CN117031027A - 一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂，所述试剂盒包括：试剂M、试剂R1、试剂R2、校准品；其中，所述试剂M含包被壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体的磁微粒且壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体与磁微粒的质量比不低于1：100；所述试剂R1含阻断剂且阻断剂浓度不低于0.4g/L；所述试剂R2含标记吖啶酯的壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体且壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体与吖啶酯质量比不低于5：1；所述校准品含基质液和壳多糖酶3样蛋白1。本发明制备的试剂盒用于检测血清中的CHI3L1含量，具有高灵敏度、更宽线性范围的优势，可以解决因仪器预稀释样本降低检测通量的缺陷，更利于临床大量样本的筛查。
Description
技术领域
本发明属于生化试剂检测技术领域，具体涉及一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
壳多糖酶3样蛋白1(chitinase 3-like 1,CHI3L1)，又称人软骨糖蛋白39(YK40)，是几丁质酶蛋白家族的一员，是一种分泌型糖蛋白，分子量约40kDa。目前，已有大量的研究证实CHI3L1蛋白在各个人体组织中，肝脏组织中的CHI3L1的表达水平最高。其中肝脏的CHI3L1的表达水平比肾脏高15.3倍，比心脏高276倍。这些数据表明，CHI3L1是肝特异性或高度肝富集基因，从而CHI3L1大量表达。一项98例不同肝纤维化分期(S)肝活组织检查标本的CHI3L1的表达水平比较分析显示：血清CHI3L1表达水平随着肝纤维化程度的增加而增加；在S0和S1患者的CHI3L1蛋白(YKL-40蛋白)水平差异无统计学意义；S0～S1患者组和S2患者组中具有明显的统计学差异；同时发现S2和S3～S4患者的CHI3L1蛋白水平差异亦有统计学意义。因此，血清CHI3L1蛋白水平能够区分与HBV相关的中国纤维化患者的不同肝纤维化阶段，且研究发现CHI3L1对中国HBV相关的晚期肝纤维化的鉴定优于其他的肝纤维化血清标志物透明质酸，三型骨原胶原，层粘连蛋白和四型胶原。
此外，也有研究比较了CHI3L1在丙型肝炎患者α干扰素和利巴韦林治疗前后的变化。在治疗有效患者中，血浆中的CHI3L1的水平与治疗前的比较显著降低；而在治疗无效的患者中，CHI3L1未发生明显变化。因此，CHI3L1的检测有望代替肝脏活组织检查来连续地跟踪抗病毒治疗和抗纤维治疗的疗效。
CHI3L1在肝脏的中高度特异表达，可能直接参与肝纤维化的形成和维持。CHI3L1肝纤维化检测可以辅助诊断病毒性肝炎、酒精性肝硬化和脂肪肝等导致肝纤维化和肝硬化，同时可以更准确的区分肝纤维化的不同时期，对患者进行抗病毒治疗或抗纤维化治疗有一定的指导意义。此外，CHI3L1检测具有无创、便捷的特点，可用于对抗病药物治疗和肝纤维化治疗的疗效进行持续检测和跟踪，减少或替代肝穿刺，大大降低患者的痛苦和风险，降低医疗成本。
当前，在临床上检测血清中的CHI3L1蛋白的试剂盒主要依赖化学发光法、免疫层析技术、酶联免疫法进行测定。基于化学发光法的CHI3L1检测试剂相对酶联免疫法产品具有灵敏度高、特异性强、线性范围广、分析快、全自动化等优点。然而，临床样本中CHI3L1含量主要分布在10～2000ng/mL范围内，已上市的化学发光产品需对检测进行预稀释设置，提前对样本进行10～20倍稀释才能实现高浓度样本的检测，但是通过增加稀释步骤往往会降低仪器检测的通量。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，所述试剂盒包括：试剂M、试剂R1、试剂R2、校准品；
其中，所述试剂M含包被壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体的磁微粒且壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体与磁微粒的质量比不低于1：100；
所述试剂R1含阻断剂且阻断剂浓度不低于0.4g/L；
所述试剂R2含标记吖啶酯的壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体且壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体与吖啶酯质量比不低于5：1；
所述校准品含基质液和壳多糖酶3样蛋白1。
进一步地，所述试剂M中磁微粒粒径为0.2～3.0μm。
进一步地，所述试剂R1中阻断剂为异嗜性抗体阻断剂。
进一步地，所述试剂M、所述试剂R1的组分还包括：pH为5.0～8.0的缓冲液5.0～50.0g/L、无机盐10.0～50.0g/L、表面活性剂1.0～50.0g/L、保护剂100.0～600.0g/L、防腐剂1.0～10.0g/L；
所述试剂R2的组分还包括：pH为6.0～9.0的缓冲液5.0～50.0g/L、无机盐1.0～30.0g/L、表面活性剂1.0～10.0g/L、保护剂50.0～200.0g/L、防腐剂1.0～2.0g/L；
所述基质液的组分包括：pH为7.0～8.0的缓冲液1.0～20.0g/L、牛血清蛋白100.0～500.0g/L、防腐剂1.0～2.0g/L。
进一步地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、Gly缓冲液；
所述无机盐为NaCl、KCl、KH2PO4、CaCl2、MgCl2中的至少一种；
所述表面活性剂为吐温-20、EDTA二钠中的至少一种；
所述保护剂为蔗糖、BSA、酪蛋白中的至少一种；
所述防腐剂为Proclin系列防腐剂。
进一步地，所述试剂盒还包括预激发液、激发液。
一种上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、试剂M的制备：
取磁微粒置于包被缓冲液中，加入EDC，混匀，外加磁场集磁去除上清液，再加入缓冲液，混匀，得活化磁微粒溶液；
取壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体置于包被缓冲液中，混匀，加入上述活化磁微粒溶液，混匀，外加磁场集磁去除上清液，加入终止缓冲液Ⅰ，混匀，得包被壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体的磁微粒溶液；
将包被壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体的磁微粒溶液外加磁场集磁去除上清液，加入清洗液，混匀，外加磁场集磁去除上清液，加入保存缓冲液，混匀，即得试剂M；
其中，包被缓冲液为MES缓冲液；
终止缓冲液Ⅰ由磷酸盐缓冲液、Gly缓冲液、保护剂、表面活性剂、防腐剂混合制备而成；
清洗液由磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂混合制备而成；
保存缓冲液由磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂混合制备而成；
S2、试剂R1的制备：
取阻断剂置于R1稀释液中，混匀，即得试剂R1；
其中，R1稀释液由磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂混合制备而成；
S3、试剂R2的制备：
取吖啶酯置于标记缓冲液中，加入壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体，混匀，在18～30℃条件下避光反应30min；反应结束后加入终止缓冲液Ⅱ，混匀，在18～30℃条件下避光反应30min；将反应产物进行透析，透析完成后加入甘油，过滤，加入R2稀释液，即得试剂R2；
其中，标记缓冲液由磷酸盐缓冲液、无机盐混合制备而成；
终止缓冲液Ⅱ由磷酸盐缓冲液、Gly缓冲液、无机盐混合制备而成；
R2稀释液由磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂混合制备而成。
进一步地，步骤S1中所述EDC溶液浓度为1mg/mL。
进一步地，步骤S3中所述甘油加入量与透析后溶液体积比为1：1；
步骤S3中所述过滤为经过0.22μm滤膜过滤。
进一步地，步骤S3中透析条件：透析液由磷酸盐缓冲液、无机盐混合制备而成，温度2～8℃，每2h更换一次透析液，共透析4次。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过对R1试剂的缓冲体系优化，改善抗体与抗原的亲和性，能同时达到高灵敏度和更宽线性范围的目的，解决了因仪器预稀释样本降低检测通量的缺陷，更利于临床大量样本的筛查；
本发明提供的试剂盒检测的r值均大于0.9990，且实测值与理论值的相对偏倚均在±10％以内，CHI3L1浓度在0.96～2100.00ng/mL范围内具有较好的线性，满足高浓度检测需求；
本发明提供的试剂盒重复性好，在浓度约为70ng/mL和浓度约为850ng/mL的样本中重复检测10次，重复性分别为1.90％、1.63％，均小于10％。
附图说明
图1为本发明实施例1、对比例1制备的试剂盒检测结果对比图；
图2为本发明实施例1、市购试剂盒检测结果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
关键试验材料来源及理化参数：
壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体购于南京佰抗生物科技有限公司。
磁微粒购买于德国JRS药用辅料公司。
吖啶酯购买于上海麦克林生化科技有限公司。
预激发液(货号：H003-01)、激发液(货号：H003-02)由湖南菲科生物技术有限公司提供。
本发明中未对具体原料进行说明均为已经存在物质，可以从市面上直接购买得到。
实施例1
本实施例提供一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，包括M试剂、R1试剂、R2试剂、校准品，具体制备步骤如下：
M试剂制备
M试剂制备中使用的各溶液组分如表1所示：
表1M试剂制备中各溶液组分
1.称取碳化二亚胺(EDC)，用包被缓冲液配制成浓度为1mg/mL的EDC溶液，混匀后避光备用；
2.取40μL的100mg/mL磁微粒(粒径2.8μm)，加入500μL包被缓冲液，震荡混匀后，加入上述EDC溶液140μL，并用包被缓冲液补充至总体积为1mL，震荡混匀后，进行旋转混匀20min，再外加磁场集磁去除上清，往EP管中加入500μL包被缓冲液并震荡混匀，得活化磁微粒溶液；
3.取80μL待包被CHI3L1抗体，加入420μL包被缓冲液中旋转混匀，加入上述活化磁微粒溶液，进行旋转混匀2h，外加磁场集磁去除上清，再向EP管中加入1mL终止缓冲液，旋转混匀2h，得包被CHI3L1抗体的磁微粒溶液；
4.将上述包CHI3L1抗体的磁微粒溶液外加磁场集磁去除上清液，加入1mL清洗液并充分混匀，重复清洗两次，外加磁场集磁去上清液后加入1mL保存缓冲液，充分混匀后备用，即得M试剂。
R1试剂制备
R1试剂制备中溶液组分如表2所示：
表2R1试剂制备中溶液组分
将异嗜性抗体阻断剂加入上表配置的R1稀释液中，制备成含阻断剂浓度为0.5mg/mL的R1试剂。
R2试剂制备
R2试剂制备中各溶液组分如表3所示：
表3R2试剂制备中各溶液组分
1.取270μL吖啶酯标记缓冲液和30μL 1.5mg/mL的CHI3L1抗体，混匀，在18～30℃条件下避光反应30min，待反应结束后加入终止缓冲液200μL，混匀，在18～30℃条件下避光反应30min，得标记吖啶酯的CHI3L1抗体溶液。
2.将上述生物标记吖啶酯的CHI3L1抗体溶液进行透析，每2h换一次透析液，共透析4次，透析完成后按照终体积1：1加入甘油，混匀，用0.22μm滤膜过滤，用R2稀释液进行500倍稀释，即得R2试剂。
校准品制备
校准品中基质液组分如表4所示：
表4校准品中基质液组分
取CHI3L1按照2.00～20.00ng/mL和500.00ng/mL～1000.00ng/mL利用基质液进行稀释，即得校准品。
对比例1
本实施例提供一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其原料和制备方法于实施例1基本相同，区别在于：R1试剂中不含MgCl2·6H2O。
进一步的，为了研究上述制备的各试剂盒的灵敏度，分别对其进行测试，测试方法如下：
利用全自动化学发光分析仪进行测试，取样本10μL，M试剂50μL，R1试剂50μL，R2试剂50μL；先加入样本、M试剂、R1试剂，37℃反应15min，清洗2遍后加入R2试剂，37℃反应10min，清洗4遍后，加预激发液和激发液，测量发光值RLU。使用配套试剂的校准品进行校准，仪器通过校准曲线即可自动计算出样本中CHI3L1的浓度。
具体结果分析如下：
1.线性范围检测
将浓度为2745.85ng/mL样本进行梯度稀释，稀释后的理论浓度如表5所示。在化学发光免疫分析仪上检测配制好的样本，以理论浓度为x轴，实测值为y轴进行线性拟合，并计算相关性r值，以及实测值与理论值的相对偏倚，结果图1所示。
表5试剂线性检测结果(ng/mL)
由表5和图1结果可知：实施例1制备的试剂盒在仪器上检测的r值均大于0.9900，且实测值与理论值的相对偏倚均在±10％以内，该试剂在0.96～2100.00ng/mL范围内具有较好的线性，满足高浓度检测需求；而对比例1制备的试剂盒，在0.96～2100.00ng/mL范围内，检测结果的相关性r值仅为0.9883，相关性较差，在样本浓度大于233.33ng/mL时，样本检测结果偏差大于±10％，线性范围较窄，在不对样本进行预稀释条件下，不能满足对中高浓度样本的准确定量。
2.重复性检测
使用实施例1和对比例1的试剂分别检测样本CV1(浓度约为70ng/mL)和CV2(浓度约为850ng/mL)，各重复检测10次，计算各批次10次测量结果的平均值M和标准差SD，并计算批内重复性，结果如表6所示。
表6三批试剂批内重复性检测结果(ng/mL)
由表6结果可知：实施例1和对比例1检测CV1样本的批内重复性分别为1.90％、2.51％，检测样本CV2的批内重复性分别为1.63％、1.62％，均小于10％。
3.相关性分析
使用实施例1试剂盒与市购的CHI3L1检测试剂盒对182份样本进行检测，分析检测结果相关性、相对偏倚。结果见表7、图2。
表7三种机型Passing-Bablok分析结果表
由表7结果可知，实施例1试剂盒与市购的CHI3L1检测试剂盒检测结果的相关性r值达到0.992，相关性较好；由图2可知，两试剂盒的相对偏倚为0.9920，接近1.0000，具有较好的一致性。
在实际研究中发明人团队通过大量探究发现：试剂M、R1、R2中的缓冲液、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂在符合本发明内容所述数量范围要求内，均能实现对人血清中的CHI3L1的精准检测。
对于本领域生化试剂技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的磁微粒化学发光法所制备的试剂盒，依据本方法学进行的各种技术方案改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：试剂M、试剂R1、试剂R2、校准品；
其中，所述试剂M含包被壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体的磁微粒且壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体与磁微粒的质量比不低于1：100；
所述试剂R1含阻断剂且阻断剂浓度不低于0.4g/L；
所述试剂R2含标记吖啶酯的壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体且壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体与吖啶酯质量比不低于5：1；
所述校准品含基质液和壳多糖酶3样蛋白1。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂M中磁微粒粒径为0.2～3.0μm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中阻断剂为异嗜性抗体阻断剂。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂M、所述试剂R1的组分还包括：pH为5.0～8.0的缓冲液5.0～50.0g/L、无机盐10.0～50.0g/L、表面活性剂1.0～50.0g/L、保护剂100.0～600.0g/L、防腐剂1.0～10.0g/L；
所述试剂R2的组分还包括：pH为6.0～9.0的缓冲液5.0～50.0g/L、无机盐1.0～30.0g/L、表面活性剂1.0～10.0g/L、保护剂50.0～200.0g/L、防腐剂1.0～2.0g/L；
所述基质液的组分包括：pH为7.0～8.0的缓冲液1.0～20.0g/L、牛血清蛋白100.0～500.0g/L、防腐剂1.0～2.0g/L。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、Gly缓冲液；
所述无机盐为NaCl、KCl、KH2PO4、CaCl2、MgCl2中的至少一种；
所述表面活性剂为吐温-20、EDTA二钠中的至少一种；
所述保护剂为蔗糖、BSA、酪蛋白中的至少一种；
所述防腐剂为Proclin系列防腐剂。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预激发液、激发液。
7.一种如权利要求1-6任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、试剂M的制备：
取磁微粒置于包被缓冲液中，加入EDC，混匀，外加磁场集磁去除上清液，再加入缓冲液，混匀，得活化磁微粒溶液；
取壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体置于包被缓冲液中，混匀，加入上述活化磁微粒溶液，混匀，外加磁场集磁去除上清液，加入终止缓冲液Ⅰ，混匀，得包被壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体的磁微粒溶液；
将包被壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体的磁微粒溶液外加磁场集磁去除上清液，加入清洗液，混匀，外加磁场集磁去除上清液，加入保存缓冲液，混匀，即得试剂M；
其中，包被缓冲液为MES缓冲液；
终止缓冲液Ⅰ由磷酸盐缓冲液、Gly缓冲液、保护剂、表面活性剂、防腐剂混合制备而成；
清洗液由磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂混合制备而成；
保存缓冲液由磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂混合制备而成；
S2、试剂R1的制备：
取阻断剂置于R1稀释液中，混匀，即得试剂R1；
其中，R1稀释液由磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂混合制备而成；
S3、试剂R2的制备：
取吖啶酯置于标记缓冲液中，加入壳多糖酶3样蛋白1单克隆抗体，混匀，在18～30℃条件下避光反应30min；反应结束后加入终止缓冲液Ⅱ，混匀，在18～30℃条件下避光反应30min；将反应产物进行透析，透析完成后加入甘油，过滤，加入R2稀释液，即得试剂R2；
其中，标记缓冲液由磷酸盐缓冲液、无机盐混合制备而成；
终止缓冲液Ⅱ由磷酸盐缓冲液、Gly缓冲液、无机盐混合制备而成；
R2稀释液由磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂混合制备而成。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述EDC溶液浓度为1mg/mL。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述甘油加入量与透析后溶液体积比为1：1；
步骤S3中所述过滤为经过0.22μm滤膜过滤。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中透析条件：透析液由磷酸盐缓冲液、无机盐混合制备而成，温度2～8℃，每2h更换一次透析液，共透析4次。
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|---|---|---|---|---|
| CN118022690A (zh) * | 2024-04-11 | 2024-05-14 | 杭州普望生物技术有限公司 | 一种表面修饰磁珠及其制备方法和应用 |
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- 2023-08-14 CN CN202311020761.9A patent/CN117031027A/zh active Pending
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