CN116172929A

CN116172929A - 美白组合物及其制备方法、应用

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Publication number: CN116172929A
Application number: CN202310291876.5A
Authority: CN
Inventors: 招敏聪; 郑倩楠; 彭博成; 贺锐; 解勇
Original assignee: Plant Doctor Guangdong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Plant Doctor Guangdong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-23
Filing date: 2023-03-23
Publication date: 2023-05-30

Abstract

本发明公开了一种美白组合物及其制备方法、应用，属于梳妆用的配制品领域。包括组分：火炭母提取物、番石榴叶提取物、线状阿司巴拉妥叶提取物、光果甘草提取物、积雪草苷、促渗剂。本发明提供的美白组合物为纯天然植物来源，满足消费者对于天然的喜好。本发明依靠植物提取物起到美白的效果；通过火炭母、番石榴叶、线状阿司巴拉妥和光果甘草的复配起到良好皮肤美白的效果；同时还具有一定的保湿、舒缓效果。

Description

美白组合物及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于梳妆用的配制品领域，具体涉及一种美白组合物及其制备方法、应用。

背景技术

黑色素(Melanin)主要由人体皮肤表皮基底层的黑色素细胞(Melanocyte)产生，它能减小紫外线对皮肤的伤害。黑色素的含量及分布决定了皮肤的颜色。然而，黑色素在基底层的异常蓄积会造成色素沉着过度引起黑斑病、雀斑、老年斑等，影响人们的生活质量。

相比对苯二酚衍生物、曲酸及其衍生物、传明酸等传统意义上的化学美白成分；由植物提取的活性成分作为化妆品美白添加剂，具有温和、持久、安全性高等特性，如黄酮类化合物，其中许多具有清除皮肤中自由基、促进皮肤新陈代谢、减少色素沉着、润泽肌肤等作用。许多提取植物提取物，如桑叶黄酮、甘草提取物、芦荟苦素、葛根黄酮类物质、槐豆黄酮类提取物，均通过抑制酪氨酸酶活性来控制黑色素的生成，可以达到美白的效果。

因此，对于植物提取物的美白效果开发是化妆品领域的热门研究内容之一。

发明内容

本发明提供了一种美白组合物及其制备方法、应用，通过植物提取的天然成分起到皮肤美白的作用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种美白组合物，以质量份计算包括以下组分：

火炭母提取物10

番石榴叶提取物 2-3

线状阿司巴拉妥叶提取物 6-10

光果甘草提取物 4.5-6

积雪草苷 1.2-2

促渗剂 0.5-1.2。

特别地，薄荷醇、异山梨醇酐二甲醚、氮酮中的至少一种。

特别地，所述火炭母提取物的制备方法为：取火炭母植株的成熟果实，洗净、粉碎；

60-85vol％乙醇回流提取2-3次，合并过滤提取液，减压浓缩至恒重，喷雾干燥；

乙醇的添加量为火炭母的8-10倍体积；每次提取时间为≥1h。

特别地，所述番石榴叶提取物的制备方法为：

选取新鲜番石榴叶，洗净、干燥、粉碎，得番石榴叶粉；

番石榴叶粉用60-85vol％乙醇回流提取2-3次，合并过滤提取液，减压浓缩至恒重，喷雾干燥；

乙醇的添加量为番石榴叶粉的8-10倍体积；每次提取时间为≥1h；

所述线状阿司巴拉妥叶提取物的制备方法为：

取晒干后的线状阿司巴拉妥叶，粉碎，60-85vol％乙醇回流提取2-3次，合并过滤提取液，减压浓缩至恒重，喷雾干燥；

乙醇的添加量为线状阿司巴拉妥叶的8-10倍体积；每次提取时间为≥1h。

特别地，所述番石榴叶粉和粉碎后的线状阿司巴拉妥叶在提取前先进行酶解。

特别地，所述酶解采用纤维素酶和果胶酶的复合酶液；其中纤维素酶的质量浓度为≥0.3mg/mL，果胶酶的质量浓度≥0.3mg/mL，酶解时间2-4h，酶解温度为45-55℃，pH4.5-6；酶解后于85-90℃下灭酶；灭酶后捞出固态物进行提取。

本发明还提供前述美白组合物在制备护肤品中的应用，具体为

一种驻留类皮肤外用剂，前述的美白组合物。

特别地，所述美白组合物的添加比例为≤5wt％。

特别地，驻留类皮肤外用剂还包括辅料，所述辅料选自增稠剂、乳化剂、皮肤调理剂、抗氧化剂、保湿剂、美白剂、pH调节剂和防腐剂中的一种或多种；

所述驻留类皮肤外用剂的剂型为乳液、凝胶或霜剂。

本发明中：

所述火炭母是指Persicariachinensis。

所述番石榴叶是指PSIDIUMGUAJAVA的叶子。

所述线状阿司巴拉妥是指ASPALATHUSLINEARIS的叶子，又名路易博士茶，rooibostea。

所述光果甘草是指GLYCYRRHIZAGLABRA；所述光果甘草提取物为GLYCYRRHIZAGLABRAEXTRACT。

本发明的成分具体分为三个不同的功能方向，其中促渗剂用于促进透皮吸收；在减少成分用量的同时以达到相同级别的效果；另外两个功能方向是美白和舒缓；虽然植物提取物内的黄酮类化合物相比于二酚衍生物、曲酸及其衍生物、传明酸等美白成分刺激性更低，但仍然会具有一定的刺激性；故需要添加积雪草苷作为舒缓成分。

火炭母在《广东省中药材标准》中具有清热利湿、凉血解毒的效果；但采用的部位是干燥全草；但由于火炭母植株具有一定的毒性，为了安全起见本发明采用的是火炭母的成熟可食用果实；经过研究发现，果实的果核部分具有较高的黄酮类成分含量，具有明显的抗氧化结果。

类似的，番石榴叶和线状阿司巴拉妥(路易博士茶)也具有较高的黄酮类成分含量；其中路易博士茶的的黄酮类成分主要为茶多酚。

光果甘草中含有明确美白作用的成分光甘草定(甘草黄酮)，同时还含有消炎、舒缓的效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明依靠植物提取物起到美白的效果；通过火炭母、番石榴叶、线状阿司巴拉妥和光果甘草的复配起到良好皮肤美白的效果；同时还具有一定的保湿、舒缓效果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，其中实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，不构成对本发明保护范围的限制。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

火炭母提取物的制备，包括以下步骤：

取火炭母植株的成熟果实，洗净、粉碎；乙醇水回流提取2-3次，合并过滤提取液，减压浓缩至恒重，喷雾干燥；

其中1号火炭母提取物采用60vol％乙醇水回流提取3次，每次1h；添加量为火炭母的8倍体积。

其中2号火炭母提取物采用85vol％乙醇水回流提取2次，每次1.5h；添加量为火炭母的10倍体积。

番石榴叶提取物的制备，包括以下步骤：

(1)选取新鲜番石榴叶，洗净、干燥、粉碎，得番石榴叶粉；

(2)复合酶液酶解，高温灭酶；

(3)乙醇水回流提取2-3次，合并过滤提取液，减压浓缩至恒重，喷雾干燥。

其中1号番石榴叶提取物的复合酶液中，纤维素酶的质量浓度为0.3mg/mL，果胶酶的质量浓度0.3mg/mL；酶解时间为2h，酶解pH为4.5，酶解纬度为55℃；酶解后90℃下灭酶，灭酶后捞出固态物进行提取；

采用60vol％乙醇水回流提取3次，每次1h；乙醇水添加量为番石榴叶粉的8倍体积。

其中2号番石榴叶提取物的复合酶液中，纤维素酶的质量浓度为0.3mg/mL，果胶酶的质量浓度0.3mg/mL；酶解时间为4h，酶解pH为6，酶解纬度为45℃；酶解后85℃下灭酶，灭酶后捞出固态物进行提取；

采用85vol％乙醇水回流提取2次，每次1.5h；添加量为火炭母的10倍体积。线状阿司巴拉妥叶提取物(路易博士茶提取物)的制备，包括以下步骤：

(1)选取取晒干后的线状阿司巴拉妥叶，粉碎，

(2)复合酶液酶解，高温灭酶；

其中1号线状阿司巴拉妥叶的复合酶液中，纤维素酶的质量浓度为0.3mg/mL，果胶酶的质量浓度0.3mg/mL；酶解时间为2h，酶解pH为4.5，酶解纬度为55℃；酶解后90℃下灭酶，灭酶后捞出固态物进行提取；

其中2号线状阿司巴拉妥叶的复合酶液中，纤维素酶的质量浓度为0.3mg/mL，果胶酶的质量浓度0.3mg/mL；酶解时间为4h，酶解pH为6，酶解纬度为45℃；酶解后85℃下灭酶，灭酶后捞出固态物进行提取；

采用85vol％乙醇水回流提取2次，每次1.5h；添加量为火炭母的10倍体积。

美白组合物的制备，包括以下步骤：

按表1中显示的质量份和序号称取原料，混合成均一稳定状，密封保存。

表1美白组合物成分

组分含量/序号	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
							火炭母提取物	10	10	10	10	10	10
火炭母提取物序号	1	1	1	2	2	2
							番石榴叶提取物	2	2.5	2	3	3	3
番石榴叶提取物序号	1	1	1	2	2	2
							路易博士茶提取物	8	6	8	10	8	10
路易博士茶提取物序号	1	1	1	2	2	2
							光果甘草提取物	4.5	4.5	5	6	5	6
积雪草苷	1.2	1.5	1.5	2	1.4	2
							薄荷醇	0.5	0.5
异山梨醇酐二甲醚			0.8		0.8	1.2
							氮酮				1.2

表1中的单位为质量份，留空则表示无对应添加。

样品稳定性测试

1、耐热测试：恒温培养箱调节到40℃，将前述制取的六个实施例，每个实施例取三支装于透明玻璃瓶中，装样量为20ml/瓶，封口后置于恒温培养箱内，三个月后取出，恢复至室温，观察外观变化。

2、耐寒测试：恒温培养箱调节到-10℃，将前述制取的六个实施例，每个实施例取三支装于透明玻璃瓶中，装样量为20ml/瓶，封口后置于恒温培养箱内，三个月后取出，恢复至室温，观察外观变化。

3、常温测试：将前述制取的六个实施例，每个实施例取三支装于透明玻璃瓶中，装样量为20ml/瓶，封口后常温下放置6个月后，观察外观变化。

耐热测试、耐寒测试、常温测试均未观察到析出、沉淀等现象，保持原来外观。

人体皮肤斑贴测试

将获得的6组美白组合物用水稀释至30wt％后，参照《2022化妆品安全技术规范》中的人体皮肤斑贴实验。

分别于30min(待压痕消失后)、24h和48h按标准观察皮肤反应，并记录观察结果，见表2。

表2人体安全性测试结果

编号	30min	24h	48h
				实施例1	0级，30人	0级，30人	0级，30人
实施例2	0级，30人	0级，30人	0级，30人
				实施例3	0级，30人	0级，30人	0级，30人
实施例4	0级，30人	0级，30人	0级，30人
				实施例5	0级，30人	0级，30人	0级，30人
实施例6	0级，30人	0级，30人	0级，30人

黑色素分泌测试

B16-F10小鼠黑色素瘤细胞是源自C57小鼠的一种皮肤癌细胞，该细胞在体外培养时具有合成黑色素的能力，是体外用于美白产品功效评价及其作用机理研究的常用细胞。本发明以小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10)为模型，先以MTT测定细胞活力的方法筛选出对细胞活力无明显影响的浓度为最大安全浓度，然后在该浓度范围下测试不同浓度样品对该细胞分泌黑色素的影响，评价样品潜在美白功效。

1.实验试剂与耗材

基础培养基(DMEM高糖培养基，BI)

完全培养基(90％DMEM高糖培养基+10％胎牛血清)

胎牛血清(BI)

MTT(噻唑蓝，索莱宝)

PBS(PH7.4，BI)

β-熊果苷

前述实施例1-6制备的成品

B16-F10小鼠黑色素瘤细胞。

2.MTT法测定最大安全浓度

1)接种：当细胞密度≥70％时，弃除旧培养基，加入5mLPBS清洗细胞后，用胰酶消化1min，移液枪吹打细胞致重悬，加DMEM完全培养基终止消化，混匀并转移至2mL离心管中，1000rpm离心4分钟，弃上清；重新加入1mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为8x10⁴cell/mL,按照每孔200μL的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育(37℃、5％CO2)。

2)实验分组：实验设置阴性对照组与实验组，另设3个无细胞的孔作调零孔，实验组中样品设置6个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个复孔；

3)配液：按实验设计，用基础培养基配置不同浓度的受试物；如下表3。

4)给药：24h后取出96孔板，弃除旧培养基，调零孔和空白对照组每孔加200μL基础培养基，实验组每孔加200μL用基础培养基配制的样品，按照每组每个浓度3个复孔进行布板。然后放回培养箱培养(37℃，5％CO₂)；

5)检测：加药处理后24h，取出96孔板，每孔加入MTT工作液(5mg/mL)20μL，放回培养箱继续培养4h，然后弃除孔内液体，每孔重新加入150μLDMSO，振摇10min后于490nm波长处测定吸光度(OD值)。

6)细胞相对活力计算：细胞活力％＝(实验组OD值-调零孔OD值)/(空白对照组OD值-调零组OD值)*100％；如表3所示

表3细胞体外活力影响

表3中，“/”表示没有做对应浓度的实验。

3.对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞分泌黑色素的影响

1)接种：当细胞密度≥70％时，弃除旧培养基，加入5mLPBS清洗细胞后，用胰酶消化1min，移液枪吹打细胞至重悬，加DMEM完全培养基终止消化，混匀并转移至2mL离心管中，1000rpm离心4分钟，弃上清；重新加入1mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为1x10⁵cell/mL,按照每孔2mL的体积接种细胞至6孔板中，放回培养箱孵育(37℃、5％CO₂)。

2)实验分组：按照表4所示进行分组，按照每组每个浓度3个复孔进行布板；

3)配液：根据前面的所得细胞活力测试结果，选择适当浓度作为实验组样品待测浓度；以β-熊果苷(200μg/mL)为阳性对照进行实验。

4)给药：24h后取出6孔板，弃除旧培养基，用PBS清洗细胞，然后按照每组每个浓度3个复孔进行加样，阴性对照组(NC)3个复孔，每孔加2mL基础培养基，阳性对照组(PC)每孔加2mLβ-熊果苷(200μg/mL),实验组每个浓度3个复孔，每孔加2mL对应浓度样品，然后放回培养箱共培养(37℃，5％CO₂)。

5)黑色素细胞收集：给药24h后取出6孔板，弃上清，用PBS清洗2次后，每孔加500μL胰酶，1min后吹打细胞至重悬，细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，每管加1mol/L氢氧化钠溶液200μL，置于80℃水浴1h，涡旋混匀，每孔取150μL于96孔板中，以1mol/L氢氧化钠溶液为空白，于405nm波长处测定吸光度值(OD)。

6)结果结算：黑色素含量＝(实验组OD值-空白孔OD值)/(阴性对照组OD值-空白孔OD值)*100％。

表4黑色素相对含量

样品名称	作用浓度	黑色素含量％	P值
				阴性对照(NC)	/	100	/
阳性对照(PC，β-熊果苷)	200μg/mL	73.8	P＜0.05
				实施例1	1.5625％	16.4	P＜0.001
实施例2	1.5625％	15.8	P＜0.001
				实施例3	1.5625％	16.8	P＜0.001
实施例4	1.5625％	17.6	P＜0.001
				实施例5	1.5625％	16.8	P＜0.001
实施例6	1.5625％	18.5	P＜0.001

表4中，“/”表示不适用。

保湿舒缓测试

透明质酸酶是Ⅰ型过敏反应的参与者，透明质酸酶于炎症、过敏有强相关性，研究报道各种肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶活性，一些抗敏药物有强抑制透明质酸酶活性，因此抑制透明质酸酶活性作为研究抗过敏作用的指标。透明质酸是细胞外基质中含量最多、所占比例最大的成分,可维持细胞外基质体积，调控细胞生长因子和细胞因子的分泌，影响细胞的粘附、生长、增殖和分化，因而在维持皮肤水分有着重要的作用。而透明质酸酶能够降低体内透明质酸的活性，所以抑制透明质酸酶活性作为研究保湿的指标。

透明质酸酶能够不加选择地水解透明质酸中的β-N-乙酰葡糖胺与D-葡糖醛酸盐之间的1,4-键，β-N-乙酰葡糖胺在碱性条件下与乙酰丙酮缩合生成生色原(2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物)，生色原与P-DAB试剂发生显色反应。透明质酸被分解的断片可以被染成桃红色，所以透明质酸酶分解透明质酸越多，则液体的颜色越深。样品管中抑制透明质酸酶的物质多，由于它阻碍了以上的分解过程，所以颜色变浅。因此可以以透明质酸酶抑制率为指标评价物质的舒缓、保湿功效。

1.实验试剂与耗材

阳性对照甘草酸钾1g/mL(麦克林)

冰醋酸

浓HCl

氢氧化钠(AR)

无水醋酸钠(麦克林)

无水碳酸钠(麦克林)

无水乙醇(大茂，AR)

乙酰

丙酮(麦克林，AR)

对二甲氨基苯甲醛(麦克林，AR)

无水氯化钙(天津，AR)

透明质酸钠(麦克林，>99.0％)

透明质酸酶(Sigma)。

2.溶液配制

(1)醋酸缓冲溶液(Buffer)的配置：

①0.2mol/L醋酸溶液：量取1.155ml冰醋酸溶于100mL的蒸馏水中；

②0.2mol/L醋酸钠溶液：称取1.64g无水醋酸钠溶于100mL蒸馏水中；

③Buffer：量取4.8mL0.2mol/L醋酸溶液和45.2mL0.2mol/L醋酸钠溶液至烧杯中，混合均匀后用蒸馏水稀释至100mL，配制成pH＝5.6的醋酸缓冲液。

(2)透明质酸酶：浓度500U/ml，现配现用，不能过夜，用醋酸缓冲液做溶剂。称取6.6mg透明质酸酶，用10mL醋酸缓冲溶液溶解即可。

(3)透明质酸钠：0.5mg/ml，一次配制，多次使用，用醋酸缓冲液做溶剂。称取2.5mg透明质酸钠，用5mL醋酸缓冲溶液溶解即可。

(4)乙酰丙酮溶液：

①1.0mol/L碳酸钠溶液：称取10.599g无水碳酸钠溶于100mL蒸馏水中；

②乙酰丙酮溶液：量取50mL1.0mol/L碳酸钠溶液和3.5ml乙酰丙酮于烧杯中，混合均匀即可(临用现配)。

(5)P-DAB显色剂：称取0.8g对二甲氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇混合均匀。

(6)2.5mol/L氯化钙溶液CaCl₂：称取27.747g无水氯化钙溶于100mL蒸馏水中。

(7)5mol/L氢氧化钠溶液NaOH：称取20g氢氧化钠溶于100mL蒸馏水中。

3.反应方法

实验分为5组，分别是样品组、阳性对照组、空白对照组、模型对照组、样品对照组，同一组别同一浓度下设3个复孔。各溶液添加量和添加顺序及反应流程如表5所示。

表5反应流程

用酶标仪在530nm处测定其吸光度。

式中：A-样品组吸光度平均值；

B-模型对照组吸光度平均值；

C-空白对照组吸光度平均值；

D-样品对照组吸光度平均值。

利用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析，对测试区域的测量值进行描述性统计。计算分析数值的变化，对照组与样品组之间的差异。如测试数据为正态分布，则采用独立T检验方法进行统计分析；如测试数据为非正态分布，则采用秩和检验方法进行统计分析。统计方法均采用双尾检验，检验水准α＝0.05。

4.实验结果，如表6所示。

表6透明质酸酶抑制率检测结果

样品名称	吸光度平均值	透明质酸酶抑制率	P值
				空白对照	0.049±0.001	/	P＜0.001
模型对照	0.098±0.001	0	/
				阳性对照甘草酸钾(1mg/ml)	0.085±0.003	45.58％	*P＜0.001
实施例1(1.5625％)	0.017±0.005	64.40％	*P＜0.01
				实施例2(1.5625％)	0.018±0.004	63.28％	*P＜0.01
实施例3(1.5625％)	0.017±0.003	65.08％	*P＜0.01
				实施例4(1.5625％)	0.018±0.006	63.77％	*P＜0.01
实施例5(1.5625％)	0.017±0.004	62.92％	*P＜0.01
				实施例6(1.5625％)	0.017±0.005	65.11％	*P＜0.01

表6中，“/”表示不适用。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims

1.美白组合物，其特征在于，以质量份计算包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的美白组合物，其特征在于，所述促渗剂为：薄荷醇、异山梨醇酐二甲醚、氮酮中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的美白组合物，其特征在于，所述火炭母提取物的制备方法为：取火炭母植株的成熟果实，洗净、粉碎；

乙醇的添加量为火炭母的8-10倍体积；每次提取时间为≥1h。

4.根据权利要求1所述的美白组合物，其特征在于，所述番石榴叶提取物的制备方法为：

选取新鲜番石榴叶，洗净、干燥、粉碎，得番石榴叶粉；

所述线状阿司巴拉妥叶提取物的制备方法为：

5.根据权利要求1所述的美白组合物，其特征在于，所述番石榴叶粉和粉碎后的线状阿司巴拉妥叶在提取前先进行酶解。

6.根据权利要求5所述的美白组合物，其特征在于，所述酶解采用纤维素酶和果胶酶的复合酶液；其中纤维素酶的质量浓度为≥0.3mg/mL，果胶酶的质量浓度≥0.3mg/mL，酶解时间2-4h，酶解温度为45-55℃，pH4.5-6；酶解后于85-90℃下灭酶；灭酶后捞出固态物进行提取。

7.权利要求1-6任一所述的美白组合物在制备护肤品中的应用。

8.一种驻留类皮肤外用剂，其特征在于，包含权利要求1-6任一所述的美白组合物。

9.根据权利要求8所述的驻留类皮肤外用剂，其特征在于，所述美白组合物的添加比例为≤5wt％。

10.根据权利要求9所述的驻留类皮肤外用剂，其特征在于，还包括辅料，所述辅料选自增稠剂、乳化剂、皮肤调理剂、抗氧化剂、保湿剂、美白剂、pH调节剂和防腐剂中的一种或多种；

所述驻留类皮肤外用剂的剂型为乳液、凝胶或霜剂。