CN116087356B - 一种基于高效液相色谱-串联质谱法检测维生素a的方法及其应用 - Google Patents
一种基于高效液相色谱-串联质谱法检测维生素a的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微量化合物检测技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱‑串联质谱法检测维生素A的方法及其应用。本发明可用于临床上维生素A的浓度监测，同时可与维生素D(25‑羟基维生素D2和25‑羟基维生素D3)实现联检。将血清提取后进行衍生化反应，然后用质谱扫描衍生后的维生素A的离子对，对其进行浓度定量。本发明确定了衍生后维生素A的母离子和子离子，并推测了维生素A的衍生反应过程。通过衍生化反应后，增强了维生素A的离子化效率，大大提高了检测灵敏度，能大幅降低血清样本用量，同时节约仪器成本。且对方法进行了性能验证，方法稳定性好，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于微量化合物检测技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱-串联质谱法检测维生素A的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
维生素A是一种极其重要、极易缺乏的，为人体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素，需通过饮食等手段获得。目前检测维生素A的方法有液相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫法、高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法等，由于LC-MS/MS法的高选择性、特异性和灵敏度等优势，它已经成为检测血清中脂溶性维生素浓度的最主要方法。
4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)试剂在维生素D衍生化中已有应用，衍生化法显著提高了维生素D的灵敏度。为了保证检测的高灵敏度，样品前处理就需要使用衍生法，发明人发现，目前尚缺少将维生素A衍生化处理的相关报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于高效液相色谱-串联质谱法检测维生素A的方法及其应用。本发明通过研究发现，维生素A有5个双键，在加热条件下双键发生构型转化，形成两个顺式共轭双烯结构，分别与PTAD进行Diels–Alder反应，除此之外，PTAD片段的N-N键具备络合流动相中的甲胺的能力，形成了最终的结构式。终产物是更易离子化的[M+CH3NH3]+峰，解决了维生素A在电喷雾电离(ESI)模式下很难被电离的问题，从而大大提高分析的灵敏度，同时可与维生素D实现联检，是一种可保证维生素A和维生素D同时高灵敏度的检测方法。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种基于高效液相色谱-串联质谱法检测维生素A的方法，所述方法包括：对待测血液样品进行预处理，然后向其中加入浓度为0.005-0.02mg/mLPTAD试剂进行衍生化处理，进一步处理得上机液，基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测；
需要说明的是，为防止待测维生素降解，上述所有操作在避光条件下进行。
本发明的第二个方面，提供上述检测方法在如下任意一种或多种中的应用：
a)脂溶性维生素药代动力学研究；
b)脂溶性维生素浓度监测。
其中，所述脂溶性维生素可以为维生素A和维生素D，所述维生素D可以为25-羟基维生素D2以及25-羟基维生素D3。
与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
上述技术方案提供了一种高灵敏度的高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后维生素A的方法，可用于临床上维生素A的浓度监测，同时可与维生素D(25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3)实现联检。将血清提取后进行衍生化反应，然后用质谱扫描衍生后的维生素A的离子对，对其进行浓度定量。
上述技术方案确定了衍生后维生素A的母离子和子离子，并推测了维生素A的衍生反应过程。通过衍生化反应后，增强了维生素A的离子化效率，大大提高了检测灵敏度，能大幅降低血清样本用量，同时节约仪器成本。且对方法进行了性能验证，方法稳定性好，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中衍生及非衍生维生素A信号对比；
图2为本发明实施例中衍生维生素A子离子碎片断裂处；
图3为本发明实施例中维生素A与25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3同时检测峰图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，目前尚缺少将维生素A衍生化处理的相关报道。
发明人仅研究发现，衍生后原本的维生素A离子通道里已经检测不到目标物，说明在样本处理过程中，维生素A的分子量已经改变，若想实现维生素A和维生素D的联检，就必须研究维生素A在衍生过程中变成了什么结构。
LC-MS/MS法的优势是一针可同时检测多种物质，维生素D与维生素A都属于脂溶性维生素，如果能一同检测这两种脂溶性维生素，既能充分利用质谱仪的优势，又能避免二次提取和检测，节省了时间和样本用量。维生素D的衍生化过程是维生素D与PTAD进行了Diels–Alder反应，即共轭双烯与取代烯烃反应生成取代环己烯。维生素A的结构式中也包含一对共轭双烯，推断其也能与一个PTAD发生反应，即维生素A原有分量上加上PTAD的分子量就是衍生后维生素A的分子量，但经过质谱扫描分析，衍生后维生素A的母离子响应很低。经过分析，除共轭双烯那对双健外，维生素A的结构中还包含三对双键，是否会在加热条件下(衍生过程50℃)发生构型转化，变成另一对共轭双烯去再结合一个PTAD。据此，我们扫描维生素A加上两个PTAD分子量形成的母离子碎片，找到了响应高的特征母离子。然后对母离子进行产物离子碎片扫描去确定特征子离子，最终确定了衍生后维生素A的母离子及特征子离子碎片的大小，通过子离子的质核比来判断衍生后物质的断裂处。
因此，申请人对维生素A的衍生过程进行了分析：维生素A有5个双键，在加热条件下双键发生构型转化，形成两个顺式共轭双烯结构，分别与PTAD进行Diels–Alder反应，除此之外，PTAD片段的N-N键具备络合流动相中的甲胺的能力，形成了最终的结构式。终产物是更易离子化的[M+CH3NH3]+峰，解决了维生素A在电喷雾电离(ESI)模式下很难被电离的问题，从而大大提高分析的灵敏度(提高达150倍)，同时可与维生素D实现联检，是一种可保证维生素A和维生素D同时高灵敏度的检测方法。具体反应过程见下，结构式中浅色的是Diels–Alder反应发生的位置。Diels–Alder反应，即共轭双烯与取代烯烃反应生成取代环己烯。
基于上述研究成果，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于高效液相色谱-串联质谱法检测维生素A的方法，所述方法包括：对待测血液样品进行预处理，然后向其中加入浓度为0.005-0.02mg/mL PTAD试剂进行衍生化处理，进一步处理得上机液，基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测。
待测血液样品进行预处理的具体方法包括：取待测血液样品向其中加入同位素内标，涡旋处理后，向其中加入甲醇沉淀蛋白，继续涡旋处理，然后向其中加入正己烷进行液液萃取，离心得上清液并氮气吹干。
其中，所述同位素内标可以为维生素A-d6；所述同位素内标的溶液浓度为1-5μg/mL，优选为3μg/mL。
涡旋处理20-60s，优选处理30s；继续涡旋处理0.5-2min，优选1min。
所述进一步处理方法包括：将进行衍生化处理后的样品在加热状态下振荡孵育20-40min后，向其中加入无水乙醇振荡处理0.5-2min，氮气吹干后，加入甲醇复溶，取上清液为上机液。
所述测血液样品、同位素内标溶液、甲醇、正己烷、PTAD试剂、无水乙醇和甲醇的体积比为0.01-0.05:0.001-0.005:0.05-0.5:0.5-2:0.01-0.1:0.01-0.05:0.02-0.1。
所述待测血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清。
需要说明的是，为防止待测维生素降解，上述所有操作在避光条件下进行。
所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：水，流动相B相：含有10mM甲胺的甲醇溶液；
色谱柱为C18色谱柱；流动相流速为0.3～0.8ml/min(优选为0.5ml/min)；柱温为25～45℃(优选为40℃)；进样量1～10μL(优选为5μL)；
具体的，所述色谱柱为XBridge BEH C18色谱柱，经研究发现，其对衍生化后的脂溶性维生素(如维生素A和维生素D等)具有较好的保留作用。
梯度洗脱方式具体为：0～1.0min，60％B，2.0～3.0min，98％B，3.5～5min，60％B。
质谱条件包括：
衍生后的维生素A和内标(vitamin A-d6)的检测离子对分别为m/z 668→272和m/z674→275；透镜电压分别为130V，135V；碰撞电压分别为20V，20V；采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度350℃、正离子电压3500V。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述检测方法在如下任意一种或多种中的应用：
a)脂溶性维生素药代动力学研究；
b)脂溶性维生素浓度监测。
其中，所述脂溶性维生素可以为维生素A和维生素D，所述维生素D可以为25-羟基维生素D2以及25-羟基维生素D3。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
维生素A(对照品)，纯度:98.2％；Vitmin A-d6(内标)，纯度:98％。
仪器：YS EXT 9050MD高效液相色谱串联质谱检测系统。
XBridge BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相:水(A)-10mM甲胺的甲醇(B)；柱温:40℃；流速:0.5mL/min，进样量为5μL。梯度洗脱:0～1.0min，60％B，2.0～3.0min，98％B，3.5～5min，60％B。
衍生后的维生素A和内标(vitamin A-d6)的检测离子对分别为m/z 668→272和m/z674→275；透镜电压分别为130V,135V；碰撞电压分别为20V,20V；采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度350℃、正离子电压3500V。
对照品储备溶液维生素A系列标准溶液的配制：取维生素A标准品10mg，置于10mL容量瓶中，并加入甲醇10mL溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL维生素A储备液。VitaminA-d6标准溶液的配制：取vitamin A-d6标准品10mg，置于10mL容量瓶中，并加入甲醇10mL溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL内标储备液。临用时，用甲醇稀释至所需浓度。
血清样本处理：取血清样品30μL，加入内标溶液(3μg/mL)2μL，涡旋30s，加入甲醇100μL沉淀蛋白，涡旋1min，加入正己烷1mL进行液液萃取，以8000rpm离心5min，取上清溶液，放入玻璃小管，氮气吹干，加入浓度为0.01mg/mL PTAD衍生液50μL，50℃恒温振荡孵育30min，加入20μL无水乙醇振荡1min，氮气吹干，加入甲醇50μL复溶，再取上清溶液转入进样小瓶，进行LC-MS/MS分析，所有操作在避光条件下进行。
灵敏度对比：相同浓度下(1000ng/mL)维生素A非衍生与衍生结果对比，经过衍生化后，维生素A的信号提高150倍。衍生与非衍生物质的保留时间均与其内标一致，具体结果见图1。同时，用本提取方法提取的样本在上文所述的液相条件下，加入维生素D的质谱离子对，能同时检测衍生后的维生素A和维生素D(25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3)，可实现维生素A和维生素D的联检，具体见图3。
对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对检测限、定量限、精密度、准确度、提取回收率。
线性关系及检测限、定量限：取维生素A标准溶液与牛血清白蛋白(BSA)精确配制1600ng/mL，用BSA倍比稀释一系列不同浓度的标准曲线浓度。提取方法与样本相同，以维生素A/vitamin A-d6与浓度的峰面积比构建校准曲线，得到回归方程和相关系数。以信噪比(S/N)≥3对应的浓度为检出限，(S/N)≥10对应的浓度作为定量限，得到维生素A的检出限和定量限，结果见表1。
表1测定维生素A含量方法的线性、检测限和定量限
| 化合物 | 线性方程 | R2 | 定量限ng/mL | 检出限ng/mL |
| VA | y＝1.378x-7.642e-1 | 0.9875 | 50 | 25 |
| VA-PTAD | y＝1.289x+5.897e-1 | 0.9989 | 0.3 | 0.1 |
精密度：在同一天对四种浓度(0.2、100、400和800ng/mL)的六个重复的LLOQ和QC样品进行分析，以评估日内精密度和准确度。通过连续三天分析LLOQ和QC样本来评估日间精密度和准确度。方法的精密度和准确度分别用相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)表示。RSD和RE均不得超过15％。然而，在LLOQ，RE和RSD<±20％是可以接受的。LLOQ和QC样品中维生素A的精密度和准确度结果见表2。维生素A各样品水平的精密度(RSD)均小于15％。对维生素A各样品水平的准确度在85％到115％之间。测定值均在可接受范围内。
表2测定维生素A含量方法的精密度和准确度
提取回收率：选择临床样品，将其分为体积相同的3份，每份100μL。在其中1份样本中加入5μL不含待测物的空白试剂(甲醇色谱级或以上)，作为基础样本；而在另2份样本中各加入5μL不同浓度的待测物标准品溶液，加入后样本中的标准液浓度见表3，制成2个不同加入浓度的回收样本。要求加入标准液后低水平样本中的待测物在参考范围中间值附近，而高水平样本中的待测物达到参考范围上限。不同浓度下维生素A的提取回收率结果准确、重现性好。
表3人血清中测定维生素A含量方法的提取回收率
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.一种基于高效液相色谱-串联质谱法检测维生素A的方法，所述方法包括：对待测血液样品进行预处理，然后向其中加入浓度为0.005-0.02mg/mL 4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮试剂进行衍生化处理，进一步处理得上机液，基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测；
待测血液样品进行预处理的具体方法包括：取待测血液样品向其中加入同位素内标，涡旋处理后，向其中加入甲醇沉淀蛋白，继续涡旋处理，然后向其中加入正己烷进行液液萃取，离心得上清液并氮气吹干；
所述待测血液样品为血清；
涡旋处理20-60s；继续涡旋处理0.5-2min；
所述同位素内标为维生素A-d6；所述同位素内标的溶液浓度为1-5μg/mL；
所述进一步处理方法包括：将进行衍生化处理后的样品在加热状态下振荡孵育20-40min后，向其中加入无水乙醇振荡处理0.5-2min，氮气吹干后，加入甲醇复溶，取上清液为上机液；
所述加热状态为50℃；
所述待测血液样品、同位素内标溶液、甲醇沉淀蛋白步骤的甲醇、正己烷、4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮试剂、无水乙醇和甲醇复溶步骤的甲醇的体积比为0.01-0.05:0.001-0.005:0.05-0.5:0.5-2:0.01-0.1:0.01-0.05:0.02-0.1；
所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：水，流动相B相：含有10mM甲胺的甲醇溶液；
色谱柱为C18色谱柱；流动相流速为0.3～0.8ml/min；柱温为25～45℃；进样量1～10μL；
梯度洗脱方式具体为：0～1.0min，60％B，2.0～3.0min，98％B，3.5～5min，60％B；
质谱条件包括：衍生后的维生素A和内标维生素A-d6的检测离子对分别为m/z 668→272和m/z 674→275；透镜电压分别为130V,135V；碰撞电压分别为20V,20V；采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度350℃、正离子电压3500V。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同位素内标的溶液浓度为3μg/mL。
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