CN112903784A - 一种酶墨水、制备方法及生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶墨水、制备方法及生物传感器，一种酶墨水，含有导电墨水；所述的导电墨水中分散有银纳米颗粒，所述的银纳米颗粒上偶联生物酶；银纳米颗粒的粒径范围为10～20nm；银纳米颗粒的含量为45mg/mL；所述的导电墨水中含有聚乙二醇、壳聚糖、胶体石墨粉和木糖醇。本发明将导电墨水应用于生物传感器领域，提供了具有良好分散性的酶墨水的制备方法，其既具有导电性，又具有催化能力，在电化学生物传感器应用于实际样品检测方面具有广阔的应用前景。制备好的酶墨水滴涂相同体积于具有良好重复性的丝网印刷电极上，即可大规模批量制备，避免了传统电极修饰技术的复杂性和专业性，且重复性较好。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种酶墨水、制备方法及生物传感器。
背景技术
电化学传感器的制备需要在工作电极表面目的性地构建传感活性界面，使电极具有某种特定的化学和电化学性质，从而实现对待检测物质的灵敏特异性响应。传感活性界面的构建往往需要科学的设计、复杂耗时的制备和严格的实验条件，专业性和技术性强严重限制了传感器在实际(农残)检测中的应用。
近期，基于纳米材料的导电墨水因其同时具有良好的导电性和黏附力，便于在柔性基底上低成本、大面积的制作电路板，常与印刷技术结合用来制备印刷电子产品。导电墨水的主要成分有：导电材料、粘合剂等。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶墨水、制备方法及生物传感器，将导电墨水应用于生物传感器领域，提供了具有良好分散性的酶墨水的制备方法，其既具有导电性，又具有催化能力，在电化学生物传感器应用于试剂样品检测方面具有广阔的应用前景。
本发明要解决的技术问题可通过以下技术方案实现：
一种酶墨水，含有导电墨水；所述的导电墨水中分散有银纳米颗粒，所述的银纳米颗粒上偶联生物酶；银纳米颗粒的粒径范围为10～20nm；银纳米颗粒的含量为45mg/mL；所述的导电墨水中含有聚乙二醇、壳聚糖、胶体石墨粉和木糖醇。
可选的，在所述的酶墨水中：木糖醇的浓度为2M，聚乙二醇的质量分数为36％，壳聚糖的质量分数为0.4％，胶体石墨粉的质量分数为30％。
可选的，所述的生物酶选自乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和多酚氧化酶。
一种酶墨水的制备方法，所述的酶墨水为本发明所述的酶墨水；
制备方法包括：制备导电墨水，将银纳米颗粒与生物酶偶联后加入到导电墨水中分散即得。
可选的，所述的导电墨水的制备包括：
配置质量分数为60％的聚乙二醇水溶液，0.1M的醋酸溶解壳聚糖获得质量分数为1％的壳聚糖-醋酸溶液，以体积比为6:4混合聚乙二醇水溶液和壳聚糖-醋酸溶液，得到PEG/Chit混合物；
2mL的PEG/Chit混合物中依次添加0.6086g木糖醇、0.8571g胶体石墨粉和0.0202g甲基绿，得到导电墨水。
可选的，银纳米颗粒与生物酶偶联的方法包括：
2.25mg的银纳米颗粒和12.5U的生物酶混合，于180r/min及37℃下偶联20min。
可选的，所述的生物酶为乙酰胆碱酯酶，银纳米颗粒与乙酰胆碱酯酶偶联的方法包括：
125μL的100U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，加入到875μL的pH值为7.5的0.02M的磷酸盐缓冲液中，得到12.5U/mL的生物酶溶液；5mL 0.45mg/mL的银纳米颗粒溶液与得到的生物酶溶液于180r/min、37℃下偶联20min。
可选的，所述的银纳米颗粒的制备方法如下：
1.0g壳聚糖溶解在50mL1.0wt％的乙酸溶液中制备壳聚糖悬浮液；
50mL0.01M的AgNO3溶液加入到壳聚糖悬浮液中得到AgNO3/Cts悬浮液；
20mL 0.04M的NaBH4溶液加入到AgNO3/Cts悬浮液中搅拌即得。
本发明所述的酶墨水用于制备生物传感器的应用。
一种生物传感器，包括丝网印刷电极，在所述丝网印刷电极的工作电极上涂有本发明所述的酶墨水。
通过本发明的技术方案，将导电墨水应用于生物传感器领域，提供了具有良好分散性的酶墨水的制备方法，其既具有导电性，又具有催化能力，在电化学生物传感器应用于试剂样品检测方面具有广阔的应用前景。提供了一种可商品化的农残检测电极的制备方法，将制备好的酶墨水滴涂相同体积于具有良好重复性的丝网印刷电极上，即可大规模批量制备，避免了传统乙酰胆碱酯酶生物传感器不同修饰电极之间表面结构均一性的影响，且重复性较好。无需专业人员在实验室操作条件下进行复杂电极修饰的可商品化的农残检测电极，在有机磷农残检测方面有广阔的应用前景，该酶墨水的制备方法可同样用于其他生物酶(碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)的固定，并用于相应的检测。
以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1为本发明的生物传感器及检测的具体流程图；
图2为银纳米颗粒的TEM表征图(左右两个图为不同放大倍数的图)；
图3为银纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱图；
图4为滴涂不同体积比的聚乙二醇和壳聚糖的玻碳电极在铁氰化钾-氯化钾溶液中的循环伏安图(聚乙二醇与壳聚糖-醋酸的体积比分别为a：4:6；b：5:5；c：6:4；d：7:3)；
图5为在体积比为6:4的聚乙二醇与壳聚糖-醋酸混合溶液(a)中依次加入木糖醇(b)、胶体石墨粉(c)后，将其滴涂在玻碳电极上在铁氰化钾-氯化钾溶液中的循环伏安图；
图6为滴涂有(b)无(a)甲基绿的墨水的SPE在铁氰化钾-氯化钾溶液中的循环伏安图；
图7分别为用乙酰胆碱酯酶与银纳米偶联(a)以及简单混合(b)时制备的酶墨水得到的乙酰胆碱酯酶生物传感器在2mM氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)溶液中的循环伏安图。
图8为将20μL墨水滴涂在滤纸上晾干，反复对折50次前(A)后(B)的照片。
图9为实施例1中的乙酰胆碱酯酶生物传感器分别在0.5mM、1mM、2mM、3mM的氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)溶液中的循环伏安图(a：3mMATCl；b：2mMATCl；c：1mMATCl；d：0.5mMATCl)。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本发明的第一个目的是提供酶墨水，该酶墨水中含有具有生物相容性的导电墨水和银纳米颗粒偶联的生物酶；银纳米颗粒的粒径范围为10～20nm，银纳米颗粒的含量为45mg/mL；导电墨水为聚乙二醇和壳聚糖作粘合剂、胶体石墨粉作导电材料、木糖醇作生物相容性稳定剂的具有生物相容性的导电墨水。常用的导电墨水中采用的是银粉，而酶墨水中采用的是银纳米颗粒，乙酰胆碱酯酶与银纳米颗粒进行偶联，更接近其活性中心，可以加速电子传递，同时实现酶的固定化制备成酶墨水，避免检测过程中酶从电极表面脱落影响检测的准确度和灵敏度。该酶墨水的制备方法可同样用于其他酶(碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)的固定，并用于相应的检测。从提高生物相容性的角度出发选择合适的材料制备导电墨水，将其与生物酶结合，制备出可以确保生物成分(酶、抗原或抗体)的活性、电导率高、具有强表面粘附性的酶墨水，并将其应用到电化学检测领域，只需要将其滴涂到丝网印刷电极上就可以方便快捷地完成传感活性界面的构建。在重复率要求不高的情况下，甚至可以允许使用者根据现场需要灵活设计传感活性界面的形状，可以有效简化电极修饰的步骤切实提高电化学生物传感器的实际应用能力。
本发明选用具有很高生物相容性的聚乙二醇作为酶墨水的粘合剂，添加具有高度生物相容性的壳聚糖既能增加酶墨水的粘附力也有助于延长酶墨水的保存时间，选用胶体石墨粉作为导电材料来提高酶墨水的导电性，选用木糖醇作为酶墨水中酶的生物相容性稳定剂，制备出具有良好生物相容性的导电墨水；进一步利用银纳米颗粒偶联修饰生物活性物质乙酰胆碱酯酶均匀分散于导电墨水中制备出酶墨水，实现了生物识别元件乙酰胆碱酯酶的固定化避免了常用电极修饰技术中存在的酶活性受到影响和检测过程中酶脱落的问题，同时银纳米颗粒偶联后更接近酶活性中心可以加速电子传递，结合纳米材料的协同增效作用可以在很大程度上提高酶墨水的响应能力，进而提高传感器的灵敏度和稳定性。选用具有很高生物相容性的聚乙二醇作为酶墨水的粘合剂，添加胶体石墨粉提高酶墨水的导电性，添加壳聚糖提高酶墨水的粘附性，选用木糖醇作为酶墨水中酶的生物相容性稳定剂。并在此基础上进一步优化各组分的浓度和配比关系，使制备的酶墨水在保持高响应性能的同时具有高导电性、强黏附力。
本发明的第二个目的是制备一种无需专业人员在实验室操作条件下进行复杂电极修饰的可商品化的农残检测电极，快速方便地制备一种乙酰胆碱酯酶电化学传感器。将制备好的酶墨水滴涂相同体积于具有良好重复性的丝网印刷电极上，即可批量大规模制备可商品化的农残检测电极。将导电墨水应用于生物传感器领域，制备出具有良好分散性的酶墨水，其既具有导电性，又具有催化能力。本发明将材料领域的导电墨水应用于乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备，从生物相容性角度对现有导电墨水的组成成分，如：粘合剂、导电材料等进行设计和筛选，制备出具有良好生物相容性的导电墨水作为基质，向其中加入银纳米颗粒偶联乙酰胆碱酯酶制备出同时具有催化能力和导电性的酶墨水，一次大量制备具有良好分散性的酶墨水，滴涂相同体积的酶墨水来修饰具有良好重复性的丝网印刷电极以开发出类似于个人血糖仪试纸条式的可商品化的农残检测电极，制备了一种电化学传感器，在有机磷农残检测方面有广阔的应用前景。该酶墨水的制备方法可同样用于其他酶(碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)的固定，并用于相应的检测。
结合图1，给出制备酶墨水的具体步骤为：
①配置质量分数为60％的聚乙二醇水溶液，用0.1M的醋酸溶解壳聚糖，质量分数为1％，将获得的聚乙二醇水溶液和壳聚糖-醋酸溶液混合，调节二者的体积比为6:4(二者体积比的优化过程如图4所示)，聚乙二醇与壳聚糖-醋酸分别取1.2mL和0.8mL，得到2mL的PEG/Chit混合物。
将不同体积比的聚乙二醇和壳聚糖混合溶液分别滴涂在玻碳电极上，使其自然晾干，各自置于铁氰化钾-氯化钾溶液中，采用循环伏安法表征其电化学性能，从图中可以看出，当聚乙二醇水溶液和壳聚糖-醋酸溶液的体积比分别为4:6、5:5、6:4、7:3时，其CV图中对应的氧化峰电流分别为15.66μA、17.05μA、17.86μA、15.72μA，氧化还原峰的峰间距分别为0.615V、0.6V、0.541V、0.674V。当聚乙二醇水溶液和壳聚糖-醋酸溶液的体积比为6:4时，CV图的氧化还原峰的峰电流最大，峰间距最小。因此，为保证酶墨水的性能，在后续酶墨水的制备过程中，聚乙二醇水溶液和壳聚糖-醋酸溶液的体积比应选择6:4。
聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一种水溶性高分子材料，由于其在水中具有很低的界面自由能，而且分子链柔性好、活动性高，所以具有良好的生物相容性，可以作为药物载体和移植器件表面的抗吸附聚合物。所以本项目用聚乙二醇作为酶墨水的粘合剂，可以很好的保持酶的活性。在酶墨水中添加具有高生物相容性的聚乙二醇，既可作为导电墨水中的粘合剂，同时很好保持了酶的活性。
壳聚糖(chitosan)作为一类功能多样和用途广泛的天然氨基葡萄糖聚合物，是一种成膜性很好的天然高分子物质，壳聚糖除具有成膜性外还有抗菌防腐作用。因此添加具有高度生物相容性的壳聚糖既能增加酶墨水的粘附力也有助于延长酶墨水的保存时间。在酶墨水中添加具有高度生物相容性的壳聚糖，既能增加酶墨水的粘附力也有助于延长酶墨水的保存时间。
②在获得的PEG/Chit混合物中添加0.6086g的木糖醇作为稳定剂。水分子和酶的官能团之间的强氢键作用会导致酶溶解在水介质中时会发生构象变化。因此长时间暴露于水性介质中，会导致酶的活性和传感器的性能下降。因此，需要在酶墨水中添加一个具有生物相容性的酶稳定剂。木糖醇(Xylitol)是一种常用的糖替代物，即使在热应力下也可以稳定水溶液中酶的性质，因此选用木糖醇作为酶墨水中酶的生物相容性稳定剂。
③在获得的混合物中彻底溶解0.8571g的胶体石墨粉(添加不同成分后对酶墨水导电性的改善如图5所示)。
在体积比为6:4的聚乙二醇与壳聚糖-醋酸混合溶液中依次加入木糖醇、胶体石墨粉后，将其分别滴涂在玻碳电极上，使其自然晾干，各自置于铁氰化钾-氯化钾溶液中，采用循环伏安法表征其电化学性能，从图中可以看出，当只有体积比为6:4的聚乙二醇与壳聚糖-醋酸混合溶液时，其CV图中对应的氧化峰电流为17.86μA，向其中依次加入木糖醇、胶体石墨粉后，对应的氧化峰电流依次增大为81.49μA、145.1μA，即依次加入木糖醇、胶体石墨粉后，CV图的氧化还原峰的峰电流越来越大。说明加入木糖醇、胶体石墨粉后，酶墨水的导电性逐渐增强。因此，为保证酶墨水的性能，在后续酶墨水的制备过程中，在聚乙二醇水和壳聚糖-醋酸混合溶液中依次加入木糖醇和胶体石墨粉。
胶体石墨粉具有优质天然石墨的性能，在高温条件下具有特殊的抗氧化性、自润滑性和可塑性，同时具有良好的导电、导热和附着性。在酶墨水中添加胶体石墨粉既可以在保持酶活性的同时提高酶墨水导电性，也可以增加酶墨水干燥后所获得的检测活性界面的机械强度。
④在混合物中进一步添加0.0202g的甲基绿，加速电子传递降低传感器的过氧化电位，得到具有生物相容性的导电墨水(添加甲基绿后对酶墨水导电性的改善如图6所示)。
将不含甲基绿的墨水和含有甲基绿的墨水分别滴涂在两个已经进行预处理的SPE的工作电极上，使其自然晾干，将两个SPE各自置于铁氰化钾-氯化钾溶液中，采用循环伏安法表征滴涂墨水后SPE的电化学性能，从图中可以看出，滴涂不含甲基绿的墨水、含有甲基绿的墨水的SPE的氧化峰的峰电流分别为44.08μA、59.85μA，氧化还原峰的峰间距分别为0.198V、0.146V，滴涂含有甲基绿的墨水的SPE得到的氧化峰的峰电流更大，峰间距更小，说明甲基绿可以作为电子媒介体有效促进电子传递，从而有助于提高生物传感器的电化学性能。
⑤制备银纳米颗粒(银纳米颗粒的表征如图2所示)，并与乙酰胆碱酯酶偶联。图2为银纳米颗粒的TEM图，通过对图中银纳米的尺寸进行统计，得出银纳米颗粒的粒径范围为10～20nm。图3为银纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱图，银纳米原液在395nm处有明显的吸收峰，说明成功制备出银纳米颗粒，离心后的银纳米在398nm处有明显的吸收峰，吸收峰的位置基本没变，说明离心清洗不会导致银纳米颗粒料的聚集，对银纳米颗粒的性质没有影响。
⑥将偶联后的溶液用台式高速离心机在12000rpm下离心30min，倒掉上清液，保留沉淀，再将得到的沉淀物加入到50μL制备好的具有生物相容性的导电墨水中，得到酶墨水。获得的酶墨水使用前4℃保存备用。
⑦溶液都用去离子水配置，每步操作都超声30min，确保获得各组分分散均匀的酶墨水，以便制备出表面平整光滑的可重复性电化学生物传感界面。
对本发明的酶墨水粘附力的表征如图8所示。由图8可以看出，将20μL墨水滴涂在滤纸上并自然晾干，反复对折50次后，墨水没有脱落，且滤纸上墨水的形貌也没有发生变化，说明墨水具有强粘附力。
实施例一：
制备酶墨水的具体步骤为：
①配置质量分数为60％的聚乙二醇水溶液，用0.1M的醋酸溶解壳聚糖，质量分数为1％，将获得的聚乙二醇水溶液和壳聚糖-醋酸溶液混合，调节二者的体积比为6:4，得到2mL的PEG/Chit混合物。
②在获得的PEG/Chit混合物中添加0.6086g的木糖醇作为稳定剂。
③在获得的混合物中彻底溶解0.8571g的胶体石墨粉。
④在混合物中进一步添加0.0202g的甲基绿，加速电子传递降低传感器的过氧化电位，得到具有生物相容性的导电墨水。
⑤制备银纳米颗粒，并与乙酰胆碱酯酶偶联。
银纳米颗粒(AgNPs)的具体制备方法如下：通过将壳聚糖(1.0g)溶解在乙酸(50mL，1.0wt％)溶液中来制备壳聚糖悬浮液。然后，在恒定搅拌下将AgNO3(50mL，0.01M)立即加入到悬浮液中2.0小时，以制备在壳聚糖悬浮液中的AgNO3。将NaBH4(20mL，0.04M)加入到AgNO3/Cts悬浮液中，立即从浅黄色变为棕色，表明形成了AgNPs。将该悬浮液再搅拌1.0小时，得到银纳米颗粒。
取5mL的银纳米用高速冷冻离心机在12000rpm下离心30min，倒掉上清液，保留银纳米颗粒沉淀。取125μL的100U/mL的乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液，加入到875μL的pH值为7.5的0.02M的磷酸盐缓冲液中，得到12.5U/mL的酶液。将离心后的银纳米颗粒与得到的酶液在离心管中均匀混合，置于恒温摇床在180r/min、37℃下使其偶联20min。
⑥将偶联后的溶液用台式高速离心机在12000rpm下离心30min，倒掉上清液，保留沉淀，再将得到的沉淀物加入到50μL制备好的具有生物相容性的导电墨水中，得到酶墨水。获得的酶墨水使用前4℃保存备用(未偶联的酶墨水的制备即将乙酰胆碱酯酶和银纳米简单混合后加入到制备好的具有生物相容性的导电墨水中)。
⑦溶液都用去离子水配置，每步操作都磁力搅拌30min、超声30min，确保获得各组分分散均匀的酶墨水，以便制备出表面平整光滑的可重复性电化学生物传感界面。
乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备
将制备好的酶墨水滴涂1.5μL(含0.375U的乙酰胆碱酯酶)在进行过预处理的丝网印刷电极的工作电极上，晾干后即制备成生物传感器。滴涂后的丝网印刷电极4℃保存备用。
同理，未偶联的酶墨水制备成另一生物传感器。
乙酰胆碱酯酶生物传感器在氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)中的测量
将制备好的电极置于浓度为0.5mM氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)溶液中，采用循环伏安法以ATCl溶液为底物对乙酰胆碱酯酶生物传感器的电化学性能进行测试，扫描电压为－0.2～1.0V，扫速为100mV/s，扫描结束后，用pH值为7.6的0.1M的磷酸盐缓冲液对电极进行冲洗。
同理，依次将电极置于浓度为1mM、2mM、3mM的氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)溶液中，进行循环伏安扫描，得到乙酰胆碱酯酶生物传感器对不同浓度底物氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)的CV图，具体见图9中的检测结果。由图9可以看出，随着底物ATCl浓度的增加，氧化峰的峰电流逐渐增加，说明酶墨水中固定的乙酰胆碱酯酶具有很高的生活性能快速催化ATCl的水解，所制备的乙酰胆碱酯酶生物传感器电化学性能良好，有望实现有机磷农残的即时检测。
同理，将未偶联的酶墨水制备成的生物传感器置于2mM的氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)溶液中，进行循环伏安扫描，得到其对2mM底物氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)的CV图，将其与偶联后的结果进行比较，如图7所示。由图7可以看出，未进行偶联的墨水所得到的CV图中没有明显的氧化峰，而偶联后的墨水所得到的CV图中有明显的氧化峰，且氧化峰的电流达到了69.48μA，说明偶联后，银纳米颗粒的偶联既能实现乙酰胆碱酯酶的固定同时有助于保持其生物活性，快速催化ATCl的水解，而未进行偶联的墨水中的乙酰胆碱酯酶的活性较低。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (10)
1.一种酶墨水，其特征在于，含有导电墨水；
所述的导电墨水中分散有银纳米颗粒，所述的银纳米颗粒上偶联生物酶；
银纳米颗粒的粒径范围为10～20nm；银纳米颗粒的含量为45mg/mL；
所述的导电墨水中含有聚乙二醇、壳聚糖、胶体石墨粉和木糖醇。
2.根据权利要求1所述的酶墨水，其特征在于，在所述的酶墨水中：
木糖醇的浓度为2M，聚乙二醇的质量分数为36％，壳聚糖的质量分数为0.4％，胶体石墨粉的质量分数为30％。
3.根据权利要求1或2所述的酶墨水，其特征在于，所述的生物酶选自乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和多酚氧化酶。
4.一种酶墨水的制备方法，其特征在于，所述的酶墨水为权利要求1-3任一所述的酶墨水；
制备方法包括：制备导电墨水，将银纳米颗粒与生物酶偶联后加入到导电墨水中分散即得。
5.根据权利要求4所述的酶墨水的制备方法，其特征在于，所述的导电墨水的制备包括：
配置质量分数为60％的聚乙二醇水溶液，0.1M的醋酸溶解壳聚糖获得质量分数为1％的壳聚糖-醋酸溶液，以体积比为6:4混合聚乙二醇水溶液和壳聚糖-醋酸溶液，得到PEG/Chit混合物；
2mL的PEG/Chit混合物中依次添加0.6086g木糖醇、0.8571g胶体石墨粉和0.0202g甲基绿，得到导电墨水。
6.根据权利要求4或5所述的酶墨水的制备方法，其特征在于，银纳米颗粒与生物酶偶联的方法包括：
2.25mg的银纳米颗粒和12.5U的生物酶混合，于180r/min及37℃下偶联20min。
7.根据权利要求4或5所述的酶墨水的制备方法，其特征在于，所述的生物酶为乙酰胆碱酯酶，银纳米颗粒与乙酰胆碱酯酶偶联的方法包括：
125μL的100U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，加入到875μL的pH值为7.5的0.02M的磷酸盐缓冲液中，得到12.5U/mL的生物酶溶液；5mL 0.45mg/mL的银纳米颗粒溶液与得到的生物酶溶液于180r/min及37℃下偶联20min。
8.根据权利要求4或5所述的酶墨水的制备方法，其特征在于，所述的银纳米颗粒的制备方法如下：
1.0g壳聚糖溶解在50mL1.0wt％的乙酸溶液中制备壳聚糖悬浮液；
50mL0.01M的AgNO3溶液加入到壳聚糖悬浮液中得到AgNO3/Cts悬浮液；
20mL 0.04M的NaBH4溶液加入到AgNO3/Cts悬浮液中搅拌即得。
9.权利要求1-3任一权利要求所述的酶墨水用于制备生物传感器的应用。
10.一种生物传感器，包括丝网印刷电极，其特征在于，在所述丝网印刷电极的工作电极上涂有权利要求1-3任一所述的酶墨水。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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