HUT71930A - Nucleotide sequence encoding carbamoyl phosphate synthetase ii - Google Patents
Nucleotide sequence encoding carbamoyl phosphate synthetase ii Download PDFInfo
- Publication number
- HUT71930A HUT71930A HU9501583A HU9501583A HUT71930A HU T71930 A HUT71930 A HU T71930A HU 9501583 A HU9501583 A HU 9501583A HU 9501583 A HU9501583 A HU 9501583A HU T71930 A HUT71930 A HU T71930A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- gene
- acid molecule
- carbamoyl phosphate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
- C12Y603/05—Carbon-nitrogen ligases with glutamine as amido-N-donor (6.3.5)
- C12Y603/05005—Carbamoyl-phosphate synthase (glutamine-hydrolysing) (6.3.5.5)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány Plasmodium falciparumból származó karbamoil-foszfát-szintetáz ΙΙ-t kódoló nukleotid szekvenciákra, az enzim rekombináns DNS technológiával való előállítási eljárásaira, továbbá ezen szekvenciának és enzimnek a gyógykezelés megtervezésében való felhasználására vonatkozik.
Az utóbbi időben újból sürgető igény merült fel a malária kezelésére alkalmas új kemoterápiás szerek kidolgozása iránt, a hagyományos gyógyszerekre rezisztens • · ·
humán malária paraziták, főként a Plasmodium falciparum evolúciója következtében. A vakcinára irányuló kutatás nagyon kézenfekvő alternatív megoldásnak tűnt, de évekig tartó kísérletezés után klinikailag elfogadható termék a mai napig nem jött létre. Egyidejűleg mind jobban gyengül a moszkitó vektorok elleni inszekticidek hatékonysága is. Az a vélemény alakult ki, hogy jelenleg a világ népességének körülbelül 500 millió ember - több, mint kétharmada maláriás környezetben él (Miller, 1989). A világ tíz leggyakoribb betegségéről (évente 270 millió fertőzés) az Egészségügyi Világszervezet (WHO) által készített jegyzékben a nyolcadik helyen áll és a tíz leghalálosabb betegség közül a kilencedik helyen, évente több, mint 2 millió életet követelve (Cox, 1991; Marshall, 1991). Bár ez a betegség főként a szegény nemzetekre korlátozódik, legújabban azonban fertőzésekről adtak hírt az Egyesült Államokban (Marshall, 1991) és Ausztráliában (Johnson, 1991) és egyre több az utazó-maláriás eset (Steffen és Behrens, 1992).
A P. falciparum malária parazitának és gazdaszervezetének összehasonlító biokémiai vizsgálata több anyagcsere folyamatban különbségeket tárt fel. Ilyen különbség, hogy a parazita kizárólag de novo pirimidin szintézisre támaszkodik, mivel képtelen a már meglévő pirimidineket felhasználni (Sherman, 1979). Ugyanakkor az érett humán vörösvérsejtnek, ismereteink szerint, nincs szüksége pirimidin nukleotidokra (Gero és O'Sullivan, 1990). A legnagyobb erőfeszítések a pirimidin bioszintetikus folyamat inhibitorainak kifejlesztésére irányultak (Hammond et al., 1985; Scott et al. , 1986: Prapunwattana et al., 1988; Queen et al., 1990; Krungkrai et al., 1992), és ezek a vizsgálatok igazolták, hogy az inhibitoroknak helye lehet a kemoterápiában. A kulcs pirimidin enzimek molekuláris biológiájának jelenlegi kutatását hatásos eszközként tartjuk számon nemcsak a parazita biokémiájának jobb megértése szempontjából, hanem hogy speciális különbségeket kutasson fel a parazita és emlős enzimek között.
Az eukarióta szervezetek de novo pirimidin bioszin• · «
tetizáló folyamatában a glutamin-függő karbamoil-foszfátszintetáz (CPSII, EC 6.3.5.5) katalizálja az elsőként végbemenő, sebesség-korlátozó lépést (Jones, 1980). Ezenkívül, mivel egy olyan komplex reakciót katalizál, amelyben három katalitikus egység és számos szubsztrátum és közbenső termék szerepel, igen érdekes enzim a biokémiai szempontból való tanulmányozásra. Mivel a CPSII-nek más pirimidin enzimekkel való szerkezeti rokonsága a különböző szervezetekben különbözik, ezért jó alanya az evolúciós kutatásoknak is.
A malária tenyészetekből kapható anyag szűkössége eddig akadályozta a megfelelő mennyiségű tiszta protein izolálását analízis céljára. A CPS tisztításának nehézségét tovább növelte az instabilitása. A P. berghei-ből (rágcsáló malária) készített nyers kivonat tanulmányozása során egy nagy molekulatömegű proteint különítettek el, amely CPS aktivitást fejtett ki és feltételezték, hogy kapcsolatban az az ATCázzal (Hell et al., 1981), élesztőben ugyanezt a helyzetet észlelték (Makoff és Radford, 1978). A Kungrai és munkatársai (1990) által legújabban végzett vizsgálatok azonban külön CPSII és ATCáz aktivitást mutattak ki a P. bergheiben. Jóllehet a CPS aktivitást a P. falciparum-ban is kimutatták (Reyes et al., 1982), azonban ezen tanulmány előtt nem volt utalás sem a méretére, sem más enzimekkel való kapcsolatára az anyagcsere folyamatban.
A CPSII glutamin-függő aktivitását két lépésre bonthatjuk: (I) glutamináz (GLNáz) reakció, amely hidrolizálja a glutamint (Gin) és az ammóniát átviszi a karbamoil-foszfát-szintetáz lépéshez; és (2) szintetáz reakció, amelyben karbamoil-foszfát szintetizálódik két molekula adenozin-trifoszfátból (ATP), hidrogén-karbonátból és ammóniából. A második aktivitásban három rész-reakció vesz részt; (a) az ATP aktiválja a hidrogén-karbonátot; (b) az aktivált formájú karboxi-foszfát reagál az ammóniával, hogy karbamát keletkezzék; és (c) a karbamát ATP-függő módon foszforilálódik és így karbamoil-foszfát keletkezik (Powers és Meister, 1978). Tehát a CPSII-ben két fő dómén található,
a glutamin amido-transzferáz dómén (GAT) és a karbamoil-foszfát-szintetáz dómén (CPS) vagy egyszerűen szintetáz dómén. A glutamináz dómén (GLNáz) a GAT szubdoménje, míg a szintetáz dómén két ATP-kötő szubdomént tartalmaz.
A CPS glutamin amidotranszferáz doménjének más amidotranszferázokkal való hasonlósága miatt feltételezték, hogy ezek az alegységek egy közös ősi gén ( = 20 kD) - amely a GLNáz doménnek felel meg - eltérő evolúciója eredményeként keletkeztek, és hogy a CPS GAT dómén (= 42 kD; amely a vélt szerkezeti domént tartalmazza és csak a CPS-ben van jelen) sajátos evolúciójában szerepelnie kellett más szekvenciákkal való fúzióknak és/vagy inszercióknak (Werner et al., 1985). Az emlős CPSI GAT génnel kapcsolatban felvetették, hogy egy egyszerű gén-fúzió révén keletkezett, amikor ezen ősi gén 5' végén - egy ismeretlen génnel fuzionált (Nyunoya et al., 1985).
A különböző szervezetek nagyobb szintetáz doménjeit meghatározó génekkel kapcsolatban feltételezték, hogy egy ősi kináz génnel génduplikáció ment végbe, amely két homológ félből álló polipeptidet eredményezett (Simmer et al., 1990). Felvetették, hogy az E.coli alegység szerkezetétől és az élesztő arginin-specifikus CPS-étől eltérően, a magasabbrendű eukariótákban a GAT-ot és a szintetáz doméneket kódoló gének további fúziója révén alakult ki a pirimidin bioszintézisére specifikus egyedi gén. Viszont Simmer és munkatársai (1990) feltételezték, hogy az arginin-specifikus CPS-ek (mint élesztőben a cpal és cpa2), valamint a patkány mitokondriális CPSI a pirimidin kimérából defúzió révén keletkezett.
A jelen feltalálók a P. falciparum-ból származó CPSII enzimet kódoló teljes gént izoláltak és jellemeztek (pfCPSII). Ismertették cDNS szekvenciáját, az 5' és 3' nem transzlatált szakaszokkal együtt. Ennek során azonosították a megfelelő glutamináz és szintetáz doméneket. Ellentétben az élesztőben, D. discoideum-ban és emlősökben lévő CPSII génnel, nincs bizonyíték a rákövetkező enzimmel, az aszpartát-transzkarbamoilázzal (ATCáz-zal) való kapcsola• · · «
tára. Ez ellentétben áll Hill és munkatársai (1981) közlésével a P.berghei-ből származó enzimeket illetően. A jelen feltalálók azonban két nagy inszertumot találtak a természetes P.falciparum génben, amelyeket - úgy tűnik - még nem írtak le.
Fentiek alapján a találmány első eleme egy olyan nukleinsav (ns) molekulára vonatkozik, amely a Plasmodium falciparum eredetű karbamoil-foszfát-szintetáz ΙΙ-t kódolja, és ez a nukleinsav molekula lényegében az 1. táblázat szerinti alábbi szekvenciákat foglalja magában: 1-7176 ns, vagy 1-750 ns, vagy 751-1446 ns, vagy 1447-2070 ns, vagy 2071-3762 ns, vagy 3763-5571 ns, vagy 5572-7173 ns, vagy 13360 ns, vagy 2071-6666 ns, vagy 2071-7173 ns, vagy egy funkcionálisan egyenértékű szekvenciát.
A találmány egy előnyös kiviteli alakjában a nukleinsav molekula magában foglalja az 1. táblázat szerinti -1225 7695 nukleinsav szekvenciát vagy egy funkcionálisan egyenértékű szekvenciát.
A találmány második elemét egy izolált polipeptid képezi, amely lényegében egy 1. táblázat szerinti aminosavszekvenciát tartalmaz, éspedig: 1-2391 aminosav (as), vagy 483-690 as, vagy 691-1254 as, vagy 1858-2391 as, vagy 1-1120 as, vagy 691-2222 as, vagy 691-2391 as.
Ebben a leírásban a funkcionálisan egyenértékű kifejezés alatt azt értjük, hogy a nukleinsav szekvenciában lévő csekély változások - a kód degenerá1tsága következményeként - nem hoznak létre más polipeptidet kódoló szekvenciát.
A találmány harmadik elemét a Plasmodium falciparum karbamoil-foszfát-szintetáz II előállítására szolgáló eljárás képezi, amely eljárás abból áll, hogy egy, a találmány első elemét képező nukleinsav molekulával transzformált sejtet olyan körülmények között tenyésztünk, amelyek lehetővé teszik a nukleinsav szekvencia kifejeződését és a kifejezett karbamoil-foszfát-szintetáz ΙΙ-t kinyerjük.
A sejtek vagy bakteriális vagy eukarióta sejtek lehet- 6 nek. Előnyösnek tartjuk például az E.coli, élesztő és Dictyostelium discoideum sejteket.
Azok, akik ezen a szakterületen jártasak, könnyen belátják, hogy a CPSII nukleotid szekvenciájának a felderítése számos terápiás szer előállítását teszi lehetővé. Ezek a szerek lehetnek antiszensz nukleotidok, ribozimok és olyan szerek, amelyekkel az RNS és DNS szekvenciákat lehet megcélozni más megoldások révén, például triplex (triplex helix) képzéssel.
Az 1. táblázatban bemutatott szekvenciát figyelembevéve, látható, hogy a Plasmodium falciparum CPSII gén két olyan beépült szekvenciát tartalmaz, amelyet más karbamoilfoszfát-szintetáz gének nem tartalmaznak. Az első beépült szekvencia a valószínű szerkezeti domént és a glutamináz domént választja el, míg a második beépült szekvencia a szintetáz két ATP kötő szubdoménját, a CPSa és CPSb alegységet választja el.
f
| 1. táblázat A Plasmodium falciparum-ból származó karbamoil-foszfát- -szintetáz II gén nukleotid szekvenciája és az ebből levezetett aminosavszekvencia | - | |
| -1225 | • · · · · · GAATTCCTTCAGCCAAAAAAAATGACAACGCAAATTTTAAGAAAAGAAAAACAATCGACT | -1166 |
| -1165 | • · · · · · CGTCTTTGAATGAGGTTAGAAATTCGATACGTGAAAGGGACTTAAGAAGGCTTAACAGAG | -1106 |
| -1105 | • · · · · · AAAAGAGTAAAATCTTATAAGCATTTGAAGGAAAAAATAATAAAATAAAAAAATAAAAAG | -1046 |
| -1045 | • · · · · · ATAAAAAATATTTATATTTGATATGTAGTATATATAATGATTATTCATATTAATAACATA | -986 |
| -985 | • · · · · · GATAAAAAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTATATTTATTAACAATACATTTAAGTTA | -926 |
| -925 | • « * · · · · TTTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATGTTTGTGTGTTCAT | -866 |
| -865 | • · · · · · TTGTTTATAAAATTACTTGAAATATAAAACTTATTAATATATTTCCAATTAATATGAATA | -806 |
| -805 | • · · · · · CAATTATTAATATTTTGATGTGTACACATTAATATAGTTTTACACTTCTTATAATAAAAC | -746 |
| -745 | • · · · · · CATCCTATATATTATACACAATATATAATACTCCCCAATATTGTGGTTCCTATAATTTTA | -686 |
| -685 | • · · · · · TTTATATATTTATTTATTAATTTATTCATTTATTTATTTTTTTTCTTAGTTTATAAAATA | -626 |
| -625 | • · · · · · GTAATTCTACTAATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAATT | -566 |
| -565 | • · · · · · TACATATGAAAAATGAACTTGTATATGTAAATTTATAAATATTTTAAACATAAATATAAA | -506 |
| -505 | • · · · · · TGTATAAAAAAAAAAAAGAAAAATGGGAAAAAATAATATAGATATATATATAAATATATA | -446 |
| -445 | • · · · · · TATATATATAATTATTGGGGATATTCTCTGAATCATAGGTCTTAAACAGTTTTATTCTTT | -386 |
| -385 | • · · · · · TAACATCACAAAGTTGTTATTAAAAGTATATATATCTTATTGGTTCCTATATAAAACTAT | -326 |
| -325 | • · · · · · AGTATTCTATAATATATTCTGTATATTTCATTTTATCATTTGTAAGCAATCCCTATTTAT | -266 |
| -265 | • · · · · · TATAATTATTATTTTTTTTTTTATAAAAGAGGTATAAAACAGTTTATTCAATTTTTTTCC | -206 |
| -205 | • · · · · · TAAAGGAGCAACCTTCAGTCAATTTACATTTTCCACCGGTTGGTTGGCACAACATAATGT | -146 |
| -145 | • · · · · · TACAGCTAAAAAAAGAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATATATAT | -86 |
| -85 | • · · · · · ATATATATATATATACATAATATGTACAATGCTACCATACAAGTATATAAATTTTTCAAC | -26 |
| -25 | • · ATTGTTGTGATGTTGCATTTTTCTT | -1 |
····
1. táblázat (folytatás) i « · · · · ·
ATGTATATTTCTTTTAAATATAATTTATATATATATATATATATATATATATATATATTT 60
MYISFKY NLYIYIYIYIYIF 20 • « · · · ·
GTTCTTATAGATTTTAAAACAGTTGGGAGGTTAATTCTTGAAGATGGTAACGAATTTGTA 120
VLIDFKTVGRLILEDGNEFV 40 • · · · · ·
GGGTACAGTGTAGGTTACGAAGGGTGTAAAGGAAATAATAGTATATCATGTCATAAGGAG 180
GYSVGYEGCKGNNSISCHKE 60 • · * · · ·
TATAGAAATATTATTAATAATGATAATAGCAAGAATAGTAATAATTCATTTTGTAATAAT 240
YRN1INNDNSKNSNNSFCNN 80 ···«··
GAAGAAAACAATTTGAAAGATGATTTATTATATAAAAATAGTCGATTAGAAAATGAAGAT' 300
EENNLKDDLLYKNSRLENED 100 · · · · ·
TTTATTGTTACAGGTGAAGTTATATTTAATACAGCTATGGTTGGATATCCTGAAGCTTTA 360
FIVTGEVIFNTAMVGYPEAL 120
ACGGACCCAAGTTATTTTGGTCAAATATTAGTTTTAACATTTCCTTCTATTGGTAATTAT 420
TDP5YFGQILVLTFPSIGNY 140
GGTATTGAAAAAGTAAAACATGATGAAACGTTTGGATTAGTACAAAATTTTGAAAGTAAT 480
GIEKVKHDETFGLVQNFE'SN 160 ······
AAAATTCAAGTACAAGGTTTAGTTATTTGTGAATATTCGAAGCAATCATATCATTACAAT 540
KIQVQGLVICEYSKQSYHYN 180
TCTTATATTACCTTAAGTGAATGGTTAAAGATTTATAAAATTCCATGTATAGGTGGTATA 600
SYITLSEWLKIYKIPCIGGI 200
GATACAAGAGCCTTAACAAAACTTTTAAGAGAAAAAGGTAGTATGTTAGGTAAAATAGTT 660
DTRALTKLLREKGSMLGKIV 220 ······
ATATATAAAAACAGACAACATATTAATAAATTATATAAAGAAATTAATCTTTTTGATCCT 720 IYRNRQHINKLYKEINLFDP 240
GGTAATATAGATACTCTAAAATATGTATGTAATCATTTTATACGTGTTATTAAGTTGAAT 780 GNIDTLKYVC NHF I R V I RLN 260
1. táblázat (folytatás)
840
280
1020
340
960
320
900
300
1021 AATTGTAATTTTAGTAATAGTAGTGATAAAAATGATTCTTTTTTTAAGTTATATGGTATA1080
341 NCNFSNSSDKNDSFFKLYGI360
1081 TGTGAATATGATAAATATTTAATTGACCTTGAAGAAAATGCTAGCTTTCATTATAATAAT1140
361 CEYDKYLI DL EENASFHYNN380
1141 GTAGATGAATATGGATATTATGATGTTAATAAAAATACAAATATTCTATCTAATAATAAA 1200
381 V D E Y G YYDVNKNTNILSNNK 400
| 1201 401 | • · · · · · ATAGAACAAAACAACAATAACGAAAATAAC AAAAATAACAAAAATAACAACAATAACGAG 1260 IEONNNNENNKNNKNNNNNE 420 |
| 1261 421 | • · · · · · GTTGATTATATAAAGAAAGATGAGGATAATAATGTCAATAGTAAGGTCTTTTATAGCCAA 1320 VDYIKKDEDNNVNSKVFYSO 440 |
| 1321 441 | « · · · · · TATAATAATAATGCACAAAATAATGAACATACCGAATTTAATTTAAATAATGATTATTCT 1380 YNNNAONNEHTEFNLNNDYS 460 |
| 1381 461 | • · · · · · ACTTATATTAGAAAGAAAATGAAAAATGAAGAATTCCTTAATTTGGTAAACAAAAGAAAA 1440 TYIRKKMKNEEFLNLVNRRK 480 |
| 1441 481 | • · · · · · GTAGACCATAAAGAAAAAATTATTGTTATTGTTGATTGTGGTATTAAAAATAGTATAATC 1500 VDHKEKIIVIVDCGIKNSTT 500 |
| 1501 501 | • · · · · · AAAAATTTAATAAGACACGGTATGGATCTTCCATTAACATATATTATTGTACCTTATTAT 1560 KNLIRHGMDLPLTYIIVFYY 520 |
• ·
1. 'táblázat (folytatás) • · · · · ·
TACAATTTTAATCATATAGATTATGATGCAGTTCTTTTATCTAATGGTCCTGGAGATCCT 1620
YNFNHIDYDAVLLSNGPGDP 540
| AAAAAGTGTGATTTCCTTATAAAAAATTTGAAAGATAGTTTAACAAAAAATAAAATTATA KKCDFLI KNLKDSLTKNKI I | 1680 560 |
| • · · · · · TTTGGTATTTGTTTAGGTAATCAACTATTAGGTATATCATTAGGTTGTGACACATATAAA FGICLGNQLLGISLGCDTYK | 1740 580 |
| • · · · · · ATGAAATATGGTAATAGAGGTGTTAATCAACCCGTAATACAATTAGTAGATAATATATGT MKYGNRGVNQPVIQLVDNIC | 1800 600 |
| «····· TACATTACCTCACAAAATCATGGATACTGTTTAAAGAAAAAATCAATTTTAAAAAGAAAA YITSQNBGYCLKKKSILKRK | 1860 620 |
| ······ GAGCTTGCGATTAGTTATATAAATGCTAATGATAAATCTATAGAAGGTATTTCACATAAA ELAISYINANDKSIEGISHK | 1920 640 |
| ······ AATGGAAGATTTTATAGTGTCCAGTTTCATCCTGAGGGTAATAATGGTCCTGAAGATACA NGRFYSVQFHPEGNNGPEDT | 1980 660 |
| ····»· TCATTTTTATTTAAGAATTTTCTTTTAGATATCTTTAATAAGAAAAAACAATATAGAGAA SFLFKNFLLDIFNKKKQYRE | 2040 680 |
| ······ TATTTAGGATATAATATTATTTATATAAAAAAGAAAGTGCTTCTTTTAGGTAGTGGTGGT YLGYNII YIKKKVLLLGSGG | 2100 700 |
| • · · · « · TTATGTATAGGACAAGCAGGAGAATTCGATTATTCAGGAACACAAGCAATTAAAAGTTTA LCIGQAGEFDYSGTQAIKSL | 2160 720 |
| ······ AAAGAATGTGGTATATATGTTATATTAGTTAATCCTAACATAGCAACTGTTCAAACATCA KECGIYVILVNPNIATVQTS | 2220 740 |
2221
741
AAAGGTTTGGCAGATAAGGTATACTTTTTACCAGTTAATTGTGAATTTGTAGAAAAAATT
2280
760
2281
761
ATTAAAAAGGAAAAACCTGATTTTATTTTATGTACATTTGGTGGTCAGACAGCTTTAAAT
2340
780 • ·
1. táblázat (folytatás) • · · · · . ·
2341 TGTGCTTTAATGTTAGATCAAAAAAAAGTATTGAAAAAGAATAATTGTCAATGTTTAGGT2400 .781 CALMLD QKKVLKKNNCQCLC800 • · · · · . ·
2401 ACATCTTTAGAATCTATAAGAATAACAGAAAATAGAACATTATTTGCTGAAAAATTAAAA2460
801 T S L E S I R I T E N R T L ,F A E K L X820 • · · · · ·
2461 GAAATTAATGAAAGAATAGCTCCATATGGTAGTGCAAAAAATGTTAATCAAGCTATTGAT 2520
821 E I Ν E R I A P Y G S A K Ν V N Q A I D 840
2521 ATAGCTAATAAAATAGGATATCCAATATTAGTACGTACAACATTTTCGTTAGGAGGATTA 2580
841IANKIGYPILVRTTFSLGGL 860 • · · · · ·
2581 AATAGTAGTTTCATAAATAATGAAGAAGAACTTATCGAAAAATGTAATAAAATATTTTTA 2640
861NSSFINNEEELIEKCNKIFL 880 • · · · · ·
2641 CAAACTGATAATGAAATATTTATAGATAAATCATTACAAGGATGGAAAGAAATAGAATAT 2700 881 Q T D Ν E I F I D K S L Q G W K E I E Y 900 • · · · · ·
2701 GAATTATTAAGAGATAATAAAAATAATTGTATAGCTATATGTAATATGGAAAATATAGAT 2760
901ELLRDNKNNCIAICNMENID 920 • · · · · ·
2761 CCATTAGGTATACATACAGGAGATAGTATAGTTGTTGCACCTTCACAAACATTAAGTAAT2820
921 PLGIHTGDSIVVAPSQTLSN940 • · · · ··
2821 TATGAATATTATAAATTTAGAGAAATAGCATTAAAGGTAATTACACATTTAAATATTATA2880
941 YEYYKFRE IALKVITHLNII960 • · · · ··
2881 GGAGAATGTAATATACAATTTGGTATAAATCCACAAACAGGAGAATATTGTATTATTGAA2940
961GECNIQFGINPQTGEYCIIE 980 • · · · · ·
2941 GTTAATGCTAGGCTTAGTAGAAGTTCAGCATTAGCTTCTAAAGCTACTGGTTATCCACTT 3000 981VNARLSRS SALASKATGYPL 1000
3001 GCTTATATATCAGCAAAAATAGCCTTGGGATATGATTTGATAAGTTTAAAAAATAGCATA3060
1001 AYISAKIALGYDLISLKNSI1020
3061 ACTAAAAAAACAACTGCCTGTTTTGAACCCTCTCTAGATTACATTACAACAAAAATACCA3120
1021 TKKTTACFEPSLDYITTKIP1040
| 3121 1041 | 1. táblázat (folytatás) • · · · · · CGATGGGATTTAAATAAATTTGAGTTTGCTTCTAATACAATGAATAGTAGTATGAAAAGT 3180 RWDLHKFEF. ASNTHNSSHKS 1060 |
| 3181 1061 | **···· GTAGGAGAAGTTATGTCTATAGGTAGAACCTTTGAAGAATCTATACAAAAATCTTTAAGA 3240 VGEVMSIGRTFEESIQKSLB 1080 |
| 3241 1081 | • · · · · · TGTATTGATGATAATTATTTAGGATTTAGTAATACGTATTGTATAGATTGGGATGAAAAG 3300 CIDDNYLGFSNTYCIDWDEK 1100 |
| 3301 1101 | ······ AAAATTATTGAAGAATTAAAAAATCCATCACCAAAAAGAATTGATGCTATACATCAAGCT 3360 kiieelknpspkridaihqa 1120 |
| 3361 1121 | ······ TTCCATTTAAATATGCCTATGGATAAAATACATGAGCTGACACATATTGATTATTGGTTC 3420 FHLNMPMDKIHELTHIDYWF 1140 |
| 3421 1141 | • · · · · · TTACATAAATTTTATAATATATATAATTTACAAAATAAGTTGAAAACGTTAAAATTAGAG 3480 LHKFYNI YNLQNKLKTLKLE 1160 |
| 3481 1161 | CAATTATCTTTTAATGATTTGAAGTATTTTAAGAAGCATGGTTTTAGTGATAAGCAAATA 3540 QLSFNDLKYFKKHGFSDKQI 1180 |
| 3541 1181 | GCTCACTACTTATCCTTCAACACAAGCGATAATAATAATAATAATAATAATATTAGCTCA 3600 AHYLSFNTSDNNNNNNNISS 1200 |
| 3601 1201 | • · · · · · TGTAGGGTTACAGAAAATGATGTTATGAAATATAGAGAAAAGCTAGGATTATTTCCACAT 3660 CRVTENDVMKYREKLGLFPH 1220 |
| 3661 1221 | • · * . * * * f ATTAAAGTTATTGATACCTTATCAGCCGAATTTCCGGCTTTAACTAATTATTTATATTTA 3720 IKVIDTL SAEFPALTNYLYL 1240 |
| 3721 1241 | • · .... ACTTATCAAGGTCAAGAACATGATGTTCTCCCATTAAATATGAAAAGGAAAAAGATATGC 3780 τ v q r. q F H DVLPLNMKRKKIC 1260 |
| 3781 1261 | • · · · · · ACGCTTAATAATAAACGAAATGCAAATAAGAAAAAAGTCCATGTCAAGAACCACTTATAT 3840 TLNNKRNANKKKVHVKNHLY 1280 |
| 3841 1281 | • · · · · · AATGAAGTAGTTGATGATAAGGATACACAATTACACAAAGAAAATAATAATAATAATAAT 3900 NEVVDDKDTOLHKENNNNHN 1300 |
......... •**···· ·
-43- ·.> : ··:: : .· ·· ·♦· ·♦ ·· ♦
1. táblázat (folytatás) .·····
ATGAATTCTGGAAATGTAGAAAATAAATGTAAATTGAATAAAGAATCCTATGGCTATAAT 3960 MNSGNVENKCKLHKESYGYN 1320
| • · · · · · AATTCTTCTAATTGTATCAATACAAATAATATTAATATAGAAAATAATATTTGTCATGAT NSSNCINTNNINIENNICHD | 4020 1340 |
| ······ ATATCTATAAACAAAAATATAAAAGTTACAATAAACAATTCCAATAATTCTATATCGAAT ISINKNIKVTINNSNNSISN | 4080 1360 |
| «····· AATGAAAATGTTGAAACAAACTTAAATTGTGTATCTGAAAGGGCCGGTAGCCATCATATA NENVETNL N CVSERAGSHH I | 4140 1380 |
| · · · _ · « TATGGTAAAGAAGAAAAGAGTATAGGATCTGATGATACAAATÁTTTTAAGTGCACAAAAT YGKEEKS IGSDDTNILSAON | 4200 1400 |
| • · · · · · TCAAATAATAACTTTTCATGTAATAATGAGAATATGAATAAAGCAAACGTTGATGTTAAT SNNNFSCNNENMNKANVDVN | 4260 1420 |
| ······ GTACTAGAAAATGATACGAAAAAACGAGAAGATATAAATACTACAACAGTATTTATGGAA VLENDTKKREDINTTTVFME | 4320 1440 |
| ······ GGTCAAAATAGTGTTATTAATAATAAGAATAAAGAGAATAGTTCTTTATTGAAAGGTGAT gonsvinnknkenssllkgd | 4380 1460 |
| • · · · · « GAAGAAGATATTGTGATGGTAAATTTAAAAAAGGAAAATAATTATAATAGTGTAATTAAT eedivmvnlkkennynsvin | 4440 1480 |
| • · · · · · AATGTAGATTGTAGGAAAAAGGAÍATGGATGGAAAAAATATAAATGATGAATGTAAAACA nvdcrkkdmdgknindeckt | 4500 1500 |
| • · · · · · TATAAGAAAAATAAATATAAAGATATGGGATTAAATAATAATATAGTAGATGAGTTATCC YKKNKYKDMGLNNNIVDEL S | 4560 1520 |
| • · · · · · AATGGAACATCACATTCAACTAATGATCATTTATATTTAGATAATTTTAATACATCAGAT NGTSHSTNDHLYL DNFNTSD | 4620 1540 |
| • · · · · · GAAGAAATAGGGAATAATAAAAATATGGATATGTATTTATCTAAGGAAAAAAGTATATCT EEIGNNKNMDMYLSKEKSIS | 4680 1560 |
• · ·
1. táblázat (folytatás) ······
AATAAAAACCCTGGTAATTCTTATTATGTTGTAGATTCCGTATATAATAATGAATACAAA 4740 NKNPGNSYYVVDSVYNNEYK 1580 • · · · · ·
ATTAATAAGATGAAAGAGTTAATAGATAACGAAAATTTAAATGATGAATATAATAATAAT 4800
INKMK ELIDNENLNDEYNNN 1600 • · · · · ·
GTTAATATGAATTGTTCTAATTATAATAATGCTAGTGCATTTGTAAATGGAAAGGATAGA 4860 VNMNCSNYNNASAFVNGKDR 1620 • · · · · ·
AATGATAATTTAGAAAATGATTGTATTGAAAAAAATATGGATCATACATACAAACATTAT 4920 NDNLENDCIEKNMDHTYKHY 1640
AATCGTTTAAACAATCGTAGAAGTACAAATGAGAGGATGATGCTTATGGTAAACAATGAA 4980 NRLNNRRSTNERMMLMVNNE 1660
AAAGAGAGCAATCATGAGAAGGGCCATAGAAGAAATGGTTTAAATAAAAAAAATAAAGAA 5040
KESNHEKGHRRNGLNKKNKE 1680
AAAAATATGGAAAAAAATAAGGGAAAAAATAAAGACAAAAAGAATTATCATTATGTTAAT 5100 KNMEKNKGKNKDKKNYHYVN 1700
CATAAAAGGAATAATGAATATAATAGTAACAATATTGAATCGAAGTTTAATAATTATGTT 5160 HKRNNEYNSNNIESKFNNYV 1720
| GATGATATAAATAAAAAAGAATATTATGAAGATGAAAATGATATATATTATTTTACACAT ddinkkeyyedendiyyfth | 5220 1740 |
| ······ TCGTCACAAGGTAACAATGACGATTTAAGTAATGATAATTATTTAAGTAGTGAAGAATTG SSOGNNDDLSNDNYLSSEEL | 52B0 1760 |
| ······ AATACTGATGAGTATGATGATGATTATTATTATGATGAAGATGAAGAAGATGACTATGAC ntdeydddyyydedeeddyd | 5340 1780 |
| • · · · · · GATGATAATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGGGGAGGATGAGGAGGATAATGAT DDNDDDDDDDDDGEDEEDND | 5400 1800 |
TATTATAATGATGATGGTTATGATAGCTATAATTCTTTATCATCTTCAAGAATATCAGAT 5460 YYNDDGYDSYNSLS SSRISD 1820
1. táblázat (folytatás)
-1S< a · ·
5461 GTATCATCTGTTATATATTCAGGGAACGAAAATATATTTAATGAAAAATATAATGATATA5520
1821 VSSVIYSGNENIFWEKYNDI1840
5521 GGTTTTAAAATAATCGATAATAGGAATGAAAAAGAGAAAGAGAAAAAGAAATGTTTTATT5580
1841 GFKIIDNRNEKEKEKKK C F I1860
5581 GTATTAGGTTGTGGTTGTTATCGTATTGGTAGTTCTGTAGAATTTGATTGGAGTGCTATA5640
1861 VLGCGCYRIGSSVEFDVSAI1880
5641 CATTGTGTAAAGACCATAAGAAAATTAAACCATAAAGCTATATTAATAAATTGTAACCCA5700
1881 HCVKTIRKLNHKAILINCNP1900 • · · · · · ·
5701 GAAACTGTAAGTACAGATTATGATGAAAGTGATCGTCTATATTTTGATGAAATAACAACA ‘ 5760
1901 ETVSTDYDESDRLYFDEITT 1920 • · · · · ·
5761 GAAGTTATAAAATTTATATATAACTTTGAAAATAGTAATGGTGTGATTATAGCTTTTGGT 5820
1921 EVIKFIYNFENSNGVIIAFG 1940 • · · · · ·
5821 GGACAAACATCAAATAATTTAGTATTTAGTTTATATAAAAATAATGTAAATATATTAGGA 5880
1941 GQTSNNLVFSLYKN N V N I L G 1960 • · · · · ·
5881 TCAGTGCACAAAGTGTTGATTGTTGTGAAAATAGGAATAAATTTTCGCACTTATGTGATT5940
1961 SVHKVLIVVKIGINFRTYVI1980 • · · · · ·
5941 CTTAAAATTGATCAACCGAAATGGAATAAATTTACAAAATTATCCAAGGCTATACAATTT6000
1981 LKIDQPKWNKFTKLSKAIQF2000
6001 GCTAATGAGGTAAAATTTCCTGTATTAGTAAGACCATCGTATGTATTATCTGGTGCAGCT6060
2001 ANEVKFPVLVRPSYVLSGAA2020 • · · · ··
6061 ATGAGAGTTGTAAATTGTTTTGAAGAATTAAAAAACTTTTTAATGAAGGCAGCTATTGTT6120
2021 HRVVNCFEELKNFLMKAAI V2040 • · · · ·a
6121 AGTAAAGATAATCCTGTTGTAATATCAAAATTTATTGAGAATGCTAAAGAAATAGAAATA6180
2041 SKDNPVVISKFIENAKEIE I2060 • · · · aa
6181 GATTGTGTTAGTAAAAATGGTAAAATAATTAATTATGCTATATCTGAACATGTTGAAAAT6240
2061 DCVSKHGKIINYAISEHVEN2080 • · · ·
1. táblázat (folytatás) • ·· ·
-1G6241 GCTGGTGTACATTCAGGTGATGCAACATTAATATTACCTGCACAAAATATATATGTTGAA6300
2081 AGVHSGDATL ILPAQNIYVE2100 • · · · · ·
6301 ACACATAGGAAAATAAAGAAAATATCCGAAAAGATTTCAAAATCATTAAATATATCTGGT6360
2101 THRKIKKISEKISKSLNISG2120 • · · · · ·
6361 CCATTTAATATACAATTTATATGTCATCAAAATGAAATAAAAATTATTGAATGTAATTTA6420
2121 PFNIQFICHQNEIKIIECNL2140 • * · · · «.
6421 AGAGCATCTAGAACTTTTCCATTTATATCAAAAGCTCTAAATCTAAACTTTATAGATTTA6480
2141 RASRTFPFISKALNLNFIDL2160 • · · · ··
6481 GCTACAAGGATATTAATGGGTTATGACGTCAAACCAATTAATATATCATTAATTGATTTA6540
2161 ATRILMGYDVKPINISLIDL2180
6541 GAATATACAGCTGTAAAAGCACCGATTTTCTCATTTAATAGATTACATGGATCAGATTGT6600
2181 EYTAVKAPIFSFNRLHGSDC2200 ······
6601 ATACTAGGTGTAGAAATGAAATCTACAGGTGAAGTAGCATGTTTTGGTTTAAATAAATAT6660
2201 ILGVEMKSTGEVACFGLNKY2220
6661 GAAGCTTTATTAAAATCATTAATAGCTACAGGTATGAAGTTACCCAAAAAATCAATACTT 6720
2221 EALLKSLIATGMKLPKKSIL 2240 • · · · · ·
6721 ATAAGTATTAAAAATTTAAATAATAAATTAGCTTTTGAAGAACCGTTCCAATTATTATTT 6780
2241 ISIKNLNNKLAFEEPFQLLF 2260 «·····
6781 TTAATGGGATTTACAATATATGCGACTGAAGGTACGTATGATTTCTACTCTAAATTTTTA 6840
2261 LMGFTIYATEGTYDFYSKFL 2280 ······
6841 GAATCTTTTAATGTTAATAAAGGTTCTAAATTTCATCAAAGACTTATTAAAGTTCATAAT6900
2281 ESFNVNKGSKFHQRLIKVHN2300 ······
6901 AAAAATGCAGAAAATATATCACCAAATACAACAGATTTAATTATGAATCATAAAGTTGAA6960
2301 KNAEN1SPNTTDLIMNHKVE2320
6961 ATGGTTATTAATATAACTGATACATTAAAAACAAAGGTTAGTTCAAATGGTTATAAAATT7020
2321 MVINITDTLKTKVSSNGYKI2340 ·· ·· ···· • · · · * •·» · · · 'ΑΤΙ. táblázat (folytatás) ······
7021 AGAAGATTAGCATCAGATTTCCAGGTTCCTTTAATAACTAATATGAAACTTTGTTCTCTT 2341 R RLASDFQVPL ITNMKLCSL.
* · · · · · ·
7081 TTTATTGACTCATTATATAGAAAATTCTCAAGACAAAAGGAAAGAAAATCATTCTATACC
2361 FIDSLYRKFSRQKERKSFYT • · * ·
7141 ATAAAGAGTTATGACGAATATATAAGTTTGGTATAA
2381 IKSYDEYISLV* ······
7177 GCAAGAAATTATTCAATAAATTCGATTTAACATTACTTATTTATGTATTTATTAACTTTC • · · · · · · 7237 ATTCCATAACAACATGAAAAGTATAAATATATAAATAGTAATATATAATATATAATATAT ·«····
7297 ATATATATATATATATATATATTTATTTATTTAATTATATTTACGTTTAAATATTAATAA ······
7357 ATGTTTTTATTAAATATGATCATTAATTTATATTGATTTATTTTTTTATAAATTTTTGTT ······
7417 ATATATACAAATTTTATTTATTCACTCATATGTATAAACCAAAATGGTTTTTTCAATTTA ······
7477 CAAATAATTTTATAATTTTAATAAATTTATTAATTATAAAAAAAATAAAAATATATAAAC ······
7537 ATTAAAATGTATAAATTCTTTTAATTATATAATAATTTATAAATGTTATGATTTTTTTAA ······
7597 AAAATTCAACGAAAAAAAAGAGGAACTGTATATACAAAAGGGACTATATATATGTATATA • · ·
7657 TATATATATATATATATGTTTTTTTTTCCTTATTCTAGA 7695
7080
2360
7140
2380
7176
2392
7236
7296
7356
7416
7476
7536
7596
7656
A GAT dómén két szubdoménbő1 tevődik össze: egy valószínű szerkezeti doménből (1-750) és egy glutamináz doménből (1447-2070). Ezt a két szubdomént választja el egy első beépült szekvencia (751-1446, aláhúzva). A szintetáz alegység két ATP kötő szubdoménjét a CPSa-t (2071-3762) és a CPSb-t (5572-5173) egy második beépült szekvencia (37635571, aláhúzva) választja el.
• « · ·
- 18 Minthogy ezek a beépült szekvenciák más karbamoil-foszfát-szintetáz génben nem találhatók meg, az olyan terápiák elsődleges célpontjai közé tartoznak, amelyeket de nem kizárólag antiszensz nukleotidokkal, ribozírnokkal és a triplex képző nukleotidokkal végeznek, ugyanis csökken a káros reakciók valószínűsége a gazdával homológ génnel.
Ismeretes, hogy antiszensz RNS molekulák a sejten belül hasznosan szabályozzák a gén expressziót. A CPSII szekvenciából elő lehet állítani olyan antiszensz RNS molekulákat, amelyek komplementerek a CPSII egy részével (részeivel). Ezeket az antiszensz molekulákat vagy diagnosztikai szondákként használhatjuk annak meghatározására, hogy tartalmaz-e CPSII gént a sejt vagy nem; vagy használhatjuk gyógyszerként a CPSII gén expressziójának szabályozására. A CPSII szekvencia használatával előállított antiszensz nukleotidok közé tartoznak azok a nukleotidok, amelyek komplementerek a CPSII mRNS-sel és képesek in vivő ennek funkcióját zavarni és azok a gének, amelyek olyan CPSII szekvencia elemeket tartalmaznak, amelyek az élő sejtben antiszensz nukleotidokká íródhatnak át. A gének tartalmazhatnak promoter elemeket messzendzser RNS-ből (polimeráz II), sejtekből, vírusokból, patogénekből vagy strukturális RNS génekből (polimer I és III) vagy szintetikus promoter elemeket. Antiszensz molekulák tervezéséről ad áttekintést a Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (R.R. Erickson és J.G. Izant, Raven Press, 1992) című kiadvány. Referenciának tekintjük az 5,208,149 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, amely további példákkal szolgál az antiszensz nukleotidok tervezéséhez. Ezen referenciák tartalmát ebben a leírásban referenciának tekintjük.
Ebben a leírásban a nukleotidok kifejezés minden természetben előforduló dezoxiribonukleotid és ribonukleotid, valamint nukleotid analóg oligomerre vonatkozik, ugyanakkor nemcsak ezekre korlátozódik. Nukleotid analógoknak tekintünk minden olyan vegyületet, amelyek más nukleotidokkal, például metil-foszfonátokkal vagy foszfor··♦· · · * ·ι> «·ν · • · · · « · « w • · ··· · · · ♦ · · · · · · ·· ··· 4· «,> *
- 19 tionátokkal szekvencia specifikus komplexeket (például duplexeket vagy heteroduplexeket) képesek alkotni, de amelyek kedvezőbb diffúziós vagy stabilitási tulajdonságokkal rendelkezhetnek. A nukleotidok olyan természetes vagy analóg bázisokból állnak, amelyeket foszfodiészter kötések, peptid kötések vagy bármilyen más kovalens kötés kapcsol össze. Ezeknek a nukleotidoknak minden kombinációja in vivő élő sejtekben, in vitro enzimes vagy kémiai úton szintetizálható.
A ribozimok, amelyek a CPSII gén expressziójának szabályozásában használhatók, olyan nukleotidokat tartalmaznak, amelyek a CPSII mRNS in vitro vagy in vivő hasításához specifikus és katalitikus doménekkel rendelkező CPSII szekvenciát tartalmaznak. A katalitikus domének kalapácsfejeket, hajtűket, delta-vírus elemeket, riboszomális RNS intronokat tartalmaznak és ezek származékait. A ribozimok szerkesztéséhez további információk találhatók a következő közleményekben: Haselhoff és W.L. Gerlach, Natúré, 334. 585 (1988); K. Kruger, P.J. Grabowski, A.J. Zaug, J. Sands, D.E. Gottschling és T.R. Cech, Cell, 31, 147 (1982); valamint a WO 88/04300 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben és a 4,987,071 számú és 5,254,678 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban. A hivatkozott közlemények és szabadalmi leírások tartalmát referenciáknak tekintjük. A katalitikus elemek fokozhatják egy CPSII cél mRNS mesterséges szabályozását azáltal, hogy gyorsítják a degradációt vagy néhány más mechanizmust.
A hármas helix oligonukleotidok a genomból való transzkripció gátlására használhatók. Mivel a találmány szerint a CPSII gén szekvencia adott, ezzel lehetségessé vált olyan oligonukleotidok tervezése, amelyek triplexeket képeznek, és ezáltal gátolni fogják a CPSII gén transzkripcióját. A triplex képzésre alkalmas nukleotidok előállításával kapcsolatos információk megtalálhatók Griffin és munkatársai egy közleményében [Science, 245. 967-971 (1989)], és e közleményt referenciának tekintjük.
Triplex képző elem minden olyan nukleotid, amely képes ·«·· ····
- 20 a CPSII génhez kötődni úgy, hogy komplexet alkot a DNS-sel vagy kromatinnal. A kölcsönhatás egy háromszálú Hoogsteen szerkezet képződése révén jöhet létre vagy más mechanizmusok révén, ilyen például a szál bevitel, ami a CPSII szekvencia információn alapul.
Tehát a találmány negyedik eleme egy olyan ribozimra vonatkozik, amely képes a karbamoil-foszfát-szintetáz II mRNS hasítására, és ez a ribozim a találmány első eleme szerinti nukleinsav molekulából kapott mRNS részeivel komplementer szekvenciákat tartalmaz.
A találmány ezen elemének egy előnyös kiviteli alakjában a ribozim a találmány első eleme szerinti nukleinsav molekula első vagy második beépült szekvenciájából kapott mRNS-sel komplementer szekvenciákat tartalmaz.
A találmány ötödik elemét egy olyan antiszensz oligonukleotid képezi, amely a találmány első eleme szerinti nukleinsav molekula expresszióját képes blokkolni.
Az előbbiekben megállapítottuk, hogy a találmány a CPSII előállításának rekombináns technológiával történő megvalósítására vonatkozik. Az ezzel az eljárással előállított protein és a találmány szerinti polipeptidek használhatók lesznek más anti-malária gyógyszerek kidolgozására irányuló munkában, in vitro gyógyszer kötődési vizsgálatokban.
Annak érdekében, hogy a találmány lényegét világosabban megértessük, leírjuk a P. falciparum CPSII gén klónozásának módszerét az alábbi példában és az ábrán.
Példa
Az olyan gének esetén, amelyeknek az aminosavszekvenciáját még nem határozták meg, elfogadott módszer a heterológ szondákkal, azaz a szoros rokonságban lévő szervezetekből származó cél-enzim gén fragmentumainak használatával való szűrés. Ez a módszer számos Plasmodium falciparum-mal foglalkozó kutató számára eredménytelennek bizonyult, ami nagyrészt annak tudható be, hogy a P. falciparum genomjában szokatlanul magas az A-T tartalom. A
P. falciparum-ból a CPSII gén izolálására irányuló kezdeti eredménytelen próbálkozásokat - amelyekben az élesztő ura2 gén fragmentumát használták (Souciet et al., 1989) követően mi azt a megoldást választottuk, hogy polimeráz láncreakció (PCR) ( Saiki et al., 1988) használatával sokszoroztuk a CPSII gén egy részét azzal a szándékkal, hogy a sokszorozott terméket szondaként használjuk a szűréshez.
A CPS gén aminoterminális GAT doménjének és a szintetáz dómén első felének az állandó szekvenciája alapján tervezett oligonukleotidok használatával izoláltuk és klónoztuk a PCR terméket. A nukleotid szekvenálás megerősítette, hogy a CPS gén egy részét kaptuk meg. A teljes parazita DNS-t restrikciós enzimmel fragmentáltuk, s ezeket Southern módszerrel analizáltuk CPSII-specifikus gén szonda segítségével. Meghatároztuk a gén szondához hibridizáló DNS fragmentumok méretét, majd a megfelelő sávokban lévő DNS-t használtuk egy mini-gyűjtemény” elkészítéséhez. Ilyen módon egy kisebb klón populációt szűrtünk pfCPSII génre.
A teljes hosszúságú pfCPSII gén izolálása céljából mini-gyűjtemény sorozatot készítettünk az ismert szekvencia különböző szegmentumainak felhasználásával, hogy információt szerezzünk az ismeretlen határszakaszokról, a gén 5' és 3' irányában, gene-walking segítségével. Az alkalmazott stratégiát az 1. ábrán foglaltuk össze.
Az első Southern analízishez a teljes P. falciparum DNS-t HindiII-mai és EcoRI-gyel emésztettük és a hibridizálást a pfCPSII 453 bp méretű PCR terméke használatával végeztük. A 3,0 kb méretű Hindin és a kisebb EcoRI fragmentum hibridizált a szondához. Ezután egy HindlII pTZ18U mini-gyűjteményt szűrtünk, amelynek eredményeképpen olyan rekombináns kiónt izoláltunk, amely egy 3,0 kb hosszú pfCPSII gén fragmentumot - CPS2 - tartalmazott. A 453 bp méretű PCR termék e szegmentum közepén helyezkedett el.
A CPS2 5' és 3' végét használtuk mindkettő két végével szomszédos szekvenciák izolálására, hogy megkapjuk a további ··
- 22 génszekvenciákat. A CPS2 5' végéről egy HindlIÍ/EcoRI fragmentum volt az eszköze egy további, 1,5 kb méretű fragmentum - CPSI - izolálásának, amely a gén teljes 5' szakaszából és néhány nem kódoló szekvenciából állt.
Egy 550 bp méretű inverz PCR (IPCR; Triglia et al., 1988) terméket kaptunk a CPS2 3' végénél lévő ismert szekvenciák segítségével.
Ezt az IPCR terméket használtuk a CPS2-t határoló 3' szakasz szűréséhez. Egy 3,3 kb hosszú, Hindin rekombináns kiónt, valamint egy ehhez kapcsolt 3,3 kb méretű, CPS3-at tartalmazó Xbal kiónt (az 1. ábrán nem látható) izoláltunk a mini-gyűjtemény technikával. A CPS3 3' végéről származó 200 bp hosszú Xbal/HindlII fragmentum használatával egy 1,3 kb méretű Xbal szegmentumot, a CPS4-et, klónoztunk, amely a vélt stop kodont és néhány 3' nem-kódoló szakaszt tartalmazott.
Ezen négy gén fragmentum (CPSI, CPS2, CPS3 és CPS4) kombinációja - kihagyva az átfedő részeket - összesen 8,8 kb hosszat tesz ki, amelyből körülbelül 7,0 kb-t tesznek ki a kódoló és 1,8 kb-t a határoló szekvenciák.
A P. falciparum CPSII génjének teljes nukleotid szekvenciáját, 5' és 3' szekvenciáival együtt, az 1. táblázat mutatja be.
A szakember könnyen belátja, hogy ennek a génnek az izolálása és szekvenálása egy sor új utat nyit meg a Plasmodium falciparum fertőzés kezelése számára. A találmány lehetővé teszi a Plasmodium falciparum karbamoil-foszfátszintetáz II enzim nagyobb mennyiségben való előállítását rekombináns DNS technológia használatával. Az enzim jellemzése elősegítheti kemoterápiás szerként való használatát.
A gén izolálása révén lehetővé válik olyan antiszensz molekulák, ribozimok vagy más olyan gén inaktiváló anyagok előállítása, amelyeket fel lehet használni a fertőzött egyénekben a parazita szaporodásának megakadályozására.
A szakterületen jártasak számára belátható, hogy az ismertetett speciális megvalósítási alakok mellett a
- 23 találmány számos változatban és/vagy módosítással kivitelezhető anélkül, hogy a találmány szellemétől vagy tartalmától - amelyet nagy vonalakban írtunk le - eltérnénk. A kiviteli alakok tehát minden vonatkozásban szemléltetést és nem korlátozást jelentenek.
• ·
- 24 Irodalmak
Cox, F.E.G. (1991) Malaria vaccines: while we are waiting. Parasitology Today Ίι 189-190
Gero, A.M. and O'Sullivan, W.J. (199)) Purines and pyrimidines in malarial parasites. Blood Cella 16: 467498
Hammond, D. J. Burchell, J.R. and Pudney, M. (1985) Inhibition of pyrimidine biosynthesis de novo in Plasmodium falciparum by 2. (4.t-butylcyclohexyl)-3hydroxy-1, 4-naphthoquinine in vitro. Mól. Biochem.
Párásítói 14: 97-109
Hill, B., Kilsby, J. Rogerson, G.W., Mclntosh, RT. and Ginger, C.D. (1981). The Enzymes of pyrimidine biosynthesis in a rangé of parasitic protozoa and helminths. Mól. Biochem. Párásítói. 2.: 123-134.
Johnson, C. Malaria back to plague us, Sydney Morning Héráid, November 13, 1991.
Jones, M.E. (1980) Pyrimidine nucleotide biosynthesis in animals: genes, enzymes and regulation of UMP biosynthesis. Annu. Rév. Biochem. 45.; 253-279.
Krungkrai, J. Cerami, A. and Henderson, G.B. (1990) Pyrimidine biosynthesis in parasitic protozoa;
purification of a monofunctional dihydroorotase from *
Plasmodium berghei and Crithidia fasciculata. Biochemistry
22.: 6270-6275.
Krungkrai, J. Krungkrai, S.R. and Phakanont, K. (1992) Antimalarial activity of orotate analogs that inhibit dihydrootase and dihydroorotate dehydrogenase. Biochem. Pharmacol. £2: 1295-1301.
Marshal, E. (1991) Malaria parasite gaining ground against science. Science 2: 190·
Nyunoya, H., Broglie, K.E., Widgren, W.E. and Lusty C.J. (1985) Characterization and derivation of the gene coding fór mitochondrial carbamyl phosphate synthetase I of tat. J. Bioi. Chem. 260: 9346-9356.
• · ·· • · · ~2SPrapunwattana, P., O'Sullivan, W.J. and Yuthavong, Y. (1988) Depression of Plasmodium fa1ciparúm dihydroorotate dehydrogenase activity in in vitro culture by tetracycline. Mól. Biochem. 22« 119-124.
Queen, S.A., Vander Jagt, D.L. and Reyes, P. (1990) In vitro susceptibilities of Plasmodium falciparúm to compounds which inhibit nucleotide metabolism. Antimicrob. Agents Chemother. 34: 1393-1398.
Reyes, P., Rathod, P.K., Sanchez, D.J. Mrema, J.E.K., Rieckmann, K.H. and Heidrich, H.G. (1982) Enzymes of purine and pyrimidine metabolism from the humán malaria parasite, Plasmodium falciparum. Mól. Biochem. Párásítói. 5: 275-290.
Rubino S.D., Nyunoya, H. and Lusty, C.J. (1986) JBC 221(24):11320-11327.
Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf,
S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis K.B. and Erlich H.A. (1988) Science 239:487-491.
Scott, H.V., Gero, A.M. and O'Sullivan, W.J. (1986) In vitro inhibition of Plasmodium falciparum by pyrazofurin, an inhibitor of pyrimidine biosynthesis de novo. Mól. Biochem. Párásítói. 18: 3-15.
Sherman, I.W. (1979) Biochemistry of Plasmodium (malarial parasites) Microbiol'. Rév. £3.: 453-495.
Simmer, J.P., Kelly, R.E., Rinker, Jr., A.G.,
Scully, J.L. and Evans D.R. (1990) Mammalian carbamyl phosphate synthetase (CPS). J. Bioi. Chem 265: 1039510402.
Simmer, J.P., Kelly, R.E., Austin, G.R., Jr., Scully, J.L. and Evans, D.R. (1990) JBC 222(18):10395-10402.
Souciet, J.L., Nagy, M., Le Gouar, M., Lacroute, F. and Potier, S. (1989) Gene (Amst.) 22.: 59-70.
Triglia, T., Peterson, M.G. and Kemp, D.J. (1988) PNAS 2fi,:8186.
Werner, H., Feller, Λ. and Pierard, A. (1985) Nucleotide sequence of yeast gene CPA1 encoding the small subunit of arginine-pathway carbamoyl-phosphate synthetase. Eur. J. Biochem. 146: 371-381.
Claims (9)
- Szabadalmi igénypontok1. Nukleinsav molekula, amely a Plasmodium falciparum karbamoil-foszfát-szintetáz ΙΙ-t kódolja vagy ennek egy része, a nukleinsav molekula lényegében az 1. táblázatban bemutatott szekvenciát tartalmaz, amely az 1-7176 vagy az 1-750 vagy a 751-1446 vagy az 1447-2070 vagy a 2071-3762 vagy a 3763-5571 vagy az 5572-7173 vagy az 1-3360 vagy a 2071-6666 vagy a 2071-7173 maradékokból áll, vagy egy funkcionálisan egyenértékű szekvenciát.
- 2. Egy 1. igénypont szerinti nukleinsav molekula, amelyben a nukleinsav molekula egy, az 1. táblázat szerinti -1225-től 7695-ig terjedő szekvenciát vagy egy funkcionálisan egyenértékű szekvenciát tartalmaz.
- 3. Egy izolált polipeptid, a polipeptid egy, lényegében az 1. táblázatban bemutatott aminosav szekvenciát tartalmaz, amely az 1-2391, 483-690, 691-1254, 1858-2391, 1-1120, 6912222 vagy a 691-2391 maradékból áll.
- 4. Eljárás Plasmodium falciparum karbamoil-foszfátszintetáz II-nek vagy egy részének az előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. vagy a 2. igénypont szerinti nukleinsav molekulával transzformá1t sejtet olyan körülmények között tenyésztünk, amelyek lehetővé teszik a nukleinsav szekvencia kifejeződését, majd a kifejeződött karbamoil-foszfát-szintetáz ΙΙ-t kinyerjük.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejt E.coli vagy élesztő vagy Dictyostelium discoideum.
- 6. Egy ribozim, amely a karbamoil-foszfát-szintetáz II mRNS-t képes elhasítani és a ribozim az 1. vagy a 2. igénypont szerinti nukleinsav molekulából kapott mRNS- 28 részeivel komplementer szekvenciákat tartalmaz.
- 7. Egy 6. igénypont szerinti ribozim, ahol a ribozim az1. vagy a 2. igénypont szerinti nukleinsav első vagy második beépült szekvenciájából kapott mRNS részeivel komplementer szekvenciákat tartalmaz.
- 8. Egy antiszensz oligonukleotid, amely az 1. vagy a 2. igénypont szerinti nukleinsav molekula expresszióját képes blokkolni.
- 9. Egy polinukleotid szerkezet, amely egy sejtben az 5. vagy a 6. igénypont szerinti ribozimot vagy a 7. igénypont szerinti antiszensz oligonukleotidot állítja elő.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPL620692 | 1992-12-03 | ||
| AUPL638092 | 1992-12-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9501583D0 HU9501583D0 (en) | 1995-08-28 |
| HUT71930A true HUT71930A (en) | 1996-02-28 |
Family
ID=25644386
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9501583A HUT71930A (en) | 1992-12-03 | 1993-12-02 | Nucleotide sequence encoding carbamoyl phosphate synthetase ii |
| HU95P/P00284P HU211526A9 (en) | 1992-12-03 | 1995-06-20 | Nucleotide sequence encoding carbamoil phosphate synthetase ii. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00284P HU211526A9 (en) | 1992-12-03 | 1995-06-20 | Nucleotide sequence encoding carbamoil phosphate synthetase ii. |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5849573A (hu) |
| EP (1) | EP0675958A4 (hu) |
| JP (1) | JPH08503607A (hu) |
| KR (1) | KR950704495A (hu) |
| CN (1) | CN1041535C (hu) |
| AP (1) | AP429A (hu) |
| BR (1) | BR9307584A (hu) |
| CA (1) | CA2150572A1 (hu) |
| FI (1) | FI952697A (hu) |
| HU (2) | HUT71930A (hu) |
| IL (1) | IL107845A0 (hu) |
| MX (1) | MX9307662A (hu) |
| MY (1) | MY109022A (hu) |
| NO (1) | NO952175L (hu) |
| OA (1) | OA10163A (hu) |
| PL (1) | PL309261A1 (hu) |
| WO (1) | WO1994012643A1 (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6468765B1 (en) * | 1995-04-21 | 2002-10-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Selected Haemophilus influenzae Rd polynucleotides and polypeptides |
| AU3984497A (en) * | 1996-08-16 | 1998-03-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Phenotypic conversion of cells mediated by external guide sequences |
| US6610478B1 (en) | 1996-08-16 | 2003-08-26 | Yale University | Phenotypic conversion of cells mediated by external guide sequences |
| EP1082414A1 (en) * | 1998-06-01 | 2001-03-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Carbamoyl phosphate synthase homolog |
| CN100510079C (zh) * | 2001-04-04 | 2009-07-08 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 恶性疟原虫蛋白基因 |
| CN100510080C (zh) * | 2001-04-04 | 2009-07-08 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 恶性疟原虫新的抗原候选基因PfMAg |
| CN1316015C (zh) * | 2001-08-03 | 2007-05-16 | 味之素株式会社 | 新突变型氨甲酰磷酸合成酶以及生产由氨甲酰磷酸衍生的化合物的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5585479A (en) * | 1992-07-24 | 1996-12-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA |
-
1993
- 1993-12-01 AP APAP/P/1994/000607A patent/AP429A/en active
- 1993-12-02 JP JP6512592A patent/JPH08503607A/ja not_active Ceased
- 1993-12-02 US US08/446,855 patent/US5849573A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-12-02 CA CA002150572A patent/CA2150572A1/en not_active Abandoned
- 1993-12-02 WO PCT/AU1993/000617 patent/WO1994012643A1/en not_active Application Discontinuation
- 1993-12-02 PL PL93309261A patent/PL309261A1/xx unknown
- 1993-12-02 EP EP94900652A patent/EP0675958A4/en not_active Ceased
- 1993-12-02 HU HU9501583A patent/HUT71930A/hu unknown
- 1993-12-02 KR KR1019950702245A patent/KR950704495A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-12-02 MY MYPI93002571A patent/MY109022A/en unknown
- 1993-12-02 BR BR9307584-7A patent/BR9307584A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-12-02 IL IL10784593A patent/IL107845A0/xx unknown
- 1993-12-03 MX MX9307662A patent/MX9307662A/es unknown
- 1993-12-03 CN CN93121697A patent/CN1041535C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-01 NO NO952175A patent/NO952175L/no unknown
- 1995-06-02 OA OA60671A patent/OA10163A/en unknown
- 1995-06-02 FI FI952697A patent/FI952697A/fi not_active Application Discontinuation
- 1995-06-20 HU HU95P/P00284P patent/HU211526A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1041535C (zh) | 1999-01-06 |
| BR9307584A (pt) | 1999-08-31 |
| JPH08503607A (ja) | 1996-04-23 |
| CA2150572A1 (en) | 1994-06-09 |
| NO952175D0 (no) | 1995-06-01 |
| AP9400607A0 (en) | 1994-01-31 |
| MX9307662A (es) | 1994-06-30 |
| FI952697A0 (fi) | 1995-06-02 |
| WO1994012643A1 (en) | 1994-06-09 |
| OA10163A (en) | 1996-12-18 |
| EP0675958A1 (en) | 1995-10-11 |
| MY109022A (en) | 1996-11-30 |
| EP0675958A4 (en) | 1997-10-22 |
| KR950704495A (ko) | 1995-11-20 |
| NO952175L (no) | 1995-06-01 |
| HU211526A9 (en) | 1995-11-28 |
| US5849573A (en) | 1998-12-15 |
| FI952697A (fi) | 1995-07-14 |
| CN1090327A (zh) | 1994-08-03 |
| AP429A (en) | 1995-11-09 |
| IL107845A0 (en) | 1994-04-12 |
| HU9501583D0 (en) | 1995-08-28 |
| PL309261A1 (en) | 1995-10-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113631708B (zh) | 编辑rna的方法和组合物 | |
| EP4008784A1 (en) | Guide rna for targeted-editing with functional base sequence added thereto | |
| Postel et al. | Human NM23/nucleoside diphosphate kinase regulates gene expression through DNA binding to nuclease-hypersensitive transcriptional elements | |
| CA2117903C (en) | Targeted cleavage of rna using eukaryotic ribonuclease and external guide sequence | |
| CN113939591A (zh) | 编辑rna的方法和组合物 | |
| EP1212416A2 (en) | Nucleic acid based modulators of gene expression | |
| Miller et al. | Stereoselective excision of thymine glycol from oxidatively damaged DNA | |
| Ishchenko et al. | Characterisation of new substrate specificities of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae AP endonucleases | |
| US20040009510A1 (en) | Allosteric nucleic acid sensor molecules | |
| JP2004147666A (ja) | ヌクレオチド三リン酸およびリボザイム内へのそれらの取り込み | |
| Makarova et al. | Structure of human DNA polymerase iota and the mechanism of DNA synthesis | |
| WO1998043993A2 (en) | Nucleic acid catalysts | |
| JPH1052264A (ja) | Ｎ‐ｒａｓ発現阻害剤およびその方法 | |
| US8008471B2 (en) | Nucleic acids for inhibiting hairless protein expression and methods of use thereof | |
| US6482932B1 (en) | Nucleoside triphosphates and their incorporation into oligonucleotides | |
| HUT71930A (en) | Nucleotide sequence encoding carbamoyl phosphate synthetase ii | |
| Browne et al. | The sequence specificity of a mammalian DNA methylase | |
| Maley et al. | A tale of two enzymes, deoxycytidylate deaminase and thymidylate synthase | |
| JP7133856B2 (ja) | 細胞内在性のｄｎａ修飾酵素を利用して標的化したｄｎａの核酸塩基を特異的に変換する、細胞の核酸配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体 | |
| AU669413B2 (en) | Nucleotide sequence encoding carbamoyl phosphate synthetase II | |
| US6183996B1 (en) | Nucleotide sequence encoding carbamoyl phosphate synthetase II | |
| WO2003089650A2 (en) | Allosteric nucleic acid sensor molecules | |
| US7060455B1 (en) | Broad specificity DNA damage endonuclease | |
| US7148044B1 (en) | Nucleic acid enzyme for RNA cleavage | |
| CN116981773A (zh) | 用于编辑靶标rna的多聚腺苷酸化信号序列的指导rna |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |