CN110160991B - 一种散射比浊法测定血清淀粉样蛋白a含量的试剂盒 - Google Patents

一种散射比浊法测定血清淀粉样蛋白a含量的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种散射比浊法测定血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒。该试剂盒组成简单,添加苜蓿皂甙能与胆固醇结合降低血清中总胆固醇,可以有效地消除胆固醇的干扰。本试剂盒采用散射比浊法进行,检测的线性范围、相关性与灵敏度均高于现有试剂盒,显著提高了血清淀粉样蛋白A检测的灵敏度,解决了现有血清淀粉样蛋白A测定试剂盒检测灵敏度、精密度低,线性范围窄的问题。

Description

一种散射比浊法测定血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种散射比浊法测定血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,属于生物技术及医学检验领域。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein,SAA)是一类多基因编码的多形态蛋白家族,属于急性时相反应蛋白,载脂蛋白家族中的异质类蛋白质,相对分子量约12000。在炎症、感染性和非感染性疾病期间,它在血液中的浓度能在数小时内急剧升高,可升高到最初浓度的1000倍,但半衰期很短,只有50分钟左右;SAA与HDL有关,它能在炎症期间调节HDL的代谢,SAA一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A原纤维的方式沉积在不同的器官中,在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。
与C反应蛋白(CRP)类似,SAA的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标,有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。SAA升高还见于动脉粥样硬化、糖尿病肾病、急性心肌梗死、冠心病、慢性肾脏疾病,它反应灵敏,尤其对“正常”与微小急性相反应可提供更好的鉴别。SAA检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面,比CRP检测更确凿。研究发现,在患关节炎的案例中,血清淀粉样蛋白A与疾病活动性的关系最密切。同时检测CRP和SAA能提高对感染的诊断灵敏度。但目前所使用的关于血清淀粉样蛋白A测定试剂盒其准确性低,且操作复杂,不易推广。
该试剂盒检测方法主要有:散射比浊法、胶体金法、ELISA法。胶体金法以胶体金为标记物,利用SAA与抗SAA抗体胶乳颗粒反应,对形成的抗原抗体复合物进行定性及半定量研究的技术。因其操作快速简便、稳定性强、价格低廉等优点已在临床检验中得到广泛的应用,但是只能进行定性或半定量检测,容易漏检弱阳性样本。ELISA法通过酶标仪判断CUTOFF值,从而达到对SAA的定量检测。该测定方法具有精确、定量,敏感性高的特点。但这种方法操作步骤复杂,耗时耗力,不适宜做单个标本和急诊标本,不能满足临床患者及时诊断及治疗的需要散射比浊法是抗原抗体复合物微粒通过对入射光的折射和衍射形成散射光,其强度与抗原抗体复合物的量呈正相关。散射比浊法最先进,灵敏度更高,线性范围更广,操作也相对简便,在临床中被广泛采用。该测试方法既可以在通用的大型自动化生化分析仪上运用,也可以在特定蛋白分析仪等小型的POCT(即时检测)设备上采用,有很强的适用性。但该方法检测受胆固醇的影响,造成检测结果不准确,为血清淀粉样蛋白A浓度的测定带来了困难,从而限制了此类试剂在临床上的推广。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足,提供一种散射比浊法测定血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒。该试剂盒组成简单,添加苜蓿皂甙能与胆固醇结合降低血清中总胆固醇,可以有效地消除胆固醇的干扰,针对散射比浊法试剂具有广泛的通用性,具有稳定性好,灵敏度、精密度高,线性范围较宽等优点。
一种散射比浊法测定血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,包括试剂1和试剂2;
所述试剂1为含有0.01-0.06%苜蓿皂甙(该成分在试剂1中的终浓度)的缓冲液,所述试剂2为包被有4-6%(w/v)血清淀粉样蛋白A抗体胶乳的颗粒(该成分在试剂中的终浓度)。
进一步的,所述试剂2中包括1-6mmol/L(该成分在试剂2中的终浓度)的甘油。
进一步的,所述试剂1还包括如下组分(下述各组分浓度均为该组分在试剂1中的终浓度):0.1-0.5mol/L磷酸盐缓冲液,0.2-0.6mol/L氯化钠溶液,0.01-0.03%wtProClin300;
进一步的,所述试剂2还包括如下组分(下述各组分浓度均为该组分在试剂2中的终浓度):0.1-0.5mol/L磷酸盐缓冲液,0.2-0.6mol/L氯化钠,1-3%wt牛血清白蛋白,0.01-0.03%wt ProClin 300。
进一步的,所述试剂1和试剂2体积比为4:1。
进一步的,所述磷酸盐缓冲液的pH为7.1-7.7。
进一步的,上述试剂盒包括试剂1和试剂2:
所述试剂1包括如下组分(下述各组分浓度均为该组分在试剂中的终浓度):0.2mol/L磷酸盐缓冲液,0.5mol/L氯化钠溶液,0.02%wt ProClin 300,0.06%苜蓿皂甙;
所述试剂2包括如下组分(下述各组分浓度均为该组分在试剂中的终浓度):0.2mol/L磷酸盐缓冲液,5%(w/v)血清淀粉样蛋白A抗体乳胶,0.5mol/L氯化钠,1%wt牛血清白蛋白,0.02%wt ProClin 300,2mmol/L的甘油;
所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
进一步的,上述试剂盒在测定血清、血浆或全血中血清淀粉样蛋白A的应用。
皂甙是广泛存在于植物界的一类特殊的甙类,根据皂甙水解后生成的皂甙元结构,可分为两大类:三萜皂甙和甾体皂甙。三萜皂甙尤以石竹科、桔梗科、豆科等为主,甾体皂甙主要存在于薯蓣科和百合科植物中,研究表明苜蓿皂甙能显著降低血液中胆固醇的含量。
有益效果:
(1)本发明的试剂盒能够提高检测结果的特异性和准确性。在试剂1中添加苜蓿皂甙,加入苜蓿皂甙后,样品中的胆固醇与苜蓿皂甙反应,从而消除胆固醇对测定结果的干扰。试剂2中加入甘油后,增加了测试结果的稳定性和重复性。
(2)本试剂盒采用散射比浊法进行,检测的线性范围、相关性与灵敏度均高于现有试剂盒,显著提高了血清淀粉样蛋白A检测的灵敏度,解决了现有血清淀粉样蛋白A测定试剂盒检测灵敏度、精密度低,线性范围窄的问题。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面结合实施例对本发明作进一步说明,所描述的实施例仅是本申请一部分实施例,而不是全部,本发明不受下述实施例的限制。
实施例1一种使用试剂盒测定血清、血浆或全血中血清淀粉样蛋白A的方法
1)校准品的制备:用校准品稀释液配制不同浓度梯度的血清淀粉样蛋白A校准品抗原标准品,获得终浓度为0mg/L、6.3mg/L、12.6mg/L、25.2mg/L、50.3mg/L、100.6mg/L的血清淀粉样蛋白A校准品抗原标准品溶液。
2)静脉采血,全血样本置于EDTA或肝素抗凝管中;血清样本置于无抗凝剂管中;血浆样本置于EDTA或肝素抗凝管中,轻轻颠倒混匀。血清和血浆样本于2500-3000转/分,离心8-10分钟,收集上层液体(血清或血浆),获得样本。
3)使用山东艾科达全自动特定蛋白分析仪进行测定,设定仪器参数为检测温度37℃,检测波长650nm,反应时间10分钟,试剂1的用量为240μL,试剂2的用量为60μL,样本用量为5μL,将步骤1)中获得的不同浓度标准品溶液平衡至室温后分别放入上述分析仪中测定,绘制标准曲线。
4)取步骤2)中获得的全血、血清或血浆样本上机进行检测,仪器自动获得该样本血清淀粉样蛋白A的含量。
实施例2含有不同苜蓿皂甙量的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒
一、方法和试剂
1.含有不同苜蓿皂甙量的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂1
血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂1-A:0.2mol/L磷酸盐缓冲液,0.5mol/L氯化钠,0.02%wt ProClin300,0%wt苜蓿皂甙。
血清淀粉样蛋白A测定试剂1-B、C、D、E、F、G、H和I中各组分与试剂1-A相同,除了苜蓿皂甙含量不同,它们分别为0.01%wt苜蓿皂甙、0.02%wt苜蓿皂甙、0.03%wt苜蓿皂甙、0.04%wt苜蓿皂甙、0.05%wt苜蓿皂甙、0.06%wt苜蓿皂甙、0.07%wt苜蓿皂甙和0.08%wt苜蓿皂甙。
2.血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂2:0.2mol/L磷酸盐缓冲液,5%(w/v)抗人血清淀粉样蛋白A抗体乳胶,0.5mol/L氯化钠,1%wt牛血清白蛋白,0.02%wt ProClin300。
3.含有不同胆固醇含量的血清样本制备:在含有20.00mg/L血清淀粉样蛋白A的血清样本中加入不同胆固醇的量,制备成含有0、1、2、5、10g/L胆固醇的溶液。
4、测定
以上配置的九种血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂(试剂1-A,1-B,1-C,1-D,1-E,1-F,1-G,1-H,1-I,各试剂的胆固醇量不同),对含有0、1、2、5、10g/L的胆固醇的血清样本进行检测。
使用实施例1的方法使用试剂盒测定。
二、结果
表1:血清淀粉样蛋白A测定试剂盒中试验结果
Figure BDA0002098197080000041
以上数据可知:试剂1中无苜蓿皂甙时,测定结果明显随着胆固醇含量增加而升高,由最初的20.00mg/L升高到43.57mg/L。试剂1中添加苜蓿皂甙可以明显减少胆固醇的干扰,当苜蓿皂甙含量为0.06%时,胆固醇对测定结果影响基本没有。但当苜蓿皂甙量逐渐增加到0.07%、0.08%时,测定结果明显偏低,显示为副干扰。
实施例3含有不同甘油浓度的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒中试验
一、方法和试剂
1.含有不同甘油浓度的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂1
血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂1:0.2mol/L磷酸盐缓冲液,0.5mol/L氯化钠,0.02%wt ProClin300。
2.含有不同浓度甘油的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂2-A:0.2mol/L磷酸盐缓冲液,5%(w/v)抗人血清淀粉样蛋白A抗体乳胶,0.5mol/L氯化钠,1%wt牛血清白蛋白,0.02%wt ProClin 300;甘油0mmol/L。
血清淀粉样蛋白A测定试剂2-B、C、D、E、F和G中各组分与试剂2-A相同,除了甘油浓度不同,它们分别为1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L和10mmol/L。
3.含有不同胆固醇含量的血清样本制备:在含有20.00mg/L血清淀粉样蛋白A的血清样本中分别加入不同胆固醇的量,配制成含有0、1、2、5、10g/L胆固醇的溶液。
4.测定
以上配制的七种血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂(试剂2-A,2-B,2-C,2-D,2-E,2-F,2-G和2-H,各试剂的甘油浓度不同),对含有0、1、2、5、10g/L的胆固醇的血清样本进行检测。
使用实施例1的方法使用试剂盒测定。
二、结果
表2:血清淀粉样蛋白A测定试剂盒中试验结果
Figure BDA0002098197080000051
以上数据可知:当试剂2中加入不同浓度的甘油时,与2-A中没有加入甘油相比,试剂2-B、2-C、2-D、2-E测定的结果更稳定,而2-F和2-G的测量结果与2-A相比结果更不稳定,变化范围更大。从该实验结果可以看出,当甘油浓度在1-6mmol/L时,测定结果更为稳定,重复性更好。
实施例4含有不同甘油浓度和苜蓿皂甙的血清淀粉样蛋白A测定试剂
一、方法和试剂
1.含有不同甘油浓度和苜蓿皂甙的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂1
血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂3-A:0.2mol/L磷酸盐缓冲液,0.5mol/L氯化钠,0.02%wt ProClin300,0%wt苜蓿皂甙。
血清淀粉样蛋白A测定试剂3-B、C、D、E、F、G、H和I中各组分与试剂3-A相同,除了苜蓿皂甙含量不同,它们分别为0.01%wt苜蓿皂甙、0.02%wt苜蓿皂甙、0.03%wt苜蓿皂甙、0.04%wt苜蓿皂甙、0.05%wt苜蓿皂甙、0.06%wt苜蓿皂甙、0.07%wt苜蓿皂甙和0.08%wt苜蓿皂甙。
2.含有2mmol/L甘油的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂2:0.2mol/L磷酸盐缓冲液,5%(w/v)抗人血清淀粉样蛋白A抗体乳胶,0.5mol/L氯化钠,1%wt牛血清白蛋白,0.02%wt ProClin 300;甘油2mmol/L。
3.含有不同胆固醇含量的血清样本制备:在含有20.00mg/L血清淀粉样蛋白A的血清样本中分别加入不同胆固醇的量,配制成含有0、1、2、5、10g/L胆固醇的溶液。
4.测定
以上配制的九种血清淀粉样蛋白A测定试剂盒测定试剂(试剂3-A,3-B,3-C,3-D,3-E,3-F,3-G,3-H和3-I),对含有0、1、2、5、10g/L的胆固醇的血清样本进行检测。
使用实施例1的方法使用试剂盒测定。
二、结果
表3:血清淀粉样蛋白A测定试剂盒中试验结果
Figure BDA0002098197080000061
以上数据可知:试剂1中无苜蓿皂甙时,测定结果明显随着胆固醇含量增加而升高,由最初的20.00mg/L升高到44.27mg/L。试剂1中添加苜蓿皂甙可以明显减少胆固醇的干扰,当试剂2中添加甘油2mmol/L时,在苜蓿皂甙含量为0.01-0.06%时,胆固醇对测定结果影响基本没有,结果稳定。但当苜蓿皂甙量继续增加时,测定结果不是很稳定
此外,发明人对于试剂2和试剂1中不同物质的量也进行了研究,发现在试剂2中0.1-0.5mol/L磷酸盐缓冲液、4-6%(w/v)抗人血清淀粉样蛋白A抗体乳胶、0.2-0.6mol/L氯化钠、1-3%wt牛血清白蛋白和0.01-0.03%wt ProClin 300;和/或,试剂1中0.1-0.5mol/L磷酸盐缓冲液0.2-0.6mol/L氯化钠和0.01-0.03%wt ProClin300,结果同表1-3中类似。

Claims (8)

1.一种散射比浊法测定血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2;
所述试剂1为含有0.01-0.06%苜蓿皂甙的缓冲液,所述试剂2为包被有4-6%w/v血清淀粉样蛋白A抗体胶乳的颗粒。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂2中包括1-6mmol/L的甘油。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂1还包括如下组分:0.1-0.5mol/L磷酸盐缓冲液,0.2-0.6mol/L氯化钠溶液,0.01-0.03%wt ProClin300。
4.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂2还包括如下组分:0.1-0.5mol/L磷酸盐缓冲液,0.2-0.6mol/L氯化钠,1-3%wt牛血清白蛋白,0.01-0.03%wt ProClin300。
5.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的pH为7.1-7.7。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂1和试剂2体积比为4:1。
7.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2:
所述试剂1包括如下组分:0.2mol/L磷酸盐缓冲液,0.5mol/L氯化钠溶液,0.02%wtProClin 300,0.06%苜蓿皂甙;
所述试剂2包括如下组分:0.2mol/L磷酸盐缓冲液,5%w/v血清淀粉样蛋白A抗体乳胶,0.5mol/L氯化钠,1%wt牛血清白蛋白,0.02%wt ProClin 300,2mmol/L的甘油;
所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
8.如权利要求1-7任一项所述的试剂盒在测定血清、血浆或全血中血清淀粉样蛋白A的应用。
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