CN102770195A - 高亲和性化合物结合常数的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及所关注的化合物与蛋白质的结合常数的测定方法，其包括下列步骤：a)将高亲和性化合物加入到双室系统中，其中两个室通过半透膜隔离开，所述的半透膜可渗透所关注的化合物；和测定在达到分布平衡后所关注的高亲和性化合物在所述室之一中的量；b)将浸入化合物加入到所述室之一中，其中浸入化合物不能透过膜，和在达到分布平衡后测定所关注的高亲和性化合物与浸入化合物的测定分配系数；c)将非特异性蛋白质加入到另一室中，其中非特异性蛋白质不能透过膜，和在达到分布平衡后在浸入化合物的存在下测定所关注的化合物与非特异性蛋白质的分配系数；和d)使用步骤b)和c)的分配系数测定测试化合物的结合常数。

Description

高亲和性化合物结合常数的测定方法

化合物作为药物的成功不仅依赖于其功效，而且依赖于药物规格、药物相互作用、安全性、药代动力学与生产成本之间的最佳平衡。

在化合物可以有对受体有效前，其释放、吸收和分布具有相当的影响。仅游离的药物(未结合)可以对受体有效。如果药物与蛋白质结合过强，则其药理学响应强度可能降低，且它还可以对药物的分布体积、代谢和消除产生影响。

通过高流通量-ADME筛选(A＝吸收，D＝分布，M＝代谢，E＝排泄)使体外数据集的生成最大化是必要的，以得到化学家对发现具有最佳生化性质的物质的反馈，并理解化学结构与生化参数之间的相关性。

已知用于测定蛋白质结合的方法是，例如平衡透析。该方法的起点在于两个室即样品室和蛋白质室，它们被半透膜隔离。选择膜的MWCO，使得测试物质能够透过，但截留大分子(例如蛋白质)。将已知浓度和体积的测试物质置于样品室内。然后将已知浓度的蛋白质以与样品室内的物质之一等同的体积置于蛋白质室内。当测试物质扩散透过膜时，一些结合蛋白质，一些将保持在溶液中游离。相互作用的亲和性越低，则测试物质在任意时间保持未结合的浓度越高。测试物质扩散通过膜并且结合测试物质持续至达到平衡为止。在平衡时，测试化合物在溶液中游离的浓度在两个室内相同。然而，在蛋白质室内，测试物质的总浓度因结合测试物质而较高(条件是测试化合物结合蛋白质)。样品室内游离测试物质的浓度然后可以用于测定测试化合物的结合特性。

另一种方法在于使用BIAcore技术，其中结合配偶体之一固定在传感器芯片上。另一结合配偶体流过置于微量吸收池中的芯片。结合的检测依赖于“表面等离激元”(SPR)现象，即当芯片表面结合蛋白质或其他分子时出现来自金属芯片的单色光反射的小改变。

然而，所有这些方法并不适合于在高流通量测定中测定高亲和性物质的蛋白质结合能力，因为它不能在使用高流通量物质的99％-99.99％结合率之间区分。原因在于最终分析的游离测试物质的浓度过低而不能被定量。

使用高亲和性药物，结合物质的量的小的改变可能对体内的游离部分产生显著影响(参见下表)，由此对效果和副作用产生影响。因此，在这种极宽范围内进行测定具有高度重要性。

具有4％差异的实例：

99％→95％结合    1％游离→5％游离      因子5

80％→76％结合    20％游离→24％游离    因子1.2

因此，本发明提供了所关注的高亲和性化合物与蛋白质的结合常数的测定方法，包含下列步骤：

a)将高亲和性化合物加入到两-室系统中，其中两室被可透过所关注的化合物的膜隔离开，和

在达到分布平衡后测定所述室之一内所关注的高亲和性化合物的量；

b)将浸入化合物加入到所述室之一(浸入室)中，其中浸入化合物不能透过膜，和

在达到分布平衡后测定所关注的化合物与浸入化合物的分配系数；

c)将非特异性蛋白质加入到另一室(蛋白质室)中，其中非特异性蛋白质不能透过膜，和

在达到分布平衡后在浸入化合物的存在下测定所关注的化合物与非特异性蛋白质的分配系数；和

d)测定具有步骤b)和c)的分配系数的测试化合物的结合常数。

步骤a)、b)和步骤c)可以连续进行，或它们可以平行进行(参见图3)。

因此，本发明还提供了所关注的高亲和性化合物与蛋白质的结合常数的测定方法，包含下列步骤：

a)提供平行性能的两-室系统，其中每一系统的两室被可透过所关注的化合物的膜隔离开，并且将高亲和性化合物加入到两-室系统中，和

在达到分布平衡后测定所述室之一内所关注的高亲和性化合物的量；

b)将高亲和性化合物和浸入化合物加入到第二个室系统的室之一(浸入室)中，其中浸入化合物不能透过膜，和

在达到分布平衡后测定所关注的化合物与浸入化合物的分配系数；

c)将高亲和性化合物和浸入化合物加入到第三个室系统的室之一(浸入室)中，并且将非特异性蛋白质加入到另一室(蛋白质室)中，其中非特异性蛋白质不能透过膜，和

在达到分布平衡后在浸入化合物的存在下测定所关注的化合物与非特异性蛋白质的分配系数，和

d)测定具有步骤b)和c)分配系数的测试化合物的结合常数，

其中步骤a)、b)和c)平行进行。

此外，本申请提供了浸入化合物在测定高亲和性测试化合物的结合常数中的用途。

浸入化合物是一种物质，其显著降低高亲和性测试物质与非特异性蛋白质的亲和性。显著降低亲和性指的是在浸入化合物的存在下和其不存在结合的测试物质与非特异性蛋白质的量之差具有统计学相关性(p≤0.05，优选p≤0.01)。为了避免浸入化合物通过膜，而允许测试化合物通过它，浸入化合物的大小优选大于测试化合物大小2倍。优选浸入化合物是配位剂。更优选浸入化合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，最优选浸入化合物是聚乙烯吡咯烷酮K-25(PVP 25，PVP K-25)。就上述举出的方法的目的而言，可以使用浸入化合物的组合，例如PVP和环糊精。

本文所用的术语“高亲和性化合物”是指在生理条件下和血浆蛋白(例如清蛋白)剩余物的存在下总量的至少95％结合所述血浆蛋白的化合物(＝所述化合物总量的至多5％是游离形式)。优选至少97％是结合的，更优选至少98％且最优选至少99％以结合形式存在。将生理条件定义为pH 7.0和37℃。就本发明而言，高亲和性化合物或测试化合物优选是药物。

本文所用的术语“测试物质”或″测试化合物″是指高亲和性化合物。

术语“结合常数”是指描述平衡状态下两种分子之间的结合亲和性的常数。它描述游离与结合的测试物质之间的平衡状态。

本文所用的术语“结合的物质”或“结合的化合物”是指结合蛋白质(特别是非特异性蛋白质)或浸入化合物的物质或化合物。术语“分数占据率”是指结合的测试化合物的部分。换句话说，它是平衡状态下结合浸入化合物的测试化合物的量(c_{结合的测试物质})与测试化合物总量(c_{总测试物质})之比。

与特异性蛋白质相反，非特异性蛋白质结合广泛的化合物(非选择性结合)。非特异性蛋白质特别是血浆蛋白，例如血清清蛋白和α1酸性糖蛋白。优选非特异性蛋白质是人血清清蛋白(HSA)。

用于本发明方法的膜是半透膜。半透膜是允许选择的分子种类通过扩散通过它的膜。高亲和性化合物(和缓冲液)可以通过用于上述举出的测定中的半透膜，而浸入化合物或非特异性蛋白质不能。优选半透膜是大小选择性膜。

半透膜的特征在于分子量截止值(MWCO)。优选MWCO约为浸入化合物或非特异性蛋白质分子量的一半，无论哪一种较小。还优选测试物质与浸入化合物或非特异性蛋白质的分子量之比为22∶27，无论哪一种较小。更优选该比例比值约为25。用于本发明方法的适合的膜是商购的，例如透析膜。

优选用于测定的非特异性蛋白质的浓度相当于体内蛋白质的浓度。就HAS而言，生理浓度约为60mM。

可以使用不同浓度的浸入化合物(即顺序稀释)实施本发明的方法来测定用于本发明方法最适操作的浸入化合物浓度。

在两室系统中进行测定，其中两个室被半透膜隔离开。选择膜的渗透性，使得测试物质可以通过该膜，而浸入化合物和非特异性蛋白质都不能通过该膜。

可以平行(参见图3)或连续进行本发明方法的测定(步骤a)、b)和步骤c)。优选平行进行测定。在下文中描述了一种优选的实施方案：就上述方法)的参比实验(步骤a)而言，将所关注的化合物加入到室之一中(参见图2B)并且在分布达到平衡后在该系统中测定化合物的分布，其中在分布达到平衡后测定至少一个室的化合物质量。

就上述方法)的结合实验1(步骤b)而言，将所关注的化合物和浸入化合物加入到不同的两室系统中的室中，然后用于进行参比实验(还参见图2B)。在结合系统达到平衡后，测定不含浸入化合物的室(蛋白质室)内的高亲和性化合物的量并且测定所关注的化合物与浸入化合物的分配系数。

就上述方法)的结合实验2(步骤d))而言，将所关注的化合物和浸入化合物加入到不同的两室系统中的室(浸入室)中，然后用于进行参比或结合实验(参见图2C)并且将非特异性蛋白质加入到不含浸入化合物的室(蛋白质室)中。在达到平衡后，测定游离测试物质(没有与浸入化合物结合)的量，并测定所关注的化合物在浸入化合物存在下与非特异性蛋白质的分配系数。

如下测定高亲和性化合物的结合常数：

测试化合物与非特异性蛋白质的结合是一个可逆过程，其可以描述为如下平衡(Lindup，W.E.，Plasma protein binding of drugs-some basic andclinical aspects，in Progress in Drug Metabolism，L.F.C.J.W.Bridges，G.G.Gibson，Editor.1987.p.141-185)

$\left[T_u\right]+\left[P\right]\begin{array}{c}\←\\ \→\end{array}[T\·P]$

$K_p=\frac{[T\·P]}{\left[T_u\right]*\left[P\right]}$

[P]＝非特异性蛋白质的浓度

[T_u]＝未结合非特异性蛋白质的测试化合物浓度

K_P＝测试化合物与非特异性蛋白质的结合常数

[T·P]＝当达到平衡时结合非特异性蛋白质的测试化合物浓度

可以使用来源于质量定律的如下公式将结合常数K_P转化成未结合的的分数f_u：

$f_u=1-f_b=\frac{100}{1+K_P*\left[P\right]}---\left(1\right)$

f_b＝结合非特异性蛋白质的测试化合物分数

在浸入化合物(DC_P’)(3)的存在下，与非特异性蛋白质的结合常数(K_P)(2)可以从与浸入化合物的分配系数(DC_浸入)(3)和与非特异性蛋白质的分配系数的组合进行计算。

K_P＝DC_浸入＊DC_P’    (2)

从结合研究I中(使用浸入化合物，图2B)：

m_T(参比)＝无浸入化合物和没有非特异性蛋白质存在下平衡中的测试化合物质量(室之一中测定的)

m_Tu(浸入)＝浸入化合物的存在下平衡中的未结合的测试化合物质量

从结合研究II中(使用浸入化合物和高亲和性化合物的系统，图2C)：

[T-P’]＝浸入化合物的存在下结合非特异性蛋白质的测试化合物浓度

[T-浸入]＝结合浸入化合物的测试化合物浓度

m_Tb(P’)＝在使用浸入化合物和非特异性蛋白质的系统中，平衡中结合非特异性蛋白质的测试化合物的质量

m_Tu(P’)＝在使用浸入化合物和非特异性蛋白质的系统中，平衡中未结合非特异性蛋白质的测试化合物的质量

V_总计是透析室中的总体积(例如200μl)

V_P是非特异性蛋白质体积

V_浸入是浸入化合物体积

可以根据所施用的材料的密度和质量计算体积

V＝质量/密度(例如人血清清蛋白密度：ρ_HSA＝1.4g/cm³，PVP25的密度：ρ_PVP＝1.2g/cm³)。

使用分光光度计直接或在使用HPLC系统分离后测定游离和/或结合的测试物质的量。

就全部参比和结合实验而言。优选在室温和常压下温育室系统(例如过夜(约12小时))。为了加速平衡，可以振摇室(优选约1-3小时，更优选1-2小时，最优选约1小时)。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法优选在包含多个两室系统的培养板中平行进行。这些平行进行的测定是相同的或它们可以不同，例如在高亲和性化合物身份或浓度方面。

由于目前一般性地描述了本发明，所以通过参照具体实施例将会更好地理解它们，除非另有指定，否则本文包括这些具体实施例结合下列的附图仅为了示例目的，而不预以起限定作用。

附图：

图1显示10个Teflon^TM棒组成的透析室系统，其中8个Teflon^TM棒在每一位置上具有12个钻孔且2个在一侧上具有12个钻孔(图1A)。所述钻孔具有半圆柱体形式(参见图1B)，使得2个棒一起形成一排12个圆柱孔(A排至I排)。Teflon^TM棒之间插入半透膜(M)，使得每个圆柱孔被分成两个半圆柱体室。具有膜的10个Teflon^TM棒组装成两个不锈钢连杆(R)。

图2显示测定过程中的透析室系统。室包含两个被膜M隔离开的室(室1，室2)。大小选择性膜M隔离开了两个室并且可透过测试化合物，但不能透过浸入化合物或非特异性蛋白质。测试化合物：

非特异性蛋白质：

浸入化合物：

圆圈室数表示从其中采样用于测定的室。图2A)显示在参比条件下室系统中情况的图解表示，其中测试化合物均匀分布在室系统中。图2B)显示使用测试化合物和浸入化合物在室系统中情况的图解表示。将测试化合物和浸入化合物加入到室1中并且影响测试化合物分布，因为仅未结合的测试化合物可以通过膜。图2C)显示使用测试化合物、浸入化合物和非特异性蛋白质的室系统中的情况的图解表示。将测试化合物和浸入化合物加入到室1中并且将非特异性蛋白质加入到室2中。浸入化合物减少了可利用于非特异性蛋白质的未结合的测试化合物的量。图2D)显示使用现有技术测定法的室系统中情况的图解表示。高百分比的测试化合物结合非特异性蛋白质。

图3显示在3个两-室系统中平行进行的本申请方法的图解表示。

图4显示β-羟丙基-环糊精(A)和聚乙烯吡咯烷酮单体(B)的化学结构。

图5显示测试化合物(华法林、双氯芬酸)与浸入化合物PVP 25的分数占据率和与浸入化合物组合(β-羟丙基-环糊精、PVP25)的分数占据率的比较。X-轴：以mM计的平衡中的结合的测试化合物浓度；y-轴：结合的测试化合物浓度。-■-华法林与PVP25；

双氯芬酸与PVP25；◆华法林与PVP 25和β-羟丙基环糊精(--线性)；▲双氯芬酸与PVP25和β-羟丙基环糊精；(·······线性)。

图6显示卡维他洛与浸入化合物(β-羟丙基-环糊精，PVP25)组合的分数占据率的图解表示：X-轴：以mM计的平衡中的未结合的卡维他洛浓度；y-轴：结合的测试化合物浓度。◆卡维他洛PVP 25与β-羟丙基环糊精。

图7显示测试化合物(双氯芬酸、华法林、卡维他洛、萘普生、吡罗昔康和格列苯脲)与浸入化合物PVP 25的分数占据率的图解表示。x-轴：以mM计的卡维他洛总浓度；y-轴：以％计的卡维他洛分数占据率(结合浸入化合物的测试化合物的量)。双氯芬酸与PVP25(…………线性)；·华法林与PVP(-·-线性)；▲卡维他洛与PVP 25(----线性)；×萘普生与PVP25(---线性)；*吡罗昔康与PVP25(——线性)；·格列苯脲与PVP25(…………线性)。

图8显示在人血清清蛋白(HSA)的存在下测试化合物(双氯芬酸、华法林、卡维他洛、萘普生、吡罗昔康和格列苯脲)与浸入化合物PVP 25的分数占据率的图解表示。x-轴：以mM计的卡维他洛总浓度；y-轴：以％计的卡维他洛分数占据率(结合浸入化合物的测试化合物的量)。双氯芬酸与PVP25(…………线性)；

华法林与PVP(线性)；▲卡维他洛与PVP 25(-·-线性)；×萘普生与PVP25(——线性)；*吡罗昔康与PVP25(-··-线性)；·格列苯脲与PVP25(---线性)。

图9显示PVP25的存在下氯丙嗪(A)、双氯芬酸(B)、吡罗昔康(C)、萘普生(D)、华法林(E)和格列苯脲(F)与HAS(■)和与PVP25(▲)的分配的图解表示。

图10显示使用本发明方法测定的结合常数与文献值对比的图解表示。

实施例：

除非另有指示，否则根据制造商的说明使用实施例中涉及的商购试剂。

实施例1：材料和方法

1.1透析室

可重复使用的96-孔微量-平衡透析装置HTD 96室用于下列实验。室系统由10个Teflon^TM棒组成，其中半透膜(参见1.2膜)各自置于2个Teflon^TM棒之间，形成每个孔的2个隔室。

将装配的Teflon^TM块插入钢架。为了确保各孔之间的密封，用钢板彼此压迫棒。所述钢板与Teflon^TM棒上的8个圆盘形弹簧施加对抗压力。

在每一实验前，通过用乙醇冲洗4次清洁Teflon^TM棒。

1.2膜

●MWCO

测试下列MWCO对添加剂的依赖性：

●膜材料

A)具有6-8kDa的MWCO(HTDialysis，LLC，目录号1103)和12-14kDa的MWCO(HTDialysis，LLC，Catalog Nr 1101)的HTD 96透析膜条(再生纤维素)。

用去离子水将上述举出的膜水化60分钟。然后用20％乙醇将它们处理20分钟，然后用去离子水冲洗2次。

B)具有1kDa的MWCO(光谱实验室，目录号：132640，45mm平面宽度/10m长度)和3.5kDa的MWCO(光谱实验室，目录号：132592，45mm平面宽度/10m长的Spektra/Por 6(再生纤维素)

除去重金属：

包含EDTA的重金清洁溶液(Spektrum，Cat.：132908)；1份的洗涤溶液+9份的蒸馏H₂O。

1h洗涤，然后5min在蒸馏H₂O中。

除去0.1％硫化物：

硫清洁溶液A(＝亚硫酸Na)和

B(＝0.4％硫酸)(Spektrum，Cat.：132906)。

在80℃，用包含2份蒸馏H₂O+1份溶液A的溶液洗涤膜。然后用60℃热H₂O将膜洗涤2min)。然后用包含100份水和4份溶液B的溶液洗涤膜，然后用蒸馏水将它们洗涤几分钟。

或者，使用预洗涤的膜。

C)Spektra/Por 7(再生纤维素)MWCO 3.5kDa(光谱实验室，目录号：132111，45mm平面宽度/5m长

用蒸馏水洗涤膜。

1.3浸入化合物

A)环糊精(图3)

环糊精的使用条件在于比用于确保浸入化合物从浸入室分离的膜的MWCO大。

使用下列环糊精：

●β-羟丙基-环糊精

●γ-环糊精。

B)聚乙烯吡咯烷酮PVP (图4)

PVP(Polyvidon、Povidon、Povidonum)，N-乙烯基吡咯烷酮的均聚物

通常将分子量表示为K值。分子量依赖于聚合等级(约2500-3’000’000道尔顿)。

使用具有Mr～24.000分子量的PVP 25(PVP K-25)、具有Mr～10.000分子量的和PVP 15(PVP K-15)进行实验。

1.4测试化合物

■华法林((RS)-4-羟基-3-(3-氧代-1-苯基丁基)-2H-色烯-2-酮)，

■呋塞米(4-氯-2-(呋喃-2-基甲氨基)-5-氨磺酰基苯甲酸)

■双氯芬酸(2-(2-(2，6-二氯苯基氨基)苯基)乙酸)

■维拉帕米(2-(3，4-二甲氧基苯基)-5-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基-甲基-氨基]-2-(1-甲基乙基)戊腈)

■氯丙嗪(3-(2-氯-10H-吩噻嗪-10-基)-N，N-二甲基-丙-1-胺)

■卡维地洛(3-(9H-咔唑-4-基氧基)-2-羟丙基][2-(2-甲氧基苯氧基)乙基]胺)

■萘普生((+)-(S)-2-(6-甲氧基萘-2-基)丙酸)

■吡罗昔康((8E)-8-[羟基-(吡啶-2-基氨基)亚甲基]-9-甲基-10，10-二氧代-10λ6-噻-9-氮杂双环[4.4.0]癸-1，3，5-三烯-7-酮)

■格列苯脲(5-氯-N-(4-[N-(环己基氨基甲酰基)氨磺酰基]苯乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺)

1.5：实验方法

1)制备膜(参见实施例2)和装配实施例1中的透析室。

2)蛋白质室(室2)充满缓冲液且加入其他赋形剂至最终体积约为100-150ul。重要的是在每一侧上的体积确切相同。

体积/室：

使用纯环糊精作为浸入化合物，每个室中的体积为147μl(γ-环糊精2.5％(m/V))

使用PVP和PVP与环糊精的组合作为浸入化合物，在室中的体积为100μl。(PVP 154％(m/V)、PVP 254％(m/V)、PVP 254％(m/V)+β-羟丙基-环糊精4％(m/V))

缓冲液：50mM TAPSO，pH 7.4，用NaCl等渗至154mM总浓度，根据赋形剂的不同添加不同的赋形剂。

测试化合物的终浓度：0.02mM-0.6mM

HAS的终浓度：60mM

DMSO的终浓度：6％(V/V)

在结束时加入DMSO储备溶液，因为花费较长的时间，且因膜干燥的风险而必需相对快地填充室。

3)全部移液步骤是自动的(Tecan)

4)为了防止蒸发，用粘性膜覆盖Teflon^TM装配物(目录号：1102；HT-透析)。

5)将室系统振摇1小时，然后温育过夜(约12小时)。因产热导致的高度蒸发的风险而应避免长期振摇。

6)在达到平衡后，将来自浸入室的样品(参比物，使用浸入化合物和HAS的结合研究II)或来自蛋白质室的样品(参比物，使用单独的浸入化合物的结合研究I)转至一半-面积UV-培养板并且使用光谱测定法分析(光谱最大值，190培养板读出器；250-500nm)或通过HPLC分析。

1.6测定数据的分析

可以使用结合研究计算分配系数和结合常数。

药物与HAS的结合是可逆过程，其可以描述为如下平衡[4]

其中方括号用于表示浓度，[D_u]、[HSA]和[D·HSA]分别是非HSA-结合的药物、HSA和HSA-结合的药物的浓度。

可以使用来源于质量定律的如下公式将结合常数K_HSA转化成未结合的分数f_u：

$f_u=\frac{100}{1+K_{\mathrm{HSA}}\·\left[\mathrm{HSA}\right]}---\left(1\right)$

与HAS的结合常数(K_HSA)(2)可以根据在PVP(DC_HSA′)(3)的存在下与PVP(DC_PVP)(3)和与HSA的分配系数进行计算。

K_HSA＝DC_PVP·DC_HSA′    (2)

从结合研究I中：

${\mathrm{VK}}_{\mathrm{PVP}}=\frac{[D-\mathrm{PVP}]}{\left[D_{u\left(\mathrm{PVP}\right)}\right]}=\frac{m_{D_{b\left(\mathrm{PVP}\right)}}}{m_{D_{u\left(\mathrm{PVP}\right)}}}\·\frac{V_{\mathrm{total}}-V_{\mathrm{PVP}}}{V_{\mathrm{PVP}}}=\frac{m_{D_{\mathrm{ref}}}-m_{D_{u\left(\mathrm{PVP}\right)}}}{m_{D_{u\left(\mathrm{PVP}\right)}}}---\left(3\right)$

从结合研究II中：

${\mathrm{VK}}_{{\mathrm{HSA}}^{\′}}=\frac{[D-{\mathrm{HSA}}^{\′}]}{\left[D_{u\left({\mathrm{HSA}}^{\′}\right)}\right]}=\frac{m_{D_{b\left({\mathrm{HSA}}^{\′}\right)}}}{m_{D_{u\left({\mathrm{HSA}}^{\′}\right)}}}\·\frac{V_{\mathrm{total}}-V_{\mathrm{HSA}}}{V_{\mathrm{HSA}}}=\frac{m_{D_{\mathrm{ref}}}-m_{D_{u\left({\mathrm{HSA}}^{\′}\right)}}}{m_{D_{u\left({\mathrm{HSA}}^{\′}\right)}}}---\left(4\right)$

其中[D-HSA′]和[D-PVP]分别是在PVP的存在下HSA-结合的药物和PVP-结合的药物。

V_总计是透析中室的总体积(200μl)且V_HSA和V_PVP是HSA和PVP 25的体积，其可以根据密度和称重的样品计算。

$V_{\mathrm{HSA}}=\frac{m_{\mathrm{HSA}}}{{\mathrm{\ρ}}_{\mathrm{HSA}}}$

ρ_HSA＝1.4g/cm³且ρ_PVP＝1.2g/cm³。为了测定密度，必须熔化PVP并且因包含空气而存在变异。因此，真实密度基于来自BASF(制造商)的信息。

上述举出的等式可以类似地应用于测定与另一种浸入化合物平衡中的未结合的/结合的测试化合物的浓度。

实施例2：β-羟丙基-环糊精与γ-环糊精的比较

结果如表1中所示。使用10％的β-羟丙基环糊精溶液可以结合30％以上的测试化合物。与γ-环糊精的亲和性显然低于与β-羟丙基-环糊精(需要2.5倍以上浓度的γ-环糊精以达到相同的分数占据率)。

表1：对华法林测定的赋形剂结合水平

实施例3：使用β-羟丙基-环糊精作为浸入化合物的测定

除非有特别的举出，否则测试条件如上所述。

膜：                        截止值：1kDa；Spektra/por 6

测试化合物浓度：            0.02mM-0.06mM

β-羟丙基-环糊精的浓度：    10％(m/V)

温育期限：                  过夜(约12h)

Tecan

总体积/孔或室：             294μl总体积

                            (每个室：147μl，参见上文)

DMSO-浓度：                 6％(V/V)

分析：                      Spektra最大值，50ul

测试物质	卡马西平	华法林	双氯芬酸	奎宁	头孢曲松
						分子量	236.27	308.33	296.15	324.4	554.6
平均结合[％]	31.3	26.9	23.1	21.6	14.2

表2：测试化合物与β-羟丙基-环糊精的平均结合

结论：测试化合物分子量越低，则与β-羟丙基-环糊精的亲和性越好。

实施例4：PVP 15与PVP 25的比较

除非有特别的举出，否则测试条件如上所述。

药物浓度：0.02-0.6mM

PVP 15和PVP25的量：各40g/l

测试物质	华法林	呋塞米	双氯芬酸	维拉帕米	氯丙嗪
						与PVP15的平均结合[％]	34.5	37.0	21.7	n.d.	17.0
与PVP25的平均结合[％]	51.4	49.4	46.4	13.1	n.d.

表3：测试化合物与PVP15和PVP25的平均结合(n.d.＝未测定)

测试物质对PVP 25具有的亲和性高于PVP 15。因此，使用PVP 25进行如下实施例的实验。

实施例5：PVP25和环糊精的组合作为浸入化合物的测定

用于移液的Tecan：

总体积/孔        100μl/孔

DMSO-浓度        6％(V/V)

分析             Spektra max，50ul

结果如图5和6中所示。β-羟丙基环糊精和PVP25的应用使平衡向药物和浸入化合物复合物方向的移动少于单独PVP 25的应用(参见图6)。

表4：对华法林测定的赋形剂结合水平的总结(包括来自实施例2和4的结果。

实施例6：使用PVP 25和人血清清蛋白(HSA)的测定

使用如与实施例5中所述相同的测试条件，除外使用测试化合物卡维他洛。结果如图8和图9中所示。

Tecan

透析期限      过夜(约12h)

分析          HPLC /程序：ATHESA

注射体积：    4μl

HPLC条件：

使用HPLC-系统(Agilent 1100)进行分析。使用RP柱(Chromolithflash，RP18e，4.6x25mm)进行分离。使用含有0.05％甲酸(A)和乙腈(B)的水梯度洗脱样品。梯度条件：起始5％B，0.4min 95％B；1min 95％B；1.1min5％B。

使用测试化合物和PVP的结果如图7中所示且使用测试化合物、PVP25和HSA的结果如图8和9中所示。

实施例7：与文献值的比较

将实施例6中测试化合物测定的结合水平(“新方法”)与使用常规方法测定的值(文献值)比较。结果如表2和图10中所示。

表5：来自文献和来源于实施例6的测试化合物的结合水平。

Claims (7)

1.所关注的化合物与蛋白质的结合常数的测定方法，其包括下列步骤：

a)将高亲和性化合物加入到两-室系统中，其中两室被可透过所关注的化合物的半透膜隔离开，和

在达到分布平衡后测定所述室之一内所关注的高亲和性化合物的量；

b)将浸入化合物加入到所述室之一中，其中浸入化合物不能透过膜，和在达到分布平衡后测定所关注的化合物与浸入化合物的分配系数；

c)将非特异性蛋白质加入到另一室中，其中非特异性蛋白质不能透过膜，

和

在达到分布平衡后在浸入化合物的存在下测定所关注的化合物与非特异性蛋白质的分配系数；和

d)使用步骤b)和c)的分配系数测定测试化合物的结合常数。

2.根据权利要求1的方法，其中滤膜是大小选择性膜。

3.根据权利要求1或2的方法，其中浸入化合物是PVP或环糊精。

4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中浸入化合物是PVP25。

5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中蛋白质是血浆蛋白。

6.根据权利要求5任一项的方法，其中血浆蛋白是血清清蛋白。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中步骤a)、b)和c)平行进行。

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