JPH08503607A - カルバモイルリン酸シンターゼ▲ｉｉ▼をコードするヌクレオチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのカルバモイルリン酸シンターゼIIをコードするヌクレオチド配列を提供する．カルバモイルリン酸シンターゼIIは新規なビリミジン生合成経路において，最初の関連律速工程を触媒する．Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにはピリミジン類を利用する能力がなく，もっぱら新たなピリミジンの合成に依存している．しかしながら，成熟ヒト赤血球にはピリミジンヌクレオヂドの認められた要求がない．したがって，この酵素は化学療法の優れた標的を提供する 本発明は，カルバモイルリン酸シンターゼIIをコードする配列のカルバモイルリン酸シンターゼIIの組み換え技術による製造のための使用，ならびにこの配列から設計されるアンチセンス分子，リボザイムおよび他の遺伝子不活性化物質に関する．

Description

【発明の詳細な説明】 カルバモイルリン酸シンターゼIIをコードするヌクレオチド配列 本発明は，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原 虫）のカルバモイルリン酸シンターゼIIをコードするヌクレオチド配列に関し， また組み換えＤＮＡ技術を用いるこの酵素の製造方法，および治療薬の設計にお けるこの配列および酵素の使用に関する． マラリアの処置のための新規化学療法剤の設計の緊急性が旧来の薬剤に対して 抵抗性を示すヒトマラリア寄生虫，主として熱帯熱マラリア原虫の進化により， 最近，再燃している．ワクチンの研究は極めて妥当な別法と思われるが，長年の 研究にもかかわらず今日まで臨床的に許容される製品には到達していない．同時 に運び手の蚊に対する殺虫剤の効果にも低下の進行が認められる．現在，地球上 の人口の３分の２以上に相当する約５億人がマラリア地域に住んでいると考えら れている（Ｍｉｌｌｅｒ，１９８９）．この疾患は，世界保健機構（ＷＨＯ）に よる世界で最も流行している十大疾患リストの第８位にランクされ（１年間の感 染者２億７０００万例），また最も死亡者の多い十大疾患の９位にランクされ， １年に２００万の人命が奪われている（Ｃｏｘ，１９９１：Ｍａｒｓｈａｌｌ， １９９１）．主として貧困な民族に限られてはいるが，最近では，アメリカ合衆 国（Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９１），およびオーストラリア（Ｊｏｈｎｓｏｎ， １９９１）における感染，さらには旅行者のマラリアの症例がなお増加を続けて いること（Ｓｔｅｆｆｅｎ ＆ Ｂｅｈｒｅｎｓ，１９９２）も報告されている． マラリア寄生虫，Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍとその宿主の間には，その比較生 化学的研究によって，多くの代謝経路における差異が明らかにされている．この ような差異の一つは，この寄生虫にはあらかじめ形成されたピリミジン類を利用 する能力がなく，もっぱら，新たなピリミジンの合成に依存していることである （Ｓｈｅｒｍａｎ，１９７９）．しかも，成熟ヒト赤血球には，ピリミジンヌク レオチドの認められた要求がない（Ｇａｒｏ ＆ Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）．これ までに多くの努力が，ピリミジンの生合成経路のインヒビターの開発に向けられ てきて（Ｈａｍｍｏｎｄら，１９８５：Ｓｃｏｔｔら，１９８６：Ｐｒａｐｕｎ ｗａｔｔａｎａら，１９８８：Ｑｕｅｅｎら．１９９０：Ｋｒｕｎｇｋｒａｉら ， １９９２），その化学療法の標的としての可能性が確認されている．鍵となるピ リミジン酵素に関する最近の分子生物学的研究は，寄生虫の生化学をよりよく理 解するためのみでなく，寄生虫と哺乳類の酵素の間の特異的な差異を探り出すた めの強力な手段として期待される． グルタミン−依存性カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＰＳII，ＥＣ６．３． ５．５）は，真核生物の新規なピリミジン生合成経路における最初の関連律速工 程を触媒する（Ｊｏｎｅｓ，１９８０）．しかも，この酵素は３つの触媒単位と 数種の基質および中間体が関与する複合反応を触媒することから，生化学的見地 からもその研究に著しい興味がもたれる酵素である．ＣＰＳIIと他のピリミジン 酵素の構造相関は生物間で変動し，これは進化の研究にも良い課題になる． マラリアの培養液から得ることができる物質の量は極めて少なく，これが分析 に適当な量の純粋なタンパク質の単離を妨害してきた．ＣＰＳの精製の困難性は その固有の不安定性によってもさらに増大している．Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ（囓歯 類マラリア）からの粗抽出液を用いた研究によって，ＣＰＳ活性を含有する高分 子量のタンパク質が明らかにされ．これはＡＴＣアーゼと会合したものと推測さ れていた（Ｈｉｌｌら，１９８１）．このような状況は酵母でも見出されていた （Ｍａｒｋｏｆｆ ＆ Ｒａｄｆｏｒｄ，１９７８）．しかしながら，Ｋｒｕｎｇ ｋｒａｉと共同研究者ら（１９９０）による最近の分析ではＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ 中に分離されたＣＰＳIIおよびＡＴＣアーゼ活性が検出された．Ｐ．ｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ中にＣＰＳ活性は検出されてはいた（Ｒｅｙｅｓら，１９８２）が， この最近の研究に至るまで，そのサイズについてもまたその経路における他の酵 素との連関についても，全く指示はなかったのである． ＣＰＳIIのグルタミン−依存活性は２つの工程に分けることができる．すなわ ち，（１）グルタミン（Ｇｌｎ）を加水分解してアンモニアをカルバモイルリン 酸シンターゼの部位に移送するグルタミナーゼ（ＧＬＮアーゼ）反応と，（２） ２分子のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ），炭酸水素塩およびアンモニアからカル バモイルリン酸を合成するシンテターゼ反応である 第二の活性には３つの部分 反応が関与する．すなわち（ａ）ＡＴＰによる炭酸水素塩の活性化，（ｂ）活性 化種カルボキシリン酸のアンモニアとの反応によるカルバメートの形成．および （ｃ）カルバメートのＡＴＰ−依存性リン酸化によるカルバモイルリン酸の形成 である（Ｐｏｗｅｒｓ ＆ Ｍｅｉｓｔｅｒ，１９７８）．したがって，ＣＰＳII には２つの主要なドメイン，すなわち，グルタミンアミドトランスフェラーゼド メイン（ＧＡＴ）とカルバモイルリン酸シンターゼドメイン（ＣＰＳ）もしくは 単純にシンテターゼドメインがある．グルタミナーゼドメイン（ＧＬＮアーゼ） はＧＡＴの１個のサブドメインであるか，一方，シンテターゼドメインには２個 のＡＴＰ−結合サブドメインがある． ＣＰＳのグルタミンアミドトランスフェラーゼドメインと他のアミドトランス フェラーゼの間の類似性から，これらのサブユニットはＧＬＮアーゼドメインに 相当する共通の祖先遺伝子（＝２０ｋＤａ）から分岐進化によって生じ，ＣＰＳ ＧＡＴドメイン（＝４２ｋＤａ，これにはＣＰＳ中にのみ存在する構造ドメイン 候補が包含されている）の特殊な進化には他の配列の融合および／または挿入が 関与したに違いないとの考えが提起されてきた（Ｗｅｒｎｅｒら，１９８５）． 哺乳類のＣＰＳＩ遺伝子のＧＡＴは，この祖先遺伝子の５’末端における未知遺 伝子との単純な遺伝子融合現象によって形成されたとの考え方が提案されている （Ｎｙｕｎｏｙａら，１９８５）． 各種生物の大きい方のシンテターゼドメインの遺伝子は，祖先キナーゼ遺伝子 が遺伝子重複を受け２つの相同な半分をもつポリペプチドを生じたと想定された （Ｓｉｍｍｅｒら，１９９０）．大腸菌のサブユニット構造や酵母のアルギニン 特異的ＣＰＳとは異なり，ＧＡＴおよびシンテターゼドメインをコードする遺伝 子の更なる融合が高等真核生物におけるピリミジン生合成に特異的な単一遺伝子 を形成したと示唆されていた．逆に，Ｓｉｍｍｅｒと共同研究者ら（１９９０） はアルギニン特異的ＣＰＳ（酵母におけるｃｐａ１およびｃｐａ２のように）な らびにラットミトコンドリアＣＰＳＩはピリミジンキメラからの脱融合によって 生じたとの考えを提起していた． 本発明者らはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからのＣＰＳII酵素（ｐｆＣＰＳII） をコードする完全遺伝子を単離し，その特性を明らかにした．５’および３’の 非翻訳領域を含めたそのｃＤＮＡ配列を本明細書に記載する．その結果，本発明 者らは，グルタミナーゼおよびシンテターゼドメインそれぞれを同定した．酵母 ， Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ（細胞性粘菌）および哺乳類におけるＣＰＳII遺伝子 とは異なり，続く酵素，アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ（ＡＴＣアー ゼ）への連関の証拠がない．これは，Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉからの酵素についての Ｈｉｌｌら（１９８１）の報告と対照的である．しかしながら，本発明者らは， Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ遺伝子中にはこれまでに報告されたことがないと思わ れる性質の２つの大きな挿入体を見出したのである． したがって，本発明は，第一の態様において．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌ ｃｉｐａｒｕｍのカルバモィルリン酸シンターゼIIをコードする核酸分子，すな わち，実質的に表１に示された配列，１〜７１７６もしくは１〜７５０もしくは ７５１〜１４４６もしくは１４４７〜２０７０もしくは２０７１〜３７６２もし くは３７６３〜５５７１もしくは５５７２〜７１７３もしくは１〜３３６０もし くは２７０１〜６６６６もしくは２０７１〜７１７３，または機能的に均等な配 列から構成される． 本発明の好ましい実施態様では，核酸分子は，表１の−１２２５〜７６９５に 示された配列．または機能的に均等な配列を包含する． 第二の態様においては，本発明は，単離されたポリペプチドすなわち実質的に 表１に示されたアミノ酸配列１〜２３９１，４８３〜６９０，６９１〜１２５４ ，１８５８〜２３９１，１〜１１２０，６９１〜２２２２または６９１〜２３９ １から構成される． 本明細書において用いられる「機能的に均等な配列」の語は，コードの縮重に よる，異なるポリペプチドをコードする配列は生じない，核酸配列におけるマイ ナーな変動をカバーする意図である． 第三の態様では，本発明は．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの カルバモィルリン酸シンターゼIIを製造する方法において，本発明の第一の態様 の核酸分子でトランスフォームされた細胞をその核酸配列の発現を可能にする条 件下に培養し，発現されたカルバモイノレ。リン酸シンターゼIIを回収すること からなる方法である． 細胞は細菌でも真核細胞であってもよい．好ましい細胞の例には大腸菌，酵母 およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ（細胞性粘菌）が包 含される． 本技術分野の熟練者には容易に理解できるように，ＣＰＳIIのヌクレオチド配 列の解明はある範囲の治療剤の製造を可能にするものである．これらにはアンチ センスヌクレオチド，リボザイム，ならびに他のアプローチたとえば三重鎖の形 成を使用するＲＮＡおよびＤＮＡ配列の標的化が包含される． 表１に掲げた配列を考慮すれば明らかであるように，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＰＳII遺伝子には．他のカルバモイルリン酸シンター ゼ遺伝子には見られない２つの挿入配列が包含される．第一の挿入配列は推定構 造ドメインとグルタミナーゼドメインを分離し，一方，第二の挿入配列はシンテ ターゼサブユニットＣＰＳａおよびＣＰＳｂの２つのＡＴＰ結合サブドメインを 分離する ＧＡＴドメインは２つのサブドメイン，構造ドメイン候補（１〜７５０），お よびグルタミナーゼドメイン（１４４７〜２０７０）から構成される．これらの ２つのサブドメインは第一の挿入配列（７５１〜１４４６，下線）によって分離 されている．シンテターゼサブユニット，ＣＰＳａ（２０７１〜３７６２）およ びＣＰＳｂ（５５７２〜５１７３）の２つのＡＴＰ結合サブドメインは第二の挿 入配列（３７６３〜５５７１，下線）によって分離されている． これらの挿入された配列は他のカルバモイルリン酸シンターゼ遺伝子には見出 されず，宿主の遺伝子との相同性による有害反応の可能性が低いので，これらの 挿入配列は，それらに限定されるものではないが，アンチセンスヌクレオチド， リボザイムおよび三重鎖ヘリックス形成ヌクレオチドを含めた治療の優れた標的 を提供するものである． アンチセンスＲＮＡ分子は細胞内で遺伝子発現を調節するのに有用であること が知られている．ＣＰＳIIの部分と相補性のアンチセンスＲＮＡ分子はＣＰＳII 配列から製造することができる．これらのアンチセンス分子は細胞内にＣＰＳII 遺伝子が存在するか否かを決定するための診断用のプローブとして使用でき，ま たＣＰＳII遺伝子の発現を調節するための治療剤として使用できる．ＣＰＳII配 列を用いて調製されるアンチセンスヌクレオチドには，ＣＰＳIIｍＲＮＡと相補 性を有しインビボでその機能を妨害できるヌクレオチド，および生存細胞中で転 写されて初めてアンチセンスヌクレオチドを産生できるＣＰＳII配列要素を含有 する遺伝子が包含される．遺伝子は，細胞，ウイルス，病原体からのメッセンジ ャーＲＮＡ（ポリメラーゼII）もしくは構造ＲＮＡ遺伝子（ボリメラーゼＩおよ びIII）からのプロモーター要素，または合成ブロモーター要素を含んでいても よい．アンチセンスの設計についての総説には”Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏ ｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ”， Ｒ．Ｐ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｇ．Ｉｚａｎｔ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒ ｅｓｓ刊，１９９２がある．アンチセンスヌクレオチドの設計に関してさらに例 が記載されている米国特許第５，２０８．１４９号も参考になる．これらの引用 文献それぞれの開示は参考として本明細書に導入される． 本明細書に用いられる「ヌクレオチド」の語には，それらに限定されるもので はないが，天然に存在するすべてのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレ オチドのオリゴマーならびに任意のヌクレオチド類縁体か包含される．ヌクレオ チド類縁体には，他のヌクレオチドたとえばメチルホスホネートまたはホスホロ チオネートと配列特異的複合体（たとえば二重鎖またはヘテロ二重鎖）を形成で きて，さらに有利な拡散性および安定性を有するすべての化合物が包含される． ヌクレオチドの定義には，ホスホジエステル結合，ペプチド結合または他の任意 の共有結合で連結された天然のまたは類縁の塩基か包含される．これらのヌクレ オチドは，生存細胞内においてインビボで，インビトロで酵素的に，または化学 的に，それらの任意の組み合わせにより合成することができる． ＣＰＳII遺伝子の発現の調節に有用なリボザイムには，特異性のためのＣＰＳ II配列とＣＰＳIIｍＲＮＡのインビトロまたはインビボにおける切断を促進する 触媒性ドメインとを有するヌクレオチドが包含される．触媒性ドメインにはハン マーヘッド，ヘアピン，デルタ−ウイルス要素，リボソームＲＮＡイントロン， およびそれらの誘導体がある．リボザイムの設計に関するその他の情報はＨａｓ ｅｌｏｆｆ，Ｊ．＆ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｗ．Ｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３４ ，５８５；Ｋｕｒｇｅｒ，Ｋ．，Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ，Ｐ．Ｊ．，Ｚａｎ ｇ，Ａ．Ｊ．，Ｓａｎｄｓ，Ｊ．，Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ，Ｄ．Ｅ．＆ Ｃｅ ｃｈ，Ｔ．Ｒ．（１９８２）Ｃｅｌｌ，３１，１４７，国際特許出願ＷＯ８８／ ０４３００，米国特許第４，９８７，０７１号および米国特許第５，２５４，６ ７８号に見られる これらの引用文献それぞれの開示は参考として本明細書に導 入される．触媒性要素は，分解の加速またはある種の他の機構によってＣＰＳII 標的ｍＲＮＡの人工的調節を増強することができる． 三重鎖ヘリックスオリゴヌクレオチドはゲノムからの転写の阻害に使用するこ とができる．ＣＰＳII遺伝子の配列が本明細書に示されたことから，三重鎖ヘリ ックスを形成してＣＰＳII遺伝子の転写を阻害ずるオリゴヌクレオチドを設計す ることが可能である．三重鎖ヘリックスの形成に適当なオリゴヌクレオチドの生 成に関する情報はＧｒｉｆｆｉｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：９６７−９７１ ，１９８９）に見られる．この引用文献のこの開示は，参考として本明細書に導 入される． 三重鎖形成剤にはＤＮＡまたはクロマチンとの複合体の形成によりＣＰＳII遺 伝子に結合できるすべてのヌクレオチドが包含される 相互作用は三重鎖のフー グスティーン構造または他の機構たとえばＣＰＳII配列情報に依存する二重鎖侵 入によるものであってもよい． したがって，本発明は，第四の態様として，カルバモイルリン酸シンターゼII のｍＲＮＡを切断できるリボザイムであり，本発明の第一の態様の核酸分子から 得られるｍＲＮＡの部分に相補性の配列を含むリボザイムからなる． 本発明のこの態様における好ましい実施態様では，リボザイムは本発明の第一 の態様の核酸分子の第一または第二の挿入配列から得られるｍＲＮＡに相補性の 配列を包含する． 本発明は，第五の態様においては，本発明の第一の態様の核酸分子の発現をブ ロックできるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる． 上述のように，本発明はその一態様において，組み換え技術によるＣＰＳIIの 製造方法に関する．この方法によって製造されるタンパク質および本発明のポリ ペプチドは，他の抗マラリア治療剤の開発を目指したインビトロ薬物結合試験に 有用と考えられる． 本発明の性質をさらに明確に理解できるように，Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの ＣＰＳII遺伝子をクローン化した方法を，以下の実施例および図面を参照しなが ら説明する． 例 アミノ酸配列がまだ決定されていない遺伝子をスクリーニングするための慣用 方法は，異種プロービング，すなわち近縁の生物からの標的酵素の遺伝子フラグ メントを用いて行われる．これはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ に関しては，主としてそのゲノムにおけるＡ−Ｔの異常な高含量により，成功し ないことが数名の研究者によって証明されている．酵母ｕｒａ２遺伝子のフラグ メント（Ｓｏｕｃｉｅｔら，１９８９）を用いてＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ中の ＣＰＳII遺伝子を単離する初期の試みに失敗したのち，本発明者らは，スクリー ニングのプローブとして増幅産物を使用する目的でＣＰＳII遺伝子の部分をポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，Ｓａｉｋｉら，１９８９）を用いて増幅することに 決定した． 本発明者らはＣＰＳ遺伝子のアミノ末端ＧＡＴドメインからおよびシンテター ゼドメインの最初の半分からの保存配列より設計したオリゴヌクレオチドを用い ＰＣＲ産物を単離しクローニングした．ヌクレオチドの配列決定によってＣＰＳ II遺伝子の部分が得られたことを確認した．寄生虫の総ＤＮＡを制限酵素によっ てフラグメントとして，ＣＰＳII−特異的遺伝子プローブを用いサザーン分析に 付した．遺伝子プローブにハイブリダイズするＤＮＡフラグメントのサイズを測 定し，ついで相当するバンド内のＤＮＡを「ミニライブラリー」の構築に使用し た．この方法で，クローンの小集団をｐｆＣＰＳII遺伝子についてスクリーニン グした． 完全長ｐｆＣＰＳII遺伝子の単離には，既知配列の異なるセグメントを用いて 一連のミニライブラリーを構築し，「遺伝子歩行」を用いて遺伝子の５’および ３’末端の両方向に未知の隣接領域の情報を得た．用いた戦略を図１に示す． 最初のサザーン分析では，Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの総ＤＮＡをＨｉｎｄII IおよびＥｃｏＲＩで消化し，ｐｆＣＰＳII４５３ｂｐＰＣＲ産物を用いてハイ ブリダイゼーションを実施した．３．０ｋｂのＨｉｎｄIIIおよび小ＥｃｏＲＩ フラグメントかプローブにハイブリダイズした．続いてＨｉｎｄIII ｐＴＺ１ ８Ｕミニライブラリーをスクリーニングして，３．０ｋｂのｐｆＣＰＳII遺伝子 フラグメント，ＣＰ５２を含むリコンビナントが単離された．４５３ｂｐのＰＣ Ｒ産物はこのセグメントの中央に位置していた． さらに遺伝子配列を得るために，ＣＰＳ２の５’ならびに３’両末端からの２ 領域を使用して，両末端における隣接配列を単離した．ＣＰＳ２の５’末端から のＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩフラグメントはさらに１．５ｋｂのフラグメント， 遺伝子の完全５’領域および一部の非コード領域の単離に有効であった． ５５０ｂｐ逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ：Ｔｒｉｇｌｉａら，１９８８）産物がＣＰＳ ２の３’末端からの既知配列を用いて得られた． このＩＰＣＲ産物はＣＰＳ２に隣接する３’領域のスクリーニングに使用され た．ＣＰＳ３を含有する３．３ｋｂのＨｉｎｄIIIリコンビナント，および類似 の３．３ｋｂＸｂａＩクローン（図１には示していない）がミニライブラリー法 によって単離された．ＣＰＳ３の３’末端からの２００ｂｐＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを用いて，１．３ｋｂのＸｂａＩセグメント，ＣＰＳ４をクロ ーン化した．これは停止コドン候補と一部の３’非コード領域を含有した． これらの４つの遺伝子フラグメント（ＣＰＳ１，ＣＰＳ２，ＣＰＳ３ならびに ＣＰＳ４）を重複部分を除いて結合させると，約７．０ｋｂのコード配列および １．８ｋｂの隣接配列からなる８．８ｋｂの総配列を与える． Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ中のＣＰＳII遺伝子の完全ヌクレオチド配列をその ５’および３’隣接配列とともに表１に示す． 本技術分野の熟練者には容易に理解されるように，本発明者らによるこの遺伝 子の単離およびその配列決定は，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ 感染の処置のための一連の新しい道を開くものである．本発明は，組み換え技術 を用いる大量のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍカルバモイルリン 酸シンターゼII酵素の製造を可能にするものである．この酵素の特性を明らかに することにより，化学療法の標的としてのその使用を可能にするものである． この遺伝子の単離はまた，感染個体内でのこの寄生虫の増殖を防止するために 使用できるアンチセンス分子，リボザイムまたは他の遺伝子不活性化剤の製造を 可能にするものである． 本技術分野の熟練者には，広い意味で記載された本発明の精神および範囲から 逸脱することなく，特定の実施態様に示した本発明に多くの改変および／または 修飾が可能なことが明白であろう．したがって，本実施態様はすべての点で，例 示的なもので限定的なものではないことを理解すべきである． 引用文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:90） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:90） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オサリバン，ウィリアム ジェームズ オーストラリア国2031 ニューサウスウエ ールズ，ランドウィック，ダーリィ ロー ド 239

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのカルバモイルリン酸シン ターゼIIをコードする核酸分子またはその部分であり，実質的に表１に示された 配列を包含する残基１〜７１７６もしくは１〜７５０もしくは７５１〜１４４６ もしくは１４４７〜２０７０もしくは２０７１〜３７６２，もしくは３７６３〜 ５５７１もしくは５５７２〜７１７３もしくは１〜３３６０もしくは２７０１〜 ６６６６もしくは２０７１〜７１７３またはその機能的に均等な配列からなる核 酸分子 ２．核酸分子は表１の−１２２５〜７６９５に示された配列またはその機能的 に均等な配列である「請求項１」に記載の核酸分子． ３．単離されたポリペプチド，すなわち実質的に表１に示されたアミノ酸配列 １〜２３９１，または４８３〜６９０または６９１〜１２５４または１８５８〜 ２３９１または１〜１１２０または６９１〜２２２２または６９１〜２３９１を 包含するポリペプチド ４．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのカルバモイルリン酸シン ターゼIIまたはその部分を製造する方法において「請求項１または２」に記載の 核酸分子でトランスフォームされた細胞をその核酸配列の発現を可能にする条件 下に培養し，発現されたカルバモイルリン酸シンターゼIIを回収することからな る方法． ５．細胞は大腸菌，酵母，またはＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉ ｄｅｕｍである「請求項４」に記載の方法． ６．「請求項１または２」に記載の核酸分子から得られるｍＲＮＡの部分に相 補性の配列を含む，カルバモイルリン酸シンターゼIIｍＲＮＡを切断できるリボ ザイム． ７．「請求項１または２」に記載の核酸分子の第一または第二の挿入配列から 得られるｍＲＮＡの部分に相補性の配列を含む「請求項６」に記載のリボザイム ． ８．「請求項１または２」に記載の核酸分子の発現をブロックできるアンチセ ンスオリゴヌクレオチド ９．「請求項５もしくは６」に記載のリボザイムまたは「請求項７」に記載の アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内で産生するポリヌクレオチド構築体．