CN110812450A

CN110812450A - 金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用

Info

Publication number: CN110812450A
Application number: CN201911218279.XA
Authority: CN
Inventors: 李菲; 龚其海; 刘波; 石京山
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明提供了金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用，属于医药技术领域。金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用。以大鼠双侧侧脑室注射链脲佐菌素(STZ)制备脑内胰岛素信号损伤模型为对象，采用金钗石斛总生物碱处理后，p‑IR水平显著升高，p‑IRS‑1和p‑Akt水平则明显下降。可见金钗石斛总生物碱可以通过调节脑内胰岛素信号通路中关键蛋白的磷酸化水平实现对脑内胰岛素信号转导的调节作用，进而用于神经退行性疾病的防治。

Description

金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用。

背景技术

近年研究发现，除了肝脏、骨骼肌和脂肪等外周组织，脑也是胰岛素的重要靶器官。中枢胰岛素信号系统不仅参与能量代谢及体重变化，还与摄食行为、神经内分泌、记忆功能等有关，调节神经元存活、促进突触形成及神经环路的发展。胰岛素受体在脑内广泛而又选择性的分布在嗅球、下丘脑、海马、小脑及大脑皮层等部位。脑内胰岛素信号紊乱则损伤神经元功能、损伤突触发生，是情绪异常、认知障碍和神经退行性病变的重要机制。胰岛素与其受体结合后可通过胰岛素底物(IRS)激活下游PI3K/Akt信号，而PI3K/Akt信号下游有多个靶分子，又有各自的下游靶分子，如mTORC1，GSK3β和FoxO转录因子家族等。在大脑正常功能及病理状态中均发挥重要作用。mTORC1介导蛋白合成、促进突触可塑性并调节自噬清除神经元内错误折叠的蛋白质及受损的细胞器；GSK3β调节神经元的多种功能，如神经祖细胞增殖、神经元极化、神经可塑性、tau蛋白磷酸化等功能。通过侧脑室或脑实质给予胰岛素可缓解部分神经退行性疾病的症状，但这种给药方式不仅技术要求高，并且给病人造成损伤，不易被接受。因此，能通过简便易行的给药方式以达到激活脑内胰岛素信号的调节剂是目前维持正常脑内胰岛素信号的研究重点及目标。

我国医学中不乏养生保健、延年益智等中草药，其中金钗石斛作为滋补、镇痛、抗炎、退热等良药在我国使用了数百年，因而被称为“神仙草”。公元前28世纪，“神农”在《本草》中记录了石斛属植物的药用特征，现在药学技术发现石斛含有多种生物学活性成分，包括生物碱、香豆素、菲、多糖、倍半萜类等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供金钗石斛总生物碱的新应用。

本发明提供了金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用。

本发明提供了金钗石斛总生物碱在制备调节脑内胰岛素信号通路蛋白的表达水平和/或磷酸化程度的药物中的应用。

优选的，所述脑内胰岛素信号通路蛋白包括胰岛素受体、胰岛素底物1和/或蛋白激酶Akt。

本发明提供了金钗石斛总生物碱在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

优选的，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病。

优选的，所述金钗石斛总生物碱的制备方法，包括以下步骤：

1)以体积质量百分含量的90％乙醇水溶液浸泡金钗石斛的干茎，然后加热煮沸，得到醇提液；

2)将所述醇提液减压浓缩至无醇后，得到的浓缩膏用以体积浓度5％盐酸水溶液溶解，抽滤，得到的酸水溶液用石油醚萃取，脱脂，得到脱脂液调整pH值至10，得到碱水液；

3)将所述碱水液经三氯甲烷萃取2～3次，回收溶剂，得到生物碱粗提物；

4)将所述生物碱粗提物用氯仿-甲醇溶液溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得金钗石斛总生物碱。

优选的，步骤1)中金钗石斛的干茎的质量和乙醇水溶液的体积比为1g∶9～12mL。

优选的，步骤4)中所述氯仿-甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比为1∶1。

优选的，所述金钗石斛总生物碱的质量百分含量≥73.2％。

优选的，所述金钗石斛总生物碱包括石斛碱；

所述石斛碱的质量百分含量≥61.6％。

本发明提供了金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用。本发明采用大鼠双侧侧脑室注射链脲佐菌素(STZ)制备脑内胰岛素信号损伤模型，检测在金钗石斛总生物碱(DNLA)的干预下大鼠海马组织胰岛素信号通路关键蛋白胰岛素受体(IR)、胰岛素底物1(IRS-1)、蛋白激酶Akt等蛋白表达水平及磷酸化程度的变化情况，结果表明：与空白大鼠相比，模型组(STZ)大鼠海马组织的IR在Y1361位点磷酸化水平显著下降，而IRS-1的Ser616位点和Akt的Ser473位点磷酸化水平则显著上升；给予金钗石斛总生物碱(DNLA)后上述蛋白磷酸化程度有所改善，尤其是DNLA 40mg/kg组，与STZ大鼠相比，p-IR水平显著升高，p-IRS-1和p-Akt水平则明显下降。而IR、IRS-1和Akt的总蛋白表达水平在各组间没有明显改变。由此可见，DNLA通过调节脑内胰岛素信号通路中关键蛋白的磷酸化水平实现对脑内胰岛素信号转导的调节作用，进而用于神经退行性疾病的防治。

附图说明

图1为DNLA对STZ大鼠海马胰岛素信号通路的影响(mean±SEM)。

具体实施方式

本发明提供了金钗石斛总生物碱在制备调节脑内胰岛素信号通路蛋白的表达水平和/或磷酸化程度的药物中的应用。所述脑内胰岛素信号通路蛋白优选包括胰岛素受体、胰岛素底物1和/或蛋白激酶。

本发明提供了金钗石斛总生物碱在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。所述神经退行性疾包括阿尔茨海默病。

本发明所述金钗石斛总生物碱的来源没有没有特殊限制，采用本领域所熟知的金钗总生物碱即可，例如贵州省道地药材赤水金钗石斛。所述金钗石斛总生物碱的制备方法，优选包括以下步骤：1)以体积质量百分含量的90％乙醇水溶液浸泡金钗石斛的干茎，然后加热煮沸，得到醇提液；2)将所述醇提液减压浓缩至无醇后，得到的浓缩膏用以体积浓度5％盐酸水溶液溶解，抽滤，得到的酸水溶液用石油醚萃取，脱脂，得到脱脂液调整pH值至10，得到碱水液；3)将所述碱水液经三氯甲烷萃取2～3次，回收溶剂，得到生物碱粗提物；4)将所述生物碱粗提物用氯仿-甲醇溶液溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得金钗石斛总生物碱。

本发明以体积质量百分含量的90％乙醇水溶液浸泡金钗石斛的干茎，然后加热煮沸，得到醇提液。

本发明所述金钗石斛的干茎的来没有特殊限制，采用本领域所熟知的金钗石斛的干茎即可。在本发明实施例中，所述金钗石斛的干茎从赤水市信天中药产业开发有限公司购得。

在本发明中，所述金钗石斛的干茎的质量和乙醇水溶液的体积比优选为1g∶9～12mL，更优选为1g∶10mL。所述浸泡的时间优选为10～15h，更优选为12～14h，最优选为13h。所述煮沸的时间优选为2h。所述煮沸的次数优选为3～4次。

得到醇提液后，本发明将所述醇提液减压浓缩至无醇后，得到的浓缩膏用以体积浓度5％盐酸水溶液溶解，抽滤，得到的酸水溶液用石油醚萃取，脱脂，得到脱脂液调整pH值至10，得到碱水液。

本发明对所述减压浓缩的参数没有特殊限制，采用本领域常规方法除去乙醇即可。所述盐酸水溶液的用量没有特殊限制，能够实现溶解所述浓缩膏即可。调整pH值用溶液优选为氨水。

本发明将所述碱水液经三氯甲烷萃取2～3次，回收溶剂，得到生物碱粗提物。

得到生物碱粗提物，本发明将所述生物碱粗提物用氯仿-甲醇溶液溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得金钗石斛总生物碱。

在本发明中，所述氯仿-甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比优选为1∶1。所述冷冻干燥的温度优选为-45～-50℃。

在本发明中，采用上述制备方法制备得到的金钗石斛总生物碱，所述金钗石斛总生物碱的质量百分含量优选≥73.2％。所述金钗石斛总生物碱优选包括石斛碱；所述石斛碱的质量百分含量优选≥61.6％。

在本发明中，所述金钗石斛总生物碱的用量为20～40mg/kg。

下面结合实施例对本发明提供的金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

金钗石斛总生物碱(DNLA)的提取方法

金钗石斛的干燥干茎(GS20111213GP-1)均从赤水市信天中药产业开发有限公司购得。

提取方法为：金钗石斛的干燥干茎药材以90％乙醇水溶液10倍量浸泡12h，然后加热煮沸2h，连续3次。醇提液减压浓缩至无醇味后以5％盐酸水溶液溶解、抽滤，酸水溶液经石油醚萃取多次，脱脂，浓氨水碱化至pH值为10，碱水液经三氯甲烷萃取2次，回收溶剂，即得生物碱粗提物。将生物碱粗提物用氯仿-甲醇溶液(1∶1，v/v)溶解，过LH-20凝胶柱，回收溶剂，冷冻干燥，得纯度较高的金钗石斛总生物碱。经GC检测其中总生物碱的含量73.2％，经改进的酸性染料比色法检测石斛碱的含量为61.6％。

实施例2

1.实验药品说明

链脲佐菌素(STZ，S0130)购自美国Sigma公司；抗体IR[C18C4](ab69508)、pY1361-IR(ab60946)购自abcam公司；IRS-1(2382)购自Cell signaling technology公司；pS616-IRS1(bs-12710R)购自北京博奥森生物技术有限公司；pS473-Akt(D155022)、Akt(D120056)购自Sangon Biotech公司；β-actin(60008-1)购自Proteintech Group公司。HRP标记的二抗购自北京索莱宝科技有限公司。

2.实验动物模型建立及分组

腹腔注射7％水合氯醛麻醉大鼠，固定于大鼠脑立体定位仪。侧脑室注射进针坐标：前囟后0.8mm，中线旁开1.5mm，颅骨下3.6mm。微量注射器缓慢注射3mg/kg STZ并留针5min，另一侧侧脑室同法操作。次日对大鼠进行分组并给药，分为空白对照组(Control)、空白+DNLA 40mg/kg组(Control+DNLA40)、模型组(STZ)、STZ+DNLA 20mg/kg(STZ+DNLA20)和DNLA 40mg/kg组(STZ+DNLA40)。给药组大鼠灌胃相应剂量的DNLA，对照大鼠给予等体积的溶媒1％吐温-80，每天1次连续28天。

3.海马胰岛素信号通路关键蛋白检测

采用Western blot方法检测。各组大鼠麻醉后断头取脑，冰上迅速分离双侧海马，-80℃冰箱保存。大鼠海马组织使用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，提取组织总蛋白；BCA法测定蛋白浓度；蛋白质热变性后经SDS-PAGE胶电泳分离、电转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭、相应的抗体行免疫反应，经ECL反应后采用Quantity One全自动凝胶成像分析系统进行曝光显影，并以β-actin为内参对目的条带灰度值进行分析。

结果如图1所示。图1为DNLA对STZ大鼠海马胰岛素信号通路的影响(mean±SEM)。由图1可知，与空白大鼠相比，STZ大鼠海马组织的IR在Y1361位点磷酸化水平显著下降[F(4，10)＝8.891，P＝0.002]，而IRS-1的Ser616位点和Akt的Ser473位点磷酸化水平则显著上升[p-IRS-1：F(4，10)＝9.143，P＝0.002；p-Akt：F(4，10)＝14.922，P＜0.001]；给予DNLA后上述蛋白磷酸化程度有所改善，尤其是DNLA40mg/kg组，与STZ大鼠相比p-IR水平显著升高(P＝0.017)，p-IRS-1(P＝0.014)和p-Akt水平则明显下降(DNLA20：P＝0.039；DNLA40：P＝0.001)。而IR，IRS-1和Akt的总蛋白表达水平在各组间没有明显改变。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.金钗石斛总生物碱在制备脑内胰岛素信号调节剂中的应用。

2.金钗石斛总生物碱在制备调节脑内胰岛素信号通路蛋白的表达水平和/或磷酸化程度的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脑内胰岛素信号通路蛋白包括胰岛素受体、胰岛素底物1和/或蛋白激酶。

4.金钗石斛总生物碱在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病。

6.根据权利要求1～5任意一项所述应用，其特征在于，所述金钗石斛总生物碱的制备方法，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤1)中金钗石斛的干茎的质量和乙醇水溶液的体积比为1g∶9～12mL。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤4)中所述氯仿-甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比为1∶1。

9.根据权利要求6～8任意一项所述的应用，其特征在于，所述金钗石斛总生物碱的质量百分含量≥73.2％。

10.根据权利要求6～8任意一项所述的应用，其特征在于，所述金钗石斛总生物碱包括石斛碱；

所述石斛碱的质量百分含量≥61.6％。