSDGVAGPK(序列号4)GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR(序列号5)、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGETGPSGPAGPTGAR(序列号6)、GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK(序列号7)、GETGPAGRPGEAGPPGPPGPAGEK(序列号8)、AGEVGPPGPPGPAGEK(序列号9)、SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR(序列号10)、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR(序列号11)、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR(序列号12)、GIPGPVGAAGATGAR(序列号13)、GIPGPAGAAGATGAR(序列号14)、EGPVGLPGIDGRPGPIGPAGAR(序列号15)、EGPAGLPGIDGRPGPIGPAGAR(序列号16)、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGKPGER(序列号17)、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER(序列号18)、GIPGEFGLPGPAGAR(序列号19)、GIPGEFGLPGPAGPR(序列号20)、GPPGESGAAGPTGPIGSR(序列号21)、GPPGESGAAGPAGPIGSR(序列号22)、GDGGPPGATGFPGAAGR(序列号23)、GDGGPPGVTGFPGAAGR(序列号24)、GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR(序列号25)、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR(序列号26)、GEPGPAGAVGPAGAVGPR(序列号27)、GEPGPVGSVGPVGAVGPR(序列号28)、GEPGPAGSVGPAGAVGPR(序列号29)、GEPGPVGAVGPAGAVGPR(序列号30)、IGQPGAVGPAGIR(序列号31)、SGQPGTVGPAGVR(序列号32)、TGQPGAVGPAGIR(序列号33)、GEMGPAGIPGAPGLIGAR(序列号34)、GEMGPAGIPGAPGLMGAR(序列号35)、GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR(序列号36)、GSPGPQGPPGVPGPSGLIGITGAR(序列号37)、以及GSPGPQGPPGAPGPGGISGITGAR(序列号38)的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,以此鉴定出牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物物种。
关于COL1A1,COL1A2及COL3A1,序列号1～38的肽断,并不是与牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿所有6种动物物种共同的部分序列,而是至少有1种动物物种存在的特异性的部分序列。序列号1～38的肽段的氨基酸序列,因为胶原蛋白分子的稳定性,在6种动物物种之间具有较高的保存性。
本发明的动物物种的鉴定方法,作为优选,是从牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中选出的至少1种动物的动物皮的鉴定方法,将从鉴定对象样本中提取的胶原蛋白用胰蛋白酶分解后、在序列号5～14、序列号19～22以及序列号25～33的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,以此来鉴定动物物种。
根据序列号5～14、序列号19～22以及序列号25～33的氨基酸序列的肽段,可以不依赖质谱分析仪器,也能进行稳定的检测。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,如果鉴定对象是牛,在GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR(序列号5)以及IGQPGAVGPAGIR(序列号31)的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,以此鉴定动物物种也是可以的。
关于序列号5和序列号31的肽段,在牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中,是只对牛具有特异性的肽段,仅用这些肽段就可以确定是否为牛。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,如果鉴定对象是马,在GEPGPTGLPGPPGER(序列号2)、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR(序列号11)、GDGGPPGVTGFPGAAGR(序列号24)、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR(序列号26)、GEPGPVGSVGPVGAVGPR(序列号28)、SGQPGTVGPAGVR(序列号32)、以及GSPGPQGPPGVPGPSGILGLTGAR(序列号37)的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,以此来确定是否为马也是可以的。
关于序列号2,11,24,26,28,32以及37的肽段,在牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中,是只对马具有特异性的肽段,仅用这些肽段就可以确定是否为马。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,如果鉴定对象是猪,在GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK(序列号8)、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR(序列号12)、GIPGEFGLPGPAGPR(序列号20)、GEPGPAGSVGPAGAVGPR(序列号29)、GEMGPAGIPGAPGLMGAR(序列号35)以及GSPGPQGPPGAPGPGGISGITGAR(序列号38)的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,以此来鉴定是是否为猪也是可以的。
关于序列号8,12,20,29,35及38的肽段,在牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中,是只对猪具有特异性的肽段,仅用这些肽段就可以确定是否为猪。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,如果鉴定对象是绵羊,在AGEVGPPGPPGPAGEK(序列号9)的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,以此来鉴定是否为绵羊也是可以的。
序列号9的肽段,在牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中,是只对绵羊具有特异性的肽段,仅用这些肽段就可以确定是否为绵羊。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,在筛选鉴定对象的动物物种时,识别是否存在GEPGPAGAVGPAGAVGPR(序列号27)的氨基酸序列的肽段,鉴定对象就缩小到牛或鹿,以此来鉴定动物物种也是可以的。
关于序列号27的肽段,在牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中,是只对牛和鹿具有特异性的肽段,仅用这些肽段就可以筛选出是否为牛或鹿,或者就可以确定是否为牛或鹿。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,在筛选鉴定对象的动物物种时,在GEPGPVGAVGPAGAVGPR(序列号30)、以及GFPGSDGVAGPK(序列号4)的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,鉴定对象就缩小到绵羊或山羊,以此来鉴定动物物种也是可以的。
关于序列号4和序列号30的肽段,在牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中,是只对绵羊和山羊具有特异性的肽段,仅用这些肽段就可以筛选出是否为绵羊或山羊,或者就可以确定是否为绵羊或山羊。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,在筛选鉴定对象的动物物种时,在GIPGPAGAAGATGAR(序列号14)以及GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER(序列号18)的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,来筛选鉴定对象是否为马或猪,以此来鉴定动物物种也是可以的。
关于序列号14和序列号18的肽段,在牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中,是只对马和猪具有特异性的肽段,仅用这些肽段就可以筛选出是否为马或猪,或者就可以确定是否为马或猪。
根据本发明的动物物种的鉴定方法,是从牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中选出的至少1种动物的动物皮的鉴定方法,将从鉴定对象样本中提取的胶原蛋白用胰蛋白酶分解后,作为优选执行以下1)～5)步骤。
1)识别是否有序列号5、序列号27和序列号31的氨基酸序列的肽段,以确定是否为牛的步骤
2)识别是否有序列号27和序列号33的氨基酸序列的肽段,以确定是否为鹿的步骤
3)识别是否有序列号11或序列号28的氨基酸序列的肽段,以确定是否为马的步骤
4)识别是否有序列号12或序列号29的氨基酸序列的肽段,以确定是否为猪的步骤
5)执行完上述1～4的步骤,对还未确定的剩下样本,识别是否有序列号9的氨基酸序列的肽段,以确定是否为绵羊,识别是否有序列号7的氨基酸序列的肽段,以确定是否为山羊的步骤。
在此,关于识别是否存在肽段的方法,例如,使用液相色谱仪-质谱分析仪(LC－MS)进行串联质谱(MS/MS)检测,测定出肽段的前体离子与产物离子的质荷比(m/z),以识别出是否存在肽段。
在上述1)～5)的步骤中,利用质荷比(m/z)的测定结果,只要关注COL1A1的3个峰值和COL1A2的2个峰值合计的5个的峰值,就能够简便地确定动物物种。
接下来,就本发明的动物物种的鉴定装置进行说明。
本发明的动物物种的鉴定装置,其特征在于：是一种从牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中选出的至少1种动物的动物皮的鉴定装置,将从鉴定对象样本中提取的胶原蛋白用胰蛋白酶分解后,在序列号1～38的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在的识别功能,以此来鉴定动物物种。
此外,本发明的动物物种的鉴定装置,其特征在于：是一种从牛、马、猪、绵羊、山羊和鹿6种动物中选出的至少1种动物的动物皮的鉴定装置,将从鉴定对象样本中提取的胶原蛋白用胰蛋白酶分解后,在序列号5～14、序列号19～22以及序列号25～33的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在的识别功能,以此来鉴定动物物种。
在此,识别是否有肽段存在的方法,最好是通过使用液相色谱-质谱分析仪(LC－MS)进行串联质谱(MS/MS)检测,测定出肽段的前体离子与产物离子的质荷比(m/z),以识别出是否存在肽段。
发明效果
根据本发明的鉴定方法或鉴定装置,对从动物的皮革样本等中提取的纤维状蛋白质群进行分析,可以简便且准确的鉴定动物物种,达到正确执行皮革产品的品质表示的效果。本发明的鉴定方法,不只是为了完善现有的显微镜观察技术,而是在包括服装在内的杂货工业品等在全球交易的情况下,可以作为国际标准来使用。
附图说明
【图1】是本发明的动物物的种鉴定方法的流程图
【图2】是实施例1所涉及的动物物种的鉴定方法的流程图(1)
【图3】是实施例1所涉及的动物物种的鉴定方法的流程图(2)
【图4】是6种动物物种的鉴定处理流程图
【图5】是牛的识别处理流程图
【图6】是马的识别处理流程图
【图7】是猪的识别处理流程图
【图8】是绵羊的识别处理流程图
【图9】是马或鹿的识别处理流程图
【图10】是绵羊或山羊的识别处理流程图
【图11】是马或猪的识别处理流程图
具体实施方式
以下,参照附图对本发明的实施形态进行详细说明。另外,本发明的范围不限于以下的实施例或附图,也可以进行多种变更和变形。
本发明的动物物种的鉴定方法的流程如图1所示。
如上所述,本发明的动物物种的鉴定方法,包括从鉴定对象样本提取动物纤维蛋白组(步骤S101),将纤维蛋白组用蛋白水解酶(蛋白酶)水解成肽段(步骤S102),对肽段的氨基酸序列进行分析(步骤S103)。然后,从分析过的所有肽段中,去除与所有的鉴别动物物种相同的检出肽段(步骤S104)。
在此,至少从1种的动物物种中选出被检测出有特异性肽段(步骤S105),用所选的肽段鉴定样本的动物物种(步骤S106)。
【实施例1】
在本实施例中,对牛、马、猪、绵羊、山羊、鹿的6种动物的天然皮革进行鉴定的例子进行说明。
首先,关于天然皮革的动物物种的皮的组织和主要纤维的胶原蛋白进行说明。动物皮由表皮层、真皮层及其下面的皮下结缔组织构成。表皮层由角质层、颗粒层等4层组成,是皮革不用的层被除去。另外,乳头层和皮下组织中的弹性蛋白纤维也会在制造过程中的机械操作或药品处理中几乎全被除去。另外,构成毛发的角蛋白,除了皮毛以外,制造皮革时是无用的,用石灰处理分解去除。因此,构成皮革的纤维是骨胶原纤维占大部分。真皮层分为乳头层(银面层)和网状层。在真皮层的最上层是皮革的银面层,这个层比网状层更精细地交织在一起,纤维的大部分都是水平走向。因此,皮革的银面层与网状层相比,组织更致密,伸长或水分的渗透性会变差。
胶原蛋白的氨基酸序列与其他的蛋白质相比是特异的。关于氨基酸序列,1次结构的特征是Gly－X－Y的重复,每3个残基出现1个甘氨酸。X,Y是任意的氨基酸,根据其种类X,Y所出现的频率不同。像这种由3条的三组重复的氨基酸约1000残基(分子量约为10万)的多肽链(α链)结合在一起,即胶原蛋白分子。这种三链结构非常牢固,即使在酵素中也无法分解。
形成胶原蛋白结构的分子种类至少有6种(I～V型和I型三聚体)。形成胶原蛋白分子的多肽链已知的有8种,其中数量最多的是I型胶原蛋白,占全部胶原蛋白的80％～90％。
接下来,对实验所使用的鉴定对象样本进行说明。鉴定对象样本根据家庭用品质表示法杂货工业品规定,成为服装的表示对象的6种动物(牛、马、猪、绵羊、山羊、鹿),以流通量多的铬鞣皮为主,颜色选深色和浅色的。另外,还添加了鞣质皮革,选用加工时用DNA法中提取困难的深色染色制品或施以润色剂的样本,选用的都是来历清楚的皮革。
以下,参考图2和图3,就上述鉴定对象样本的6种动物物种的鉴定方法的流程进行详细说明。
<步骤S01:皮革的脱脂工序>
将样本浸在乙醚(和光纯药制造)中,1小时内循环6次以上,清洗2个小时。为了使乙醚蒸发,把样本静置后,将其放在纯水里浸泡1小时。此时使用是100:1的浴比,偶尔搅动。从样本中除去多余的水分后,静置样品自然干燥。
<步骤S02:皮革的粉碎工序>
使用冷冻粉碎机(日本分析工业制造；JFC-300),将洗净的纤维放在液体氮气中冻结15分钟后粉碎。
<步骤S03:皮革的酶消化工序>
将重约0.5mg的样本移至试管,往各试管各添加500μL的25mM碳酸氢铵(和光纯药制造),在60℃的培养箱以1250rpm的转速处理1小时,然后在室温下静置10分钟。用50μL的25mM碳酸氢铵(和光纯药制造)溶解20μg的色氨酸(promega制造决定蛋白质序列用),并将其加入到各个试管中。使用37℃的培养箱,以250rpm转速进行18小时的酶反应。
<步骤S04:消化肽的纯化、浓缩工序>
将样本(约550μL)用0.22μm过滤器(TAKARA制造；SUPRECTM-01)在4℃下以4900xg过滤10分钟。此后,将样本放在-80℃下冻结10分钟,使用冻结乾燥机(东京理科器械制；EYELAFDU-1200),在-50℃下进行过夜真空冻结干燥处理。
然后,用0.1％的甲酸将样本溶解,旋转后,等稍微离心后进行5分钟的超声处理。经过超声处理后的样本,再次使用0.22μm过滤器在4℃下以4900xg过滤10分钟,将采集到的样本中的2μL用于LC－MS/MS分析。使用的是LCMS的甲酸。
<步骤S05:质谱分析工序>
质谱分析使用的是一种高效液相离子阱-飞行时间质谱仪(岛津制作所制；LCMS-IT-TOF)和三重串联四极杆液质联用仪LCMS/MS系统(安捷伦科技制；G6460QQQ LC－MS)。
<步骤S06:肽段的探索工序>
使用LCMS-IT-TOF蛋白质检索软件(Mascot)中的容错搜索(能容许前体离子的质量差异的搜索),搜索动物物种有特征性的肽段。此外,为了可以探索包含羟基脯氨酸,羟基赖氨酸在内的肽段,用蛋白质翻译后修饰的参数,去除半胱氨酸残基修饰(烷化),不止有常用的Oxidation(M),还加入Oxidation(P)和Oxidation(K)。
关于6种(牛,马,猪,绵羊,山羊,鹿)是否有特异的肽段,结果如下:
(A)LCMS-IT-TOF
用LCMS-IT-TOF分析后进行的Mascot检索中,主要检测出了3种胶原蛋白(COL1A1,COL1A2,COL3A1)。在此,就各胶原蛋白,从6种的动物物种选出氨基酸序列不同的部分。COL1A1,COL1A2,COL3A1的结果分别示意于表1,2,3。此外,下表中的项目AA的表记示意的是与牛的氨基酸序列相当的氨基酸序列号,项目Ox示意的是被氧化修饰的氨基酸数量的总和，项目m/z主要示意的是检测出的离子的质荷比，项目Mr(calc)示意的是理论分子量(同位素质量)。
【表1】
| 序列号 | AA | 肽 | Ox | m/z | Mr(calc) | 牛 | 马 | 猪 | 绵羊 | 山羊 | 鹿 |
| 1 | 472-486 | GEPGPAGLPGPPGER | 3 | 718.3 | 1434.6 | ○ | × | ○ | ○ | ○ | ○ |
| 2 | 472-486 | GEPGPTGLPGPPGER | 3 | 733.3 | 1464.6 | × | ○ | × | × | × | × |
| 3 | 493-504 | GFPGADGVAGPK | 1 | 544.7 | 1087.5 | ○ | ○ | ○ | × | × | ○ |
| 4 | 493-504 | GFPGSDGVAGPK | 1 | 552.7 | 1103.5 | × | × | × | ○ | ○ | × |
| 5 | 763-795 | GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR | 2 | 951.8 | 2852.4 | ○ | × | × | × | × | × |
| 6 | 763-795 | GLTGPIGPPGPAGAPGDKGETGPSGPAGPTGAR | 2 | 961.8 | 2882.4 | × | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ |
| 7 | 910-933 | GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK | 3 | 739.3 | 2215.0 | ○ | × | × | × | ○ | ○ |
| 8 | 910-933 | GETGPAGRPGEAGPPGPPGPAGEK | 3 | 730.0 | 2187.0 | × | × | ○ | × | × | × |
| 9 | 918-933 | AGEVGPPGPPGPAGEK | 2 | 724.8 | 1447.6 | × | × | × | ○ | × | × |
| 10 | 1062-1083 | SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR | 0 | 659.3 | 1974.9 | ○ | × | × | ○ | ○ | ○ |
| 11 | 1062-1083 | SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR | 0 | 649.3 | 1944.9 | × | ○ | × | × | × | × |
| 12 | 1062-1083 | SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR | 0 | 654.6 | 1960.9 | × | × | ○ | × | × | × |
【表2】
【表3】
检测出的肽段的氨基酸序列在动物物种中具有很高的保存性,显示了胶原蛋白分子的稳定性。但是,部分氨基酸序列分析,只确认到一残基(A)和(V)等微小的差异。
另外,与序列号19有着相同质荷比,相同理论分子量的氨基酸序列在现有的数据库中存在。那就是,与GIPGEFGLPGPAGAR(序列号19)不同的氨基酸序列的GLPGEFGLPGPAGAR(序列号39)存在。这是因为,亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)的分子量相同,质量也没有差异的缘故。同样的,与序列号34有着相同质荷比,相同理论分子量的氨基酸序列在现有的数据库中存在。与GEMGPAGIPGAPGLIGAR(序列号34)不同的氨基酸序列的GEMGPAGIPGAPGLLGAR(序列号40)存在。
(B)QQQ LC－MS
根据LCMS-IT-TOF的分析结果,在已经可以被确定的动物物种的肽段中,用QQQLC－MS分析,很稳定地检测出的肽段示意在表4中。
【表4】
如果使用QQQ LC-MS进行皮革物种鉴定测试作为例行程序进行的话,更进一步的筛选出如表4中示意的特异性肽段,可实现物物种的识别变得更简便化。只要是牛、马、猪、绵羊、山羊、鹿6种动物的皮革,只要关注COL1A1的3峰值和COL1A2的2峰值合计5峰值就可以进行简单的动物物种的识别。
接下来,就牛、马、猪、绵羊、山羊、鹿6种动物的皮革的识别顺序的一个例子进行说明。
(1)首先,关注从流通量最多的牛中检出的特异的m/z 951.8,604.8,767,识别为牛。
(2)此时,从鹿中也检出m/z 767,但是鹿的m/z 590.8也是特异的,因此以是否有检测出这些来识别是否为鹿。
(3)马可通过关注特异的m/z 649.3或m/z 802.9来进行识别。另外,为了确认,可以确认下是否有m/z 591.8。
(4)猪可通过关注特异的m/z 654.7或m/z 774.8来识别。
(5)绵羊或山羊,显示特异的m/z 724.9为绵羊,显示特异的m/z 739.3为山羊,可通过关注这些不同点,来识别是否为绵羊或山羊。
将6种动物(牛、猪、绵羊、山羊、马、鹿)的天然皮革,利用上述(1)～(5)的识别顺序进行的动物物种的鉴定结果,和用LCMS-IT-TOF得出的鉴定结果进行了比较。每种动物物种的样本,都准备3～5类型,对分析准确度进行了评估,分析结果是几乎为100％的高比例。
关于使用DNA鉴别法或MALDI-TOF MS的分析,由于皮革在加工阶段的药剂引起的损伤或染料、制革工剂等的夹雑物的原因使鉴定变得困难,本发明的动物物种的鉴定方法,解决了以上的所有的课题,有实用的可能性。
【实施例2】
在本实施例中,对狐狸、浣熊、水貂等的毛皮的动物物种的鉴定例子进行说明。
关于狐狸、浣熊、水貂等的毛皮的动物物种的鉴别方法的流程,也和实施例1一样,遵循图1的流程。
首先,从狐狸、浣熊、水貂等毛皮中提取角蛋白(步骤S101)。将提取的角蛋白用角蛋白分解酶分解(步骤S102)。角蛋白分解酶,可以使用胰蛋白酶。
接下来,与实施例1同样的,对肽段的氨基酸序列进行分析(步骤S103)、去除与所有的鉴别动物物种相同的检出肽段(步骤S104)、选出从动物物种中被检测出的特异性肽段(步骤S105)。然后,用所选的肽段鉴定样本的动物物种(步骤S106)。
【其他实施例】
(1)如果鉴定对象为牛,如图5所示,通过识别出有无序列号5或序列号31的氨基酸序列的肽段,可以鉴定是否为牛。
(2)如果鉴定对象为马,如图6所示,通过识别出有无序列号2、序列号11、序列号24、序列号26、序列号28、序列号32或序列号37的氨基酸序列的肽段,可以鉴定是否为马。
(3)如果鉴定对象为猪,如图7所示,通过识别出有无序列号8、序列号12、序列号20、序列号29、序列号35或序列号38的氨基酸序列的肽段,可以鉴定是否为猪。
(4)如果鉴定对象为绵羊,如图8所示,通过识别出有无序列号9的氨基酸序列的肽段,可以鉴定是否为绵羊。
(5)在筛选鉴定对象的动物物种时,如图9所示,通过识别出有无序列号27的氨基酸序列的肽段,鉴定对象就可缩小到牛或鹿。
(6)在筛选鉴定对象的动物物种时,如图10所示,通过识别出有无序列号4或序列号30的氨基酸序列的肽段,鉴定对象就可缩小到绵羊或山羊。
(7)在筛选鉴定对象的动物物种时,如图11所示,通过识别出有无序列号14或序列号18的氨基酸序列的肽段,鉴定对象就可缩小到马或猪。
工业应用性
本发明对于天然皮革的动物物种的鉴定是有用的。
序列表
<110> 国立大学法人神户大学; 一般财团法人化检检验机构
<120> 动物物种的鉴定方法和装置
<160> 40
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 牛
<400> 1
Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 马
<400> 2
Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg
1 5 10 15
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 牛
<400> 3
Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 山羊
<400> 4
Gly Phe Pro Gly Ser Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 33
<212> PRT
<213> 牛
<400> 5
Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Glu Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala
20 25 30
Arg
<210> 6
<211> 33
<212> PRT
<213> 绵羊
<400> 6
Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly
1 5 10 15
Asp Lys Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala
20 25 30
Arg
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> 牛
<400> 7
Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys
20
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 猪
<400> 8
Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys
20
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 绵羊
<400> 9
Ala Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys
1 5 10 15
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 牛
<400> 10
Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ile
1 5 10 15
Gly Pro Val Gly Ala Arg
20
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> 马
<400> 11
Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ile
1 5 10 15
Gly Pro Val Gly Ala Arg
20
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<211> 22
<212> PRT
<213> 猪
<400> 12
Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Val
1 5 10 15
Gly Pro Val Gly Ala Arg
20
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 牛
<400> 13
Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 马
<400> 14
Gly Ile Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg
1 5 10 15
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<211> 22
<212> PRT
<213> 牛
<400> 15
Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Ala Arg
20
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<211> 22
<212> PRT
<213> 猪
<400> 16
Glu Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Ala Arg
20
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<211> 30
<212> PRT
<213> 牛
<400> 17
Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Thr Ala Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Arg
20 25 30
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<212> PRT
<213> 马
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Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Thr Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro Gly Glu Arg
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<212> PRT
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Gly Ile Pro Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 猪
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Gly Ile Pro Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 21
Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly
1 5 10 15
Ser Arg
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Gly Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly Ser
1 5 10 15
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<400> 23
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1 5 10 15
Arg
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Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Val Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly
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Arg
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Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ser Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly
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<400> 26
Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ser Leu Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly
1 5 10 15
Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg
20
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<211> 18
<212> PRT
<213> 鹿
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Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly
1 5 10 15
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<212> PRT
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Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Ala Val Gly
1 5 10 15
Pro Arg
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> 猪
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1 5 10 15
Pro Arg
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Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly
1 5 10 15
Pro Arg
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<213> 牛
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<211> 13
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<400> 32
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<211> 13
<212> PRT
<213> 猪
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Thr Gly Gln Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Ile Arg
1 5 10
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<212> PRT
<213> 牛
<400> 34
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1 5 10 15
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<213> 猪
<400> 35
Gly Glu Met Gly Pro Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Met Gly
1 5 10 15
Ala Arg
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<211> 24
<212> PRT
<213> 牛
<400> 36
Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Gly
1 5 10 15
ILE Ala Gly Leu Thr Gly Ala Arg
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<211> 24
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<400> 37
Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Val Pro Gly Pro Ser Gly
1 5 10 15
Leu Ile Gly Ile Thr Gly Ala Arg
20
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<212> PRT
<213> 猪
<400> 38
Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ile Ser Gly Ile Thr Gly Ala Arg
20
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 牛
<400> 39
Gly Leu Pro Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg
1 5 10 15
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 牛
<400> 40
Gly Glu Met Gly Pro Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ala Arg
Claims (1)
1.一种动物物种的鉴定方法,包括
将从鉴定对象样本提取的源自动物皮的胶原蛋白,用蛋白水解酶(蛋白酶)水解成肽段后,对肽段的氨基酸序列进行分析的步骤；和
在GEPGPTGLPGPPGER(序列号2)、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR(序列号11)、GDGGPPGVTGFPGAAGR(序列号24)、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR(序列号26)、GEPGPVGSVGPVGAVGPR(序列号28)、SGQPGTVGPAGVR(序列号32)、以及GSPGPQGPPGVPGPSGILGLTGAR(序列号37)的氨基酸序列的肽段中,识别是否至少有任意一种的肽段存在,以此来鉴定是否为马的步骤。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210608 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |