CN112730665A - 超高效液相色谱法测定维生素a含量的色谱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，能替代传统紫外分光光度法、高效液相色谱法测定维生素A的方法含量的色谱方法，通过对样品处理过程以及色谱条件的设计，最终达到简便而准确地对单一组分以及复杂组分样品中维生素A含量的测定，本发明包括以下步骤:(1)对照品溶液的制备；(2)样品处理；(3)设定超高效液相色谱条件。本发明能够代替传统的紫外分光光度法、高效液相色谱法来测定维生素A含量，缩短了检测时间，节省了流动相，同时维生素A与杂质的分离效果更好。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其是一种超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法。
背景技术
维生素A(Vitamin A)是第一个被发现，也是一种极其重要、极易缺乏的，为人体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素。维生素A并不是单一的化合物，而是一系列包括视黄醇(retinol)、视黄醛(retinene)、视黄酸(retinoic Acid)、视黄醇乙酸酯(retinylAcetAte)和视黄醇棕榈酸酯(retinylβAlmitAte)等在内的视黄醇的衍生物。维生素A在人体具有广泛而重要的生理功能，概括起来主要包括视觉、细胞增殖分化调节、细胞间信息交流和免疫应答这几个方面，其缺乏会导致生理功能异常和病理变化。维生素A主要用于防治夜盲症、干眼病，也用于烧伤后皮肤的局部化脓性感染。维生素A及其衍生物很容易被氧化和异构化，特别是在暴露于光线(尤其是紫外线)、氧气、性质活泼的金属以及高温环境时，可加快这种氧化破坏,由于维生素A的不稳定性，放置不当或放置时间过长均易导致其变质，因此维生素A的含量测定和控制非常重要。
在已知的维生素A含量的测定方法中，主要是紫外分光光度法，反相高效液相色谱法，正相高效液相色谱法。但上述各种方法分析存在很多局限性，相比液相色谱法，紫外测定中供试液浓度较低，操作误差较大；反相高效液相色谱法的色谱响应值低，杂质分离效果较差；正相高效液相色谱法系统平衡所需时间长，受外界环境影响较大，系统稳定性较差。为了解决这一难题，本发明简化检测过程，运用超高效液相色谱法快速而准确的分析维生素A的含量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：通过建立合适的样品处理过程以及色谱条件，缩短分析时间，提高维生素A与杂质的分离度，最终提供一种简便、快速、准确的测定维生素A含量的超高效液相色谱法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，包括以下步骤：
步骤(1)、对照品溶液的配制，包括标准贮备溶液配制和标准工作溶液配制，其中标准贮备溶液配制方法为：精密称取适量维生素A对照品于棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释成300mcg/ml的溶液；标准工作溶液配制方法为：精密吸取5.0ml上述标准贮备溶液于一个50ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度；
步骤(2)、样品处理，称取5gAPDC和10g柠檬酸，溶于1000ml二甲基亚砜溶剂中，具塞，避光保存，作为萃取溶液；精密称取相当于适量维生素A醋酸酯的样品(相当于维生素A醋酸酯对照品浓度的样品)于一100ml棕色具塞锥形瓶中，加25ml萃取溶液，将维生素A从样品中萃取到萃取液中，将所得溶液于超声水浴机中超声，取出放冷至室温,加入25.0ml正己烷，强烈振摇,将萃取液中的维生素A提取净化出来，再加15ml的18％NaCl溶液，缓缓摇动，具塞放冷，此过程能让有机相与水相充分分层，分层更加明显，同时减少有机相的杂质溶解，让萃取更充分；高速涡旋混匀25～35分钟，再静置15～20分钟，吸取上层液体于一50ml离心管中，高速离心，取正己烷上清液经滤膜过滤后注入超高效液相色谱仪；
步骤(3)、设定超高效液相色谱条件，包括色谱柱、流动相试剂、流速、检测波长、进样量以及柱温。
进一步，所述步骤(2)样品处理过程中样品溶液在超声水浴机中超声的温度设为55～65℃，超声的时间设为40～50分钟。
进一步，所述步骤(2)样品处理过程中，在离心机上进行离心处理的参数为：4000～5000rmp离心20～30分钟。
进一步，所述的滤膜孔径≤0.22um。
进一步，所述步骤(3)中超高效液相色谱条件设为：
色谱柱：C18柱(100×3.0mm，1.7μm)；
流动相试剂：0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇；
流速：0.68～1.02ml/min；
检测波长：325nm；
进样量：0.9～1.8μl；
柱温：30～45℃。
进一步，所述的流动相试剂0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇的体积比为5:10:85。
本发明的一种超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，其有益效果是：本发明能替代传统的紫外分光光度法、高效液相色谱法测定维生素A的方法，能通过对样品处理过程的研究以及色谱条件的选择，提供了一种通过超高效液相色谱法简便、快捷、准确测定单一组分及复杂组分样品中维生素A含量的色谱方法，该方法缩短了检测时间，节省了流动相，同时维生素A与杂质的分离效果更好，适用于含维生素A的片剂、维生素A类硬胶囊、维生素A类粉剂、维生素A类软胶囊、维生素A类滴剂、维生素A类丸剂、维生素A类软糖、维生素A饮料，保健食品、药品、普通食品或预混料，推广应用具有良好的经济和社会效益。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1(a)为现有高效液相色谱法对实施例1中标准品测定的结果；
图1(b)为现有高效液相色谱法对实施例1中样品测定的结果；
图2(a)为应用本发明方法对实施例1中的标准品测定的结果；
图2(b)为应用本发明方法对实施例1中的样品测定的结果；
图3(a)为现有高效液相色谱法对实施例2中标准品测定的结果；
图3(b)为现有高效液相色谱法对实施例2中样品测定的结果；
图4(a)为应用本发明方法对实施例2中的标准品测定的结果；
图4(b)为应用本发明方法对实施例2中的样品测定的结果；
图5(a)为现有高效液相色谱法对实施例3中标准品测定的结果；
图5(b)为现有高效液相色谱法对实施例3中样品测定的结果；
图6(a)为应用本发明方法对实施例3中的标准品测定的结果；
图6(b)为应用本发明方法对实施例3中的样品测定的结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施方式中的特征可以相互任意组合。
本发明的一种超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，包括以下步骤：
步骤(1)、对照品溶液的配制，包括标准贮备溶液配制和标准工作溶液配制，其中标准贮备溶液配制方法为：精密称取适量维生素A对照品于棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释成300mcg/ml的溶液；标准工作溶液配制方法为：精密吸取5.0ml上述标准贮备溶液于一个50ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度；
步骤(2)、样品处理，称取5gAPDC和10g柠檬酸，溶于1000ml二甲基亚砜溶剂中，具塞，避光保存，作为萃取溶液；精密称取相当于适量维生素A醋酸酯的样品(相当于维生素A醋酸酯对照品浓度的样品)于一100ml棕色具塞锥形瓶中，加25ml萃取溶液，将维生素A从样品中萃取到萃取液中，将所得溶液于超声水浴机中超声，取出放冷至室温,加入25.0ml正己烷，强烈振摇,将萃取液中的维生素A提取净化出来，再加15ml的18％NaCl溶液，缓缓摇动，具塞放冷；高速涡旋混匀25～35分钟，再静置15～20分钟，吸取上层液体于一50ml离心管中，高速离心，取正己烷上清液经滤膜过滤后注入超高效液相色谱仪；
步骤(3)、设定超高效液相色谱条件，包括色谱柱、流动相试剂、流速、监测波长、进样量以及柱温。
所述步骤(2)样品处理过程中样品溶液在超声水浴机中超声的温度设为55～65℃，超声的时间设为40～50分钟。
所述步骤(2)样品处理过程中，在离心机上进行离心处理的参数为：4000～5000rmp离心20～30分钟。
所述的滤膜孔径≤0.22um。
所述步骤(3)中超高效液相色谱条件设为：
色谱柱：C18柱(100×3.0mm，1.7μm)；
流动相试剂：0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇；
流速：0.68～1.02ml/min；
检测波长：325nm；
进样量：0.9～1.8μl；
柱温：30～45℃。
所述的流动相试剂0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇的体积比为5:10:85。
具体实施时，本发明是以超高效液相色谱法测定维生素A的含量，而且此方法适用于任何剂型(软胶囊、片剂、软糖等)；以二甲基亚砜溶剂萃取样品，本身就能很好的萃取脂溶性维生素A，再加以55～65℃超声40～50分钟，就能使样品中维生素A一次性彻底萃取出来；再用正己烷将萃取液中的维生素A提取出来；萃取液与正己烷互不相溶，正己烷密度比萃取液低，加入氯化钠溶液，增加萃取液的密度，促进分层，防止乳化；然后4000～5000rmp离心20～30分钟取正己烷上清液即可；为了达到更好的分离，流动相体积比定为0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇(5:10:85)，在325nm波长下，用超高C18柱进行分析；最主要的是本发明采用超高效液相色谱仪代替传统高效液相色谱仪设备，100×3.0mm，1.7μm的C18柱代替传统的25cm的C18柱，检测速度提高了2倍，缩短了检测时间，节省了流动相，同时维生素A与杂质的分离效果更好。而且此方法做了方法学验证，各个项目指标都很理想，具体结果如下：专属性良好；线性方程为Y＝1E+06X+51053，R为0.9995；重复性RSD为1.8％；方法检出限为0.14004ng；加标回收率为98.6％；溶液稳定性和耐用性都很好；证明该方法的专属性、线性、重现性、分离度、回收率等良好。
实施例一
Multivitamin Gummy(Mixed)(MG1F)(江苏艾兰得营养品有限公司生产)多维软糖中维生素A含量的测定：
本发明所用试剂及配制：二甲亚砜：色谱纯；异丙醇：色谱纯；冰醋酸：分析纯；甲醇：色谱纯；正己烷：色谱纯；APDC：分析纯；柠檬酸：分析纯；
(1)对照品溶液的配制，包括标准贮备溶液配制和标准工作溶液配制，其中标准贮备溶液配制：分别精密称取适量维生素A对照品于棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释成300mcg/ml的溶液；
标准工作溶液配制：精密吸取5.0ml上述标准贮备溶液于一个50ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度；
(2)样品处理：
样品处理：称取5g APDC和10g柠檬酸，溶于1000ml二甲基亚砜试剂中，具塞，避光保存，作为萃取溶液；精密称取相当于适量维生素A醋酸酯的样品(相当于维生素A醋酸酯对照品浓度的样品)于一100ml棕色具塞锥形瓶中，加25ml萃取液，上述溶液于超声水浴机中55～65℃超声40～50分钟，取出放冷至室温,加入25.0ml正己烷，强烈振摇,再加15ml的18％NaCl溶液，缓缓摇动，具塞放冷。高速涡旋混匀25～35分钟，再静置15～20分钟，吸取上层液体于一50ml离心管中，高速离心20～30分钟，取正己烷上清液经0.22um或更小孔径的滤膜过滤后注入超高效液相色谱仪；
(3)色谱条件：色谱柱：C18柱，100×3.0mm，1.7μm；流动相：0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇＝5:10:85；流速：0.85ml/min；检测波长：325nm；进样量：0.9μl；柱温：40℃；
(4)计算：
式中：A样、A标：为样品、对照品的峰面积，
C标：对照品的浓度，mg/ml；
W样：样品的重量，g；
(5)样品检测结果：如图1(a)和(b)所示，其中图1(a)为标准品的测定结果，图1(b)为实际样品的测定结果。t＝3.1min附近的峰为维生素A测定峰，原有传统方法维生素A保留时间一般为3min左右；而本发明的保留时间才为1.4min，如图2(a)和(b)，其中图2(a)为标准品的测定结果，图2(b)为实际样品的测定结果。t＝1.4min附近的峰为维生素A测定峰，其速度提高了2倍，缩短了检测时间，节省了流动相，本发明维生素A与旁边的杂质峰分离效果比传统方法更好。
实施例二
Spectrovite Men's 50+Tablet(RSPO/MB)(MTGY)(江苏艾兰得营养品有限公司生产)多维片剂样品中VA含量的测定：
本发明所用试剂及配制：二甲亚砜：色谱纯；异丙醇：色谱纯；冰醋酸：分析纯；甲醇：色谱纯；正己烷：色谱纯；APDC：分析纯；柠檬酸：分析纯；
(1)对照品溶液的配制，包括标准贮备溶液配制和标准工作溶液配制，其中标准贮备溶液配制：分别精密称取适量维生素A对照品于棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释成300mcg/ml的溶液；
标准工作溶液配制：精密吸取5.0ml上述标准贮备溶液于一个50ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度；
(2)样品处理：
样品处理：称取5g APDC和10g柠檬酸，溶于1000ml二甲基亚砜试剂中，具塞，避光保存，作为萃取溶液；精密称取相当于适量维生素A醋酸酯的样品(相当于维生素A醋酸酯对照品浓度的样品)于一100ml棕色具塞锥形瓶中，加25ml萃取液，上述溶液于超声水浴机中55～65℃超声40～50分钟，取出放冷至室温,加入25.0ml正己烷，强烈振摇,再加15ml的18％NaCl溶液，缓缓摇动，具塞放冷。高速涡旋混匀25～35分钟，再静置15～20分钟，吸取上层液体于一50ml离心管中，高速离心20～30分钟，取正己烷上清液经0.22um或更小孔径的滤膜过滤后注入超高效液相色谱仪；
(3)色谱条件：色谱柱：C18柱，100×3.0mm，1.7μm；流动相：0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇＝5:10:85；流速：0.85ml/min；检测波长：325nm；进样量：0.9μl；柱温：40℃；
(4)计算：
式中：A样、A标：为样品、对照品的峰面积，
C标：对照品的浓度，mg/ml；
W样：样品的重量，g；
(5)检测结果：如图3(a)和(b)所示，其中图3(a)为标准品的测定结果，图3(b)为实际样品的测定结果。t＝3.3min附近的峰为维生素A测定峰，原有传统方法维生素A保留时间一般为3min左右；而本发明的保留时间才为1.5min，如图4(a)和(b)，其中图4(a)为标准品的测定结果，图4(b)为实际样品的测定结果。t＝1.5min附近的峰为维生素A测定峰，其速度提高了2倍，缩短了检测时间，节省了流动相，本发明维生素A与旁边的杂质峰分离效果比传统方法更好。
实施例三
维生素A维生素D软胶囊(VS0T)(江苏艾兰得营养品有限公司生产)软胶囊样品中VA含量的测定：
本发明所用试剂及配制：二甲亚砜：色谱纯；异丙醇：色谱纯；冰醋酸：分析纯；甲醇：色谱纯；正己烷：色谱纯；APDC：分析纯；柠檬酸：分析纯；
(1)对照品溶液的配制，包括标准贮备溶液配制和标准工作溶液配制，其中标准贮备溶液配制：分别精密称取适量维生素A对照品于棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释成300mcg/ml的溶液；
标准工作溶液配制：精密吸取5.0ml上述标准贮备溶液于一个50ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度；
(2)样品处理：
样品处理：称取5g APDC和10g柠檬酸，溶于1000ml二甲基亚砜试剂中，具塞，避光保存，作为萃取溶液；精密称取相当于适量维生素A醋酸酯的样品(相当于维生素A醋酸酯对照品浓度的样品)于一100ml棕色具塞锥形瓶中，加25ml萃取液，上述溶液于超声水浴机中55～65℃超声40～50分钟，取出放冷至室温,加入25.0ml正己烷，强烈振摇,再加15ml的18％NaCl溶液，缓缓摇动，具塞放冷。高速涡旋混匀25～35分钟，再静置15～20分钟，吸取上层液体于一50ml离心管中，高速离心20～30分钟，取正己烷上清液经0.22um或更小孔径的滤膜过滤后注入超高效液相色谱仪；
(3)色谱条件：色谱柱：C18柱，100×3.0mm，1.7μm；流动相：0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇＝5:10:85；流速：0.85ml/min；检测波长：325nm；进样量：0.9μl；柱温：40℃；
(4)计算：
式中：A样、A标：为样品、对照品的峰面积，
C标：对照品的浓度，mg/ml；
W样：样品的重量，g；
(5)检测结果：如图5(a)和(b)所示，其中图5(a)为标准品的测定结果，图5(b)为实际样品的测定结果。t＝3.1min附近的峰为维生素A测定峰，原有传统方法维生素A保留时间一般为3min左右；而本发明的保留时间才为1.9min，如图6(a)和(b)，其中图6(a)为标准品的测定结果，图6(b)为实际样品的测定结果。t＝1.9min附近的峰为维生素A测定峰，其速度提高了2倍，缩短了检测时间，节省了流动相，本发明维生素A与旁边的杂质峰分离效果比传统方法更好。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (6)
1.一种超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，其特征是：包括以下步骤：
步骤(1)、对照品溶液的配制，包括标准贮备溶液配制和标准工作溶液配制，其中标准贮备溶液配制方法为：精密称取适量维生素A对照品于棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释成300mcg/ml的溶液；标准工作溶液配制方法为：精密吸取5.0ml上述标准贮备溶液于一个50ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度；
步骤(2)、样品处理，称取5g吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(APDC)和10g柠檬酸，溶于1000ml二甲基亚砜溶剂中，具塞，避光保存，作为萃取溶液；精密称取相当于适量维生素A醋酸酯的样品(相当于维生素A醋酸酯对照品浓度的样品)于一100ml棕色具塞锥形瓶中，加25ml萃取溶液，将维生素A从样品中萃取到萃取液中，将所得溶液于超声水浴机中超声，取出放冷至室温,加入25.0ml正己烷，强烈振摇,将萃取液中的维生素A提取净化出来，再加15ml的18％NaCl溶液，缓缓摇动，具塞放冷；高速涡旋混匀25～35分钟，再静置15～20分钟，吸取上层液体于一50ml离心管中，高速离心，取正己烷上清液经滤膜过滤后注入超高效液相色谱仪；
步骤(3)、设定超高效液相色谱条件，包括色谱柱、流动相试剂、流速、检测波长、进样量以及柱温。
2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，其特征是：所述步骤(2)样品处理过程中样品溶液在超声水浴机中超声的温度设为55～65℃，超声的时间设为40～50分钟。
3.根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，其特征是：所述步骤(2)样品处理过程中，在离心机上进行离心处理的参数为：4000～5000rmp离心20～30分钟。
4.根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，其特征是：所述的滤膜孔径≤0.22um。
5.根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，其特征是：所述步骤(3)中超高效液相色谱条件设为：
色谱柱：C18柱(100×3.0mm，1.7μm)；
流动相试剂：0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇；
流速：0.68～1.02ml/min；
检测波长：325nm；
进样量：0.9～1.8μl；
柱温：30～45℃。
6.根据权利要求5所述的超高效液相色谱法测定维生素A含量的色谱方法，其特征是：所述的流动相试剂0.05mol/l醋酸:异丙醇:甲醇的体积比为5:10:85。
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