CN1756841A - 来自于曲霉菌的磷脂酶a2 - Google Patents

Abstract

提供来自于曲霉菌的磷脂酶A₂及对其进行编码的DNA。磷脂酶A₂含有下述(a)或(b)蛋白质：(a)是具有序列号1或2表示的氨基酸序列的蛋白质；(b)是具有改变了序列号1或2表示的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列、具有磷脂酶A₂功能的蛋白质。

Description

来自于曲霉菌的磷脂酶A2

技术领域

本发明涉及来自于曲霉菌的磷脂酶A₂及对其进行编码的DNA，以及它们的应用。

背景技术

丝状菌中特别是含有米曲霉(キコウジ菌)等的曲霉菌，在日本的酿造业如制造清酒、黄酱、酱油以及甜料酒等方面的利用由来已久，是能够直接食用的菌类，美国FDA(食品药品局)在GRAS(Generally Recognized as Safe)上将其列为安全的基因源。

因此，在把来自于一般菌类的基因作为食品等利用时所进行的必要的慢性毒性检查等安全审查中，来自于一般菌类的基因大约要花费10亿日元，与此相比，对于上述GRAS等级的基因的审查，只需花费上述经费的约三分之一左右即可，而且，具有该审查所需要的时间更短的优点。

这样，从安全性和经济性的角度来看，可以说丝状菌特别是曲霉菌是利用价值非常高的基因宝库。

因此，通过明确这些菌类的基因组DNA信息以及被编码的基因等的功能，不但能够给如利用生物技术生产物质等的食品工业提供有效利用安全的基因资源的方法，而且能够为农药及医药领域的各种基因的筛选提供有用的信息。

进一步，能够成为解析亲缘菌如黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等谷物的污染菌以及人体的感染菌的基因组信息的有用工具。

在上述背景下进行研究的结果，本发明者们成功地解析了曲霉菌中的一种米曲霉的基因组，确定了它的碱基序列(以及其编码的氨基酸序列)和各种功能等。基于所述的研究成果，在先申请(特愿2001-403261)中公开了来自于米曲霉的各种DNA，以及含有从这些DNA中制作的核苷酸序列、用于GRAS等级的丝状菌基因的扩增的引物组合以及用于检测出丝状菌基因的探针等。

本发明者们以得到的曲霉菌基因组信息为基础做了更进一步的研究。即关注于磷脂酶A₂，从得到的碱基序列中确定对磷脂酶A₂进行编码的序列，同时尝试确定被该序列编码的蛋白质的氨基酸序列。此外，磷脂酶A₂是对甘油磷脂的2位的酯键进行加水分解、生成游离的脂肪酸和溶血磷脂的酶。人们从很早以前就知道来自动物的磷脂酶A₂，这样的磷脂酶A₂作为乳化剂已广泛用于溶血卵磷脂的制造(如参照特开平10-042884号公报)、油脂的脱胶工艺(如参照Industrial Enzymology 2^nd ed.，p299-300(1996))、制作面包(如参照特开昭60-2135号公报)、功能性磷脂(如参照オレオサイェンス第2卷第1号(2002))等食品工业中。此外，也可在抗炎药、治疗败血症药、治疗风湿病药、治疗哮喘药、治疗缺血性疾病药、治疗缺血再灌注伤害药等药物开发方面使用。但是，来自动物的酶，由于其来自于动物，所以近年来消费者、食品制造公司都对它有敬而远之的倾向，人们期待着认为是更加安全的从微生物提取的酶。近年来对来自于微生物的磷脂酶A₂进行了研究，发现了一种属于放线菌的紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)的酶(参照特开平6-327468号公报)。接着最近又报道了来自于一种丝状菌Tuber borchii的酶(参照Soragni et al.，The EMBO Journal，20(18)5079-5090(2001))、来自于Helicosporium sp.丝状菌的酶(参照Wakatsuki et al.，Biochim.Biophys.Acta 1522，74，(2001))。但是，没有把这些微生物作为食品使用的经验，因此期待着来自于安全性更高的菌种的酶。

因此，本发明的课题是提供来自于曲霉菌的磷脂酶A₂和对其进行编码的DNA，并提供来自于该曲霉菌的磷脂酶A₂的生产方法等。

发明内容

本发明者们对上述课题进行了锐意研究，结果成功地在曲霉菌基因组内发现了与上述报道的来自于微生物的磷脂酶A₂基因有高度同源性的2种序列(以下分别称为“spaA基因”和“spaB基因”)。接着，以大肠菌和曲霉菌为宿主，表达该序列编码的2种蛋白质(以下分别称为“磷脂酶A₂-spaA”和“磷脂酶A₂-spaB”)时，确认任何一种蛋白质都具有磷脂酶A₂的活性，根据此结果从实验上进一步确认该2种序列对磷脂酶A₂进行了编码。另一方面，成功确定了该2种序列中的编码区域，发现该序列编码的2种蛋白质含有新发现的氨基酸序列。这样，本发明者们首次成功地确定了来自于曲霉菌的磷脂酶A₂的基因及其氨基酸序列。

本发明是根据以上的研究成果完成的，提出了下述构成。

(1)含有下述(a)或(b)蛋白质的磷脂酶A₂：

(a)具有序列号1表示的氨基酸序列的蛋白质；

(b)具有改变了序列号1表示的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列、具有磷脂酶A₂功能的蛋白质。

(2)含有下述(c)或(d)蛋白质的磷脂酶A₂：

(c)具有序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质；

(d)具有对序列号2表示的氨基酸序列的一部分实施改变的氨基酸序列、具有磷脂酶A₂功能的蛋白质。

(3)下述(A)或(B)DNA：

(A)对(1)所述的磷脂酶A₂进行编码的DNA，

(B)在严格条件下与(A)DNA杂交，其编码的蛋白质具有磷脂酶A₂功能的DNA。

(4)下述(C)或(D)的DNA：

(C)对(2)所述的磷脂酶A₂进行编码的DNA；

(D)在严格条件下与(C)DNA杂交，其编码的蛋白质具有磷脂酶A₂功能的DNA。

(5)具有下述(i)～(vi)中任一项序列的DNA：

(i)序列号3表示的碱基序列；

(ii)序列号4表示的碱基序列；

(iii)序列号5表示的碱基序列；

(iv)序列号6表示的碱基序列；

(v)序列号7表示的碱基序列；

(vi)序列号8表示的碱基序列。

(6)一种载体，其携带有权利要求3～5中任一项所述的DNA。

(7)一种丝状菌，其从外部导入权利要求3～5中任一项所述的DNA。

(8)磷脂酶A₂的生产方法，其包括下述步骤①和步骤②：

①在能够产生上述DNA编码的蛋白质的条件下，培养(7)所述的丝状菌的步骤；以及

②回收产生的蛋白质的步骤。

本发明中的“DNA”不仅限于双链DNA，而且还包括构成双链的单链DNA(有义链和反义链)。另外，本发明的DNA中还包括含有考虑到密码子简并的任意碱基序列的DNA。进一步，本发明中的“DNA”没有形态限制，可以包括cDNA、基因组DNA、合成DNA。

本发明中的“对蛋白质进行编码的DNA”指的是，在基因表达时能得到该蛋白质的DNA，当然包括具有与该蛋白质的氨基酸序列相对应的碱基序列的DNA，也包括在这样的DNA中附加对氨基酸序列不编码的序列所形成的DNA(如含有1个或多个内含子的DNA)。

本发明中“来自于曲霉菌的磷脂酶A₂”指的是，以曲霉菌为起始原料生产的磷脂酶A₂，或在生产过程中利用曲霉菌持有的磷脂酶A₂的信息(氨基酸序列或DNA序列)生产的磷脂酶A₂。当然可以是利用物理方法或生物化学方法从曲霉菌中生产的磷脂酶A₂，还包括利用本发明所公开的磷脂酶A₂的氨基酸序列或DNA序列采用基因工程学的方法生产的磷脂酶A₂。

附图说明

图1是表达载体-pNGspaA的构成的模式示意图。

图2是表达载体-pNGspaB的构成的模式示意图。

图3是显示磷脂酶A₂-spaA的转化体以及磷脂酶A₂-spaB的转化体的磷脂酶活性(培养上清液中和破碎菌体溶液中)的图示。

图4是显示由携带磷脂酶A₂-spaA基因的转化体精制得到的磷脂酶A₂-spaA蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳图谱的图像。

图5是利用经CM-纤维素柱精制了的磷脂酶A₂-spaA的转化体的培养上清液来测定磷脂酶A₂的活性的结果总结表。

具体实施方式

(蛋白质)

本发明的第一方面涉及来自于曲霉菌的磷脂酶A₂。本发明提供的磷脂酶A₂是例如含有具有序列号1或序列号2的氨基酸序列的蛋白质。如后述实施例所示，确认该蛋白质在使用丝状菌的表达系统中确实具有磷脂酶A₂的活性。

这里，在对某蛋白质的氨基酸序列的一部分实施改变时，一般情况下改变后的蛋白质与改变前的蛋白质具有相同的功能。即氨基酸序列的改变不会对蛋白质的功能产生实质性的影响，蛋白质的功能在改变前后能够得以维持。考虑到此因素，即使是含有对具有上述磷脂酶A₂活性的蛋白质的氨基酸序列(序列号1及2)的一部分进行改变的氨基酸序列的蛋白质(以下称“改变的蛋白质”)，只要有磷脂酶A₂的功能就可以构成本发明的磷脂酶A₂(蛋白质)。换句话说，只要能够保持磷脂酶A₂的功能，允许对一部分氨基酸实施改变。此外，优选改变前后磷脂酶A₂的活性不发生降低，但也可以有稍微的变动(上升或降低)。

这里，“氨基酸序列的一部分被改变”指的是，氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生缺失、置换、附加和/或插入的意思。只要能够保持磷脂酶A₂的活性，氨基酸序列的改变(变异)的位置没有特别的限定，并且可以在多个位置发生改变。改变的氨基酸的数量，例如可以是相当于全部氨基酸数量的10％或更少，优选相当于全部氨基酸数量的5％或更少，更优选相当于全部氨基酸数量的1％或更少。上述改变的蛋白质，例如可以用下述方法制造，即制备核苷酸片断，该核苷酸片断含有对序列号1或2氨基酸序列进行编码的碱基序列施加改变的序列，在适当的表达系中对此核苷酸片断进行表达等，利用基因工程学的方法制备上述改变的蛋白质。

对于本发明的蛋白质(包括改变的蛋白质)中的含有天然曲霉菌的蛋白质，可以通过对该曲霉菌提取、精制等操作制备。此外，也可以根据本说明书公开的磷脂酶A₂的信息，采用基因工程学的方法生产本发明的蛋白质(包括改变的蛋白质)。例如，可以用本发明的对蛋白质编码的DNA使适当的宿主细胞发生转化，然后通过回收转化体内表达的蛋白质来生产。对于回收到的蛋白质根据相应的目的实施适宜的精制。制备重组蛋白质时能够进行各种修饰，例如，将对本发明的蛋白质进行编码的DNA和其他适当的DNA插入到同一载体内，如果利用该载体可以进行重组蛋白质的生产，就可以得到在本发明的蛋白质上连接别的肽甚至蛋白质的重组蛋白质。此外，也可以实施附加糖链和/或脂质、或者实施诸如在N末端或C末端发生加工(プロセツシング)之类的修饰。通过上述修饰，能够使重组蛋白质的提取、精制简便化，还能够附加生物学功能等。

(对磷脂酶A₂进行编码的DNA)

本发明的第2任务是提供对来自于曲霉菌的磷脂酶A₂进行编码的DNA。这样的DNA的具体例子，可以是含有序列号3或4表示的碱基序列的DNA、或者含有序列号7表示的碱基序列的DNA。序列号3或4的序列是来自对磷脂酶A₂进行编码的基因组DNA(磷脂酶A₂基因)序列，序列号7的序列是从序列号4所示序列中除去内含子后的序列。本发明的DNA的其它具体例子可以是具有序列号5、6或8表示的碱基序列的DNA。序列号5的碱基序列是包括序列号3表示的磷脂酶A₂基因及其推定的启动子和终止子区域的DNA。同样，序列号6的碱基序列是包括序列号4表示的磷脂酶A₂基因及其推定的启动子和终止子区域的DNA。此外，序列号8的碱基序列是包括序列号7表示的DNA(磷脂酶A₂基因中除去内含子区后的DNA)及其推定的启动子和终止子区域的DNA。在这些DNA中优选启动子及终止子与结构基因的组合，如果利用该DNA生产磷脂酶A₂就可能出现良好的基因表达效果。因此，能够构建高效率的磷脂酶A₂的生产体系。

上述本发明的DNA可以采用下述方法制备。即利用合适的丝状菌基因组DNA基因文库或cDNA基因文库、或利用丝状菌的菌体内提取液，正确使用能够与编码本发明的磷脂酶A₂基因(如具有序列号3或4表示的碱基序列的DNA)发生特异性杂交的探针、引物等，就可制备本发明的DNA。另外，关于制备本发明的DNA所使用的丝状菌基因组DNA基因文库或cDNA基因文库的制作方法，可参照例如Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York进行。

具体来说，例如可以采用下述步骤制备本发明的DNA。首先，将预想具有目的DNA的丝状菌培养一定时间后，通过过滤集菌，洗净后将菌体冷冻干燥；然后，使用研钵等粉碎菌体，加入适量的萃取用缓冲溶液(例如含有SDS的Tris-HCl缓冲液)作为萃取液；接着，通过苯酚萃取、乙醇沉淀等对基因组DNA进行萃取、精制。把这样得到的基因组DNA作为模板，采用PCR法就能够得到目的DNA的扩增产物，该PCR法使用了目的DNA序列的特异性引物。

在可能得到合适的丝状菌基因组DNA基因文库或cDNA基因文库的情况下，利用这些基因文库也可以制备本发明的DNA。根据使用的基因文库的种类可以采用嗜菌斑杂交法或菌落杂交法(参照Molecular Cloning，ThirdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York等)。例如使用质粒构成的基因文库时，可以采用菌落杂交法。在选择具有目的DNA的克隆时，可以使用具有本发明DNA的特异性序列的探针。如果选择了目的克隆，以具有该克隆的DNA为模板，采用PCR法等就能够得到本发明的DNA的扩增产物，该PCR法使用了目的DNA序列的特异性引物。

将得到的克隆DNA载入适当的载体中进行亚克隆化，可供以后的使用。据此，例如能够构建转化用的重组载体，或构建适合解读碱基序列的质粒。

这里，对编码某蛋白质的DNA的一部分实施改变时，一般情况下改变后的DNA编码的蛋白质与改变前的DNA编码的蛋白质具有相同的功能。即DNA序列的改变不会对所编码的蛋白质的功能产生实质性的影响，所编码的蛋白质的功能在改变前后能够得以持续。考虑到此因素，即使是含有对上述本发明的DNA的一部分做了改变的碱基序列的DNA(以下称“改变的DNA”)，只要其编码的蛋白质具有磷脂酶A₂功能就可以构成本发明的DNA。换句话说，只要含有编码的蛋白质、能够保持磷脂酶A₂的功能，就允许对一部分序列实施改变。此外，优选在改变前后编码的蛋白质的磷脂酶A₂的活性不发生降低，但也可以有稍微的变动(上升或降低)。

这里，“一部分的改变”指的是，典型情况是，改变前的碱基序列中有1个或多个碱基被置换、缺失、插入或附加。这种改变也可以在多个部位发生。这里所说的“多个”，因改变发生的位置以及改变的种类的不同而异，例如可以是2～100个，优选2～50个，更优选2～10个。上述的改变的DNA，例如可以通过限制酶处理、核苷酸外切酶以及DNA连接酶等来处理，通过用指定位置突变导入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)、随机突变导入法(MolecularCloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)导入变异等来制备。此外，也能够用紫外线处理含有磷脂酶A₂基因的丝状菌，然后分离出改变后的基因等公知的变异处理方法制备改变的DNA。

此外，在上述的碱基的置换、缺失、插入、附加或逆位等变异中，根据含有磷脂酶A₂的微生物的个体差异、种属差异等情况，也包括自然发生的变异。

改变的DNA的制备方法，例如可举出，从带有改变的DNA的天然曲霉菌(米曲霉)中提取基因组(染色体)DNA，用适当的限制酶对此处理，然后以本发明的DNA(如具有序列号3或4表示的序列的DNA)或其一部分作为探针进行筛选，在严格条件下对杂交DNA进行选择、分离的方法。在含有具有改变的DNA的克隆的基因组(染色体)DNA基因文库能够利用的情况下，以本发明的DNA(如具有序列号3表示的序列的DNA)或其一部分作为探针，在严格条件下通过对该基因文库进行筛选也可以得到改变的DNA。

与上述本发明的DNA(如具有序列号3或4表示的序列的DNA或者在其上附加上述变化而得到的DNA)在严格条件下杂交，并且其编码的蛋白质具有磷脂酶A₂功能的DNA也可视为本发明的DNA。这里所说的“严格条件”，就是指能够形成特异性杂交化物、而不能形成非特异性杂交化物的条件。严格条件根据序列的长短、构成碱基的种类的不同而变动，例如使用杂交溶液(50％甲醛、10×SSC(0.15M NaCl，15mM sodium citrate，PH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑精子DNA、50mM磷酸缓冲液(PH7.5))在42℃温育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在68℃洗净的条件。更优选的严格条件是，可以例示为使用的杂交液为50％甲醛、5×SSC(0.15M NaCl，15mM sodium citrate，PH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑精子DNA、50mM磷酸缓冲液(PH7.5)。

(载体)

本发明的另外的方面是提供携带上述本发明DNA(包括改变的DNA)的载体。这样的载体是通过把本发明的DNA载入现有的载体或载入对现有的载体实施改变后的载体内而制作的。原则上只要能够携带本发明的DNA，任何载体都可作为起始材料，但可根据使用目的(克隆、聚肽的表达)的需要，以及考虑宿主细胞的种类来选择适当的载体。本发明的DNA向载体内载入的方法，可通过用限制酶及DNA连接酶的公知方法(Molecular Cloning，Third Edition，1.84，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)来进行制作。

此外，在构建携带有包括启动子区在内的DNA(如具有序列号5、6、8任一项所表示的序列的DNA)的载体时，可以容易地把该DNA的启动子区和其他区分开，再分别把它们载入载体内以构建重组载体。在这种情况下，以启动子能够确切地发挥其功能为条件，在载体内的两者(启动子区和其他区)之间也可以介入其他序列。此外，也可以先构建携带启动子区的载体，然后再与其他区连结。

转化用的载体中，典型的是携带有磷脂酶A₂基因(如具有序列号3表示的序列的DNA)、启动子以及终止子。为确保启动子操纵的结构基因实现确切的转录，按照从上游到下游的顺序配置启动子、磷脂酶A₂基因及终止子。载体内也可以含有具有选择标记或增强子功能的序列以及对信号肽进行编码的序列。

(转化体)

转化用的载体能够用于丝状菌的转化。即、使用上述转化用的载体，能够构建丝状菌的转化体的制备方法。根据所述的制备方法，可以得到从外部导入本发明的DNA的丝状菌。这样得到的丝状菌的转化体能够用于磷脂酶A₂的生产。具体来说，在该DNA编码的蛋白质(磷脂酶A₂)能够表达的条件下，培养从外部导入本发明的DNA的丝状菌的转化体，能够产生磷脂酶A₂。根据使用的宿主的不同，选择适当的物质作培养基，例如可以使用市售的各种培养基或在其中添加了精氨酸、尿苷等转化体的生长发育、选择、促进蛋白质表达等所必须的成分的培养基。

可以从经过一定时间培养之后的培养液或菌体中回收目的蛋白质(磷脂酶A₂)。产生到菌体外时可以从培养液中回收，除此之外可以从菌体内回收。从培养液中回收的情况下，例如可以通过过滤培养上清液、离心分离除去不溶物，然后使用硫酸铵沉淀等盐析、透析、各种层析法等组合来进行分离、精制而得到目的蛋白质。另一方面，从菌体内回收的情况下，例如可以对菌体进行加压处理、超声波处理等使其破碎后，采取与上述同样的方法进行分离、精制而得到目的蛋白质。此外，也可以在经过过滤、离心分离等从预先制备的培养液中回收菌体后，实施上述一连串的工序(菌体的破碎、分离、精制)。此外，本发明的磷脂酶A₂通常是产生到菌体外的，所以其分离、精制都比较容易。

用于转化的宿主丝状菌的种类没有特别的限制，可以使用曲霉属(米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉、白曲霉、寄生曲霉、黄曲霉、Aspergillus.nomius、烟曲霉等)、青霉属、木霉属、根霉属、毛霉菌属、或镰孢(霉)属等分类出来的丝状菌。优选使用曲霉属丝状菌，其中因为米曲霉或黑曲霉的安全性高，所以优选。

可以利用公知的方法实施转化用的载体向宿主丝状菌内导入(转化)。例如可以根据使用原生质体化菌的Turner等的方法(Gene，36，321-331(1985))进行导入，此外也可以采用五味等的方法(Agric.Biol.Chem.，51，323-328(1987))等导入。

[实施例]

下面通过实施例对本发明作更加详细的说明，但是本发明并不仅仅限于实施例的内容。并且实施例中对各种基因的操作根据上述Currentprotocols in molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)所记载的方法实施。

[实施例1]    全基因组鸟枪法基因文库的制作方法

1.插入方的制备

(1)染色体DNA的制备

将丝状菌Aspergillus oryzae RIB-40株(ATCC 42149)的孢子接种在YPD培养基(0.5％Yeast extract，1％Peptone，2％Glucose)上，30℃振荡培养过夜，然后根据饭村的方法(Argric.Biol.Chem.323-328，51(1987))提取基因组DNA。为了除去混在基因组DNA中的线粒体DNA，参照Watson等的方法(Methods Enzymol.57-75 118(1986))，使用氯化铯超速离心，精制成只有染色体DNA。

(2)染色体DNA的片断化

把制备的纯净的染色体DNA放入随机化DNA片断装置HydroShear(トミ-精工)内，使染色体DNA变成1-2kb左右的片断。

(3)片断化的DNA的末端处理

对片断化的染色体DNA进行BAL31核酸酶(TAKARA)处理，然后实施Klenow Fragment(TAKARA)处理使末端平滑。

(4)向末端附加Adaptor

在末端平滑的染色体DNA片断的两端，使用T4 DNA Ligase(TAKARA)连接具有(p)5’-CGAGAGCGGCCGCTAC-3’和(p)5’-GTAGCGGCCGCTC-3’的连接物。

2.转化

用限制酶SalI(TAKARA)把pUC19切断后，通过Taq DNA聚合酶(ロシユ.ダイアグノステイクス)把dT插入到SalI切断的部分。如此制作的质粒通过Alkaline Phosphatase(TAKARA)处理，脱磷酸化后作为载体使用。利用T4 DNA Ligase将载体和上述制备的染色体DNA片断进行连结，利用电穿孔法在大肠菌DH10B(Gibco)上进行转化。

3.碱基序列的确定

对于质粒DNA，将大肠菌转化体在培养基2xYP上培养，37℃培养10小时，集菌后在灭菌水中99℃加热处理10分钟。把该上清液作为DNA模板水溶液使用，通过实施98℃20秒、68℃2分钟的30个循环的PCR反应，测序用引物将包括复性部位在内的插入片断的全长扩增。将制得的DNA片断作为桑格法的模板，使用M13通用引物或M13逆向引物和Perkin Elmer公司制造的PRISM Dye-Terminatior DNA测序试剂盒，参照试剂盒附加的说明书实施测序反应。对于测序反应的产物，使用凝胶过滤法等除去未反应的Dye-terminator后，使用Perkin Elmer公司制造的3700DNA sequencer解读DNA片断的碱基序列。利用Phred(phil Green)对3700DNA sequencer输出波形数据进行再解析，除去载体和连接物序列后，使用SPS Phrap(Southwest Parallel Software公司)进行集成汇编，构建曲霉菌基因组DNA碱基序列的重叠群。

[实施例2]    基因的鉴定

采用下述方法从基因组DNA碱基序列中鉴定基因。基因的鉴定方法，对于基因组DNA碱基序列的重叠群，参考已经得到的EST序列的信息以及与已知蛋白质氨基酸序列数据库的同源性信息，采用以浅井洁等的算法(Pacific Symposium on Biocomputing 98，228-239)为基础的基因区域的预测系统GeneDecoder和后藤修的算法(Bioinformatics 200016：190-202.)为基础的基因区域的预测系统ALN的组合来鉴定基因。另外，采用tRNA-scan预测tRNA基因。

第1“BLAST同源性基因候补区域的提取”

从基因组DNA的碱基序列的重叠群中提取出与已知蛋白质的氨基酸序列具有高度同源性的区域。根据Karlin and Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 87：2264-2268，1990、Proc.Natl.Acad.Sei.USA90：5873-5877，1993)可以确定氨基酸序列的同源性，而以该算法为基础开发出的被称为BLASTX的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.215：403-410，1990)，在基因组DNA的碱基序列被翻译成氨基酸序列时能够直接检索出同源性高的区域。具体的解析方法是公知的(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。本方法中，以基因组DNA的碱基序列的重叠群为查询序列，以SWISSPROT版39(Bairoch，A.&Apweiler，R.NucleicAcids Res.28，45-48(2000).)以及NRaa为数据库，实施BLASTX检索，提取出BLAST算法中的同源性指标E-value为10^-30或更小(E-value的数值越小表示同源性越高)的区域。在这些区域中，使同源性更高的部分优先，提取出相互不重叠的BLAST同源性基因的候补区域。

第2“提取ALN基因的候补区域”

在BLAST同源性基因的候补区域中，以相对于同源性对象的蛋白质的氨基酸序列的全长的90％的区域具有同源性的序列为核心，运用基因区域预测系统ALN，对重叠群序列提取出ALN基因的候补区域。ALN通过对同源性对象的蛋白质的氨基酸序列的全长与重叠群序列进行整列和确定剪接部位，来预测基因区域。

第3“GD同源性基因候补区域的提取”

在BLAST同源性基因的候补区域中，以相对于同源性对象的蛋白质的氨基酸序列的残余长度的20％或更高、不足90％的区域中具有同源性的序列为核心，运用基因区域预测系统GeneDecoder，对重叠群序列提取出GD同源性基因的候补区域。GeneDecoder统合了BLASTX的E-value和蛋白质编码区的指向性指标的2组密码子统计量，进一步参考根据以剪接部位的位置为依据的一阶马尔科夫模型(マルコフモデル)的得分，预测基因区域。

第4“EST-GD基因候补区域的提取”

对于与重叠群序列相对应的EST确定的基因表达区域，在该区域附近的重叠群序列中通过运用GeneDecoder，不仅能预测EST序列确定的基因区域，而且能够预测基因的全部区域，把此区域作为EST-GD基因的候补区域。

第5“一般的GD基因的候补区域的提取”

对于没有被第1到第4的基因候补区域所包括的重叠群序列，通过运用GeneDecoder预测基因区域。

第6“tRNA基因的候补区域的提取”

在全部的重叠群序列中使用tRNA-scan，提取tRNA基因的候补区域。

第7“基因候补区域的统合”

根据下述步骤，统合第2到第6的基因候补区域。首先，从第2到第6的基因的候补区域中除去预测与EST确定的剪接部位相矛盾的基因区域，把残留的基因候补区域通过除去互相重合的部分后进行统合。此时，优先按照tRNA、ALN同源性基因候补区域、GD同源性基因候补区域、GD-EST基因候补区域、一般的GD基因候补区域的顺序统合。把这种被统合的基因候补区域作为预测基因的组合。

根据上述操作步骤，从同源性的观点看，按照与已知蛋白质的全部长度具有同源性的基因、与已知蛋白质部分地具有同源性的基因、与已知蛋白质不具有同源性的基因这样的顺序的可信性，来保证能够准确鉴定这些基因。此外，从表达的确定性来看，按照根据EST确定的表达基因、根据EST序列没有确定的表达基因的顺序的可信性，来保证能够准确鉴定这些基因，同时要保证所有的候补基因与用EST确定的剪接部位不相矛盾。

使用的方法是采用了蛋白质的编码区全部不能包括起始密码子和终止密码子的算法，这样把伪基因预测为正常基因的可能性小。

关于功能确定，对于预测到的基因区域通过以Nraa作为数据库的BLAST进行同源性检索，以鉴定功能用的充分同源性(E-value 10^-30)作为域值来确定功能。

实施例3  对磷脂酶A₂进行编码序列的检索

以来自于Helicosporium sp.的磷脂酶A₂基因的DNA序列为基础，以曲霉菌基因组DNA中的全部DNA序列为对象，实施NCBI提供的BLAST检索(Standard protein-protein BLAST：blastp)。其结果是成功发现了2个与来自于Helicosporium sp.磷脂酶A₂有高度同源性的区域。其中的1个区域，在鉴定上述基因时预测其中多少具有一些功能的序列，但还没有推定出它的功能。并且，该基因的编码区(推定是磷脂酶A₂-spaA编码区)用序列号3表示。此外，该区域编码的氨基酸序列用序列号1表示。

另一方面，另一个区域(序列)，当初预测其具有翻译(translation)功能，存在于没有得到功能推定的序列内部。并且，当初预测该序列是由与本次推定的氨基酸序列完全不同的624个氨基酸残基组成的蛋白质的编码序列，但通过本次研究发现了与来自于其他丝状菌的磷脂酶A₂的氨基酸序列同源性更高的160个氨基酸序列(序列号2)的编码序列。对该氨基酸序列编码的碱基序列用序列号7(推定是磷脂酶A₂-spaB的编码区域)表示(包含内含子的序列在序列号4中表示)。另外，至于出现这样的区别，是由于在当初的预测中没有正确地进行内含子的推定。此外，考虑到链孢菌属(ノイロスポラクラツサ)中存在有2种磷脂酶A₂基因(GenBank数据库：ACCESSION NO.NCU06650，NCU09423)，所以预测本基因组序列中也存在除上述序列(序列号3)之外的别的磷脂酶A₂基因，在该预测的基础上进行的反复研究是成功发现该氨基酸序列(序列号2)的原因之一。

为了解析上述鉴定的2个区域(序列)的功能，实施了下述实验。

实施例4  染色体DNA的制备

将米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB-40株放入装有200ml的DPY培养基(2％糊精、1％聚胨、0.5％酵母提取液、0.5％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、PH5.5)的三角烧瓶中，30℃培养2天；使用布氏漏斗和空吸滤瓶过滤培养液，得到菌体；用研钵、研棒将被液态氮冷冻的菌体破碎，然后加入20ml SolI(50mM EDTA、0.5％SDS、0.1mg/mlProteinase K、PH8.0)，50℃温育4小时。接着用苯酚处理2次、苯酚·氯仿处理1次、氯仿处理1次(离心分离的条件为3500rpm、15分钟、4℃)，在上清液中加入其量的1/10的3M醋酸钠(PH5.2)和等量的异丙醇，冷却一个晚上；在3500rpm、4℃时离心分离20分钟，用70％的乙醇溶液清洗沉淀后，再把其溶解于TE(10mM Tris-HCl(PH8.0)、1mM EDTA)溶液中；接着，使RNase A成为10μg/ml，37℃温育30分钟；加入等量的苯酚·氯仿混合后，在3500rpm、4℃时离心分离20分钟，回收上层液；在上层液中加入其量的1/10的3M醋酸钠(PH5.2)和2.5倍量的乙醇，在3500rpm、4℃时离心分离20分钟得到沉淀，把其作为染色体DNA溶液。

实施例5  磷脂酶A₂基因的制备

在实施例3得到的曲霉菌基因组DNA重叠群序列信息的基础上，以实施例4得到的曲霉菌基因组DNA为模板，克隆磷脂酶A₂-spaA及磷脂酶A₂-spaB基因。将预测为各个目的基因(推定磷脂酶A₂-spaA及磷脂酶A₂-spaB基因)的起始密码子到终止密码子的DNA片断进行扩增的引物对设计如下。

磷脂酶A₂-spaA基因用引物：

Ao1724s 5’-cagc gaattcATGAAGAACATCTTCGTTGC-3’(序列号9)

Ao1724as 5’cagc gaattcCTACAGGTTTTCAATATCGT-3’(序列号10)

对于磷脂酶A₂-spaB基因，在来自于链孢菌属(ノイロスポラクラツサ)的2种磷脂酶A₂基因(GenBank数据库：ACCESSIONNO.NCU06650，NCU09423)内分别发现了内含子，假定在本基因内的相当于同样的位置也存在内含子，那么比来自于其他微生物的磷脂酶A₂的氨基酸序列的同源性更高。考虑到这些因素，磷脂酶A₂-spaB基因扩增用的引物设计如下。

磷脂酶A₂-spaB基因用的引物：

Ao0940s 5’-cagc gaattcATGAAGGCTAACAGCTTTCT-3’(序列号11)

Ao0940as 5’gcgc gaattccaaggtctcatatatgtatc-3’(序列号12)

此外，上述4个引物中下划线部分表示限制酶EcoRI识别部位，大写字母分别表示蛋白质编码区域。

使用上述引物对实施PCR反应，并且，反应液的组成如下所示。

灭菌水：29.75μl

rTaq DNA Polymerase用10x缓冲液：5μl

2mM dNTP溶液：5μl

10pmol/μl Ao1724s或Ao0940s：2.5μl

10pmol/μl Ao1724as或Ao0940as：2.5μl

60ng/μl RIB40基因组DNA：5μl

5U/μl rTaq DNA Polymerase(宝酒造公司)：0.25μl/50μl

采用MJ research公司制造的PTC-100型PCR装置，将上述反应液在下述条件下实施PCR反应。

(1)94℃1分钟(2)94℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟的循环进行30次循环(3)4℃放置

PCR反应的结果，有约670bp及约700bp的DNA片断分别得到特异性扩增，琼脂糖凝胶电泳后使用GeneClaenlll(BIO 101公司)提取扩增的DNA片断。把提取的DNA片断在PT7-Blue(Novagen公司)里进行连接反应，利用常规方法确定碱基序列。

实施例6  氨基酸序列的解析

对实施例5得到的碱基序列进行解析，解析结果证明，该碱基序列是对蛋白质进行编码的DNA(序列号3和4)，该蛋白质与以前报告的来自于微生物的磷脂酶A2的氨基酸序列有约35％～约55％的同源性，把各DNA作为spaA和spaB基因。由前者编码的推定磷脂酶A₂-spaA全长含有222个氨基酸，除去由SMART(Schultz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864(1998)；Letunic et al.，Nucleic Acids Res.30，242-244(2002)；http：//smart.embl-heidelberg.de/)预测的信号序列区域(19个氨基酸)后的分子量是23.4kDa，含有6个半胱氨酸。另一方面，由spaB基因编码的推定磷脂酶A2-spaB全长含有160个氨基酸，除去上述由SMART预测的信号区域(17个氨基酸)后的分子量是16.4kDa，含有4个半胱氨酸。此外发现任一种酶都含有与分泌型磷脂酶A2共同的活性中心的His-Asp配对序列。

实施例7  曲霉菌表达载体-pNGspaA的构建

接着，为了在曲霉菌中表达磷脂酶A₂-spaA构建了质粒pNGspaA。首先，对于实施例5得到的、在pT7-Blue中克隆的磷脂酶A₂-spaA基因，用限制酶Hind III Xba I(宝酒造公司)把它消化成约670bp的DNA片断后切出，作为插入DNA。另一方面，用限制酶HindIII Xba I(宝酒造公司)消化曲霉菌表达载体-pNGA142(Minetoki et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，50，459-467(1988))，该曲霉菌表达载体含有作为选择标记物的来自于曲霉菌的niaD基因、作为启动子的来自于曲霉菌的改良型葡萄糖淀粉酶基因的改良型启动子、作为终止子的来自于曲霉菌的α-糖苷酶基因的终止子，然后使用Alkaline Phosphatase(宝酒造公司)进行脱磷酸化，作为载体DNA；利用Ligation Kit ver.2(宝酒造公司)使上述得到的插入DNA和载体DNA进行连接反应，利用此连接反应产物使大肠菌DH5α株的感受态细胞(TOYOBO公司)发生转化，得到耐氨苄西林的转化体。把具有得到的克隆的质粒命名为pNGspaA，把其作为表达载体使用(图1)。

实施例8  曲霉菌表达载体-pNGspaB的构建

接着，为了在曲霉菌中表达磷脂酶A₂-spaB构建了质粒pNGspaB。首先，将实施例5得到的并且在pT7-Blue中克隆的磷脂酶A₂-spaB基因，用限制酶HindIII Xba I(宝酒造公司)把它消化成700bp的DNA片断后切出，作为插入DNA；另一方面，用限制酶Hind III Xba I(宝酒造公司)消化曲霉菌表达载体pNGA142(Minetoki et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，50，459-467(1988))，该曲霉菌表达载体含有作为选择标记物的来自于曲霉菌的niaD基因、作为启动子的来自于曲霉菌的改良型葡萄糖淀粉酶基因的改良型启动子、作为终止子的来自于曲霉菌的α-糖苷酶基因的终止子，然后使用Alkaline Phosphatase(宝酒造公司)脱磷酸化，作为载体DNA；利用Ligation Kit ver.2(宝酒造公司)使上述调制的插入DNA和载体DNA进行连接反应，利用此连接反应产物使大肠菌DH5α株的感受态细胞(TOYOBO公司)发生转化，得到耐氨苄西林的转化体。把具有得到的克隆的质粒命名为pNGspaB，把其作为表达载体使用(图2)。

实施例9  曲霉菌的转化

将硝酸还原酶缺损株米曲霉(Aspergillus oryzae)niaD 300株(Aspergillus oryzae RIB-40株(ATCC 42149)的硝酸还原酶缺损变异株、Minetoki et al.，Curr.Genet.，30，432-438(1996))放入糊精·胨培养基(2％糊精、1％聚胨、0.5％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、PH5.5)中，30℃振荡培养3天；然后用灭菌水把得到的菌体洗净；把该菌体加入细胞壁溶解液(10Mm磷酸缓冲液、PH6.0、0.8M NaCl、20mg/mlヤタラ一ゼ(宝酒造公司))中使之发生悬浊，30℃缓慢振荡培养2～3小时，发生原生质体化；将得到的原生质体通过玻璃过滤器过滤除去残存的菌体。

接着，通过五味等的方法(Agric.Biol.Chem.，51，323-328(1987))，利用该原生质体制备大肠杆菌感受态细胞以及利用pNGA142(对照)、pNGspaA或pNGspaB进行转化，以含有硝酸作为单一氮源的培养基，例如恰佩克培养基(0.2％NaNO₃、0.1％KH₂PO₄、0.2％KCl、0.05％MgSO₄·7H₂O、0.002％FeSO₄·7H₂O、2％葡萄糖、PH5.5)，对于每种质粒，分别取4株能够在这种培养基上生长发育的转化体，共取得12株。把来自于质粒pNGA142、pNGspaA或pNGspaB的转化体分别命名为载体1～载体4、SpaA-1～SpaA-4、SpaB-1～SpaB-4。

实施例10  用磷脂酶A₂-spaA转化体表达磷脂酶A₂

将得到的磷脂酶A₂-spaA的转化体在下述所示的DPY培养基上30℃振荡培养3天，然后将培养液在室温、10,000×g的条件下离心分离10分钟，得到培养上清液和菌体。用粉碎机(マルチビ一ズショツカ一)(安井器械公司)破碎菌体，得到的悬浊液作为菌体破碎液。

<DPY培养基>

2％糊精

1％聚胨

0.5％酵母提取液

0.5％KH₂PO₄

0.05％MgSO₄·7H₂O

PH5.5

采用下述方法测定上述制备的培养上清液和菌体中磷脂酶A₂的活性，结果确认，尤其是培养上清液中明显存在比对照株(即载体1～载体4株)的活性更高的磷脂酶A₂活性(图3)。该结果可以明确证实取得的推定磷脂酶A₂-spaA基因对磷脂酶A₂进行编码。

(磷脂酶A₂酶的活性测定方法)

磷脂酶A₂的活性测定，采用对定量测定标识油酸的方法(Elsbach，P.，and Weiss，J.(1991)Methods Enzymol.197，24-31)进行若干变更后的方法，该定量测定标识油酸的方法是定量测定从in vivo标识的大肠菌的膜上游离出的油酸。即、将由2.5×10⁸的[³H]油酸标识后的高压蒸汽灭菌的大肠菌(-500,000dpm)、25mM Tris-HCl缓冲溶液(PH7.5)和10mM CaCl₂及酶液组成的反应液(最终液量为100μl)，30℃温育30分钟，添加用冰冷却的1％的牛血清白蛋白(W/V)后立刻离心分离(10,000×g)，用液体闪烁扫描计数器测量得到的上清液中的放射活性。根据本条件下测出的计数(H-DPM)求出酶的活性(H-DPM/μg-protein)。采用下述方法制备[³H]油酸标识的大肠菌，将在营养培养基中37℃培养了1夜的Eshcericia coli DH5α株的培养液100μl接种于含有10ml的5μCi/ml的[³H]油酸的营养培养基内，37℃培养3小时。将该培养液在室温、3,000×g的条件下离心分离12分钟，把收集到的菌体加入到10ml新鲜的上述培养基中使之悬浊，37℃培养30分钟。在室温、3,000×g的条件下离心分离、收集菌体，用5ml的1％的牛血清白蛋白(W/V)洗净，最后加入适量的蒸馏水使之成为5×10⁸细胞/ml悬浊液，作为[³H]油酸标识的大肠菌液。

实施例11  用磷脂酶A₂-spaB转化体表达磷脂酶A₂

利用磷脂酶A₂-spaB转化体，通过实施与实施例10同样的培养及培养后的处理，得到A₂-spaB转化体的培养上清液和菌体破碎液。此外，与磷脂酶A₂-spaA转化体的情况相比，A₂-spaB转化体的生长发育大大受到抑制。认为可能是因为磷脂酶A₂-spaB的大量表达对菌体产生的一些抑制效果所致。

对于取得的培养上清液和菌体破碎液，与磷脂酶A₂-spaA的情况一样，测定磷脂酶A₂的活性。其结果确认，尤其是菌体破碎液中明显存在比对照株(载体1～载体4株)活性更高的磷脂酶A₂活性(图3)。该结果可以明确证实取得的推定磷脂酶A₂-spaB基因对磷脂酶A₂进行编码。

实施例12  用磷脂酶A₂-spaA的转化体表达的磷脂酶A2的精制

取20ml实施例10得到的磷脂酶A₂-spaA的转化体的培养上清液，用25mM Tris-HCl缓冲液(PH7.4)将其稀释10倍，然后向用25mMTris-HCl缓冲液(PH7.4)平衡过的CM-纤维柱内进样，使用含有0.1M、0.25M、0.5M、1.0M NaCl的同样的缓冲液进行梯度洗脱，分别取10μl的各洗脱液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，再用考马斯亮蓝染色。结果在NaCl浓度为0.5M～1.0M的溶出区域中检出了分子量约为16kDa的单一谱带(图4)。测定得到的未吸附、0.25M NaCl、0.5M NaCl、1.0M NaCl的各区域中的磷脂酶A₂的活性。结果如图5所示，在0.5M NaCl、1.0MNaCl的各区域中检出了磷脂酶A₂的活性，而在未吸附、0.25M NaCl的区域中几乎没有检出磷脂酶A₂的活性。因此可以证明，在0.5M NaCl、1.0M NaCl的区域中溶出的分子量约为16kDa的蛋白质就是磷脂酶A₂。

本发明并不限定于上述发明的实施方式及实施例的说明内容，同领域的技术人员在不脱离本发明权利要求书所记载的范围内，容易想到的各种变形方式都包括在本发明的范围内。

产业利用的可能性

本发明能够提供来自于曲霉菌的磷脂酶A₂及对其进行编码的DNA。利用本发明的DNA，能够构建使用安全性高的用丝状菌来生产磷脂酶A₂的生产系统。

                             序列表

<110>独立行政法人制品评价技术基盘机构

     独立行政法人产业技术综合研究所

     独立行政法人酒类综合研究所

     北本胜彦

     有冈学

     山口庄太郎

     町田雅之

     阿部敬悦

     五味胜也

     浅井洁

     佐野元昭

     金大心

     长崎英树

     细山哲

     秋田修

     小笠原直毅

     久原哲

<120>来自于曲霉菌的磷脂酶A2

<130>P0302001

<150>JP P2003-57565

<151>2003-03-04

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>222

<212>PRT

<213>米曲霉菌

<400>1

Met Lys Asn Ile Phe Val Ala Thr Leu Gly Leu Phe Ala Ala Val Ser

1                   5                    10                    15

Ser Ala Leu Pro Tyr Thr Thr Pro Val Asn Asp Asn Pro Ile Ser Ala

             20                      25                      30

Leu Gln Ala Arg Ala Thr Thr Cys Ser Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu

         35                      40                      45

Ile Phe Lys Val Ser Met Lys Thr Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ala Lys

     50                      55                      60

Asn Pro Ser Lys Cys Asn Trp Ser Ser Asp Asn Cys Ser Lys Ser Pro

65                     70                      75                      80

Asp Lys Pro Asp Gly Tyr Asn Phe Ile Pro Ser Cys Gln Arg His Asp

                  85                      90                      95

Phe Gly Tyr Arg Asn Thr Lys Lys Gln Lys Arg Phe Thr Lys Ala Met

              100                    105                    110

Lys Lys Arg Ile Asp Asp Asn Phe Lys Lys Asp Leu Tyr Lys Tyr Cys

          115                   120                     125

Ser Gln Phe Ser Gly Trp Ser Ser Trp Lys Gly Val Glu Cys Arg Arg

    130                     135                     140

Leu Ala Asp Val Tyr Tyr Thr Ala Val Arg His Phe Gly Lys Arg Asp

145                     150                     155                     160

Glu Ala Leu Glu Phe Asp Pro Glu Val Glu Phe Glu Lys Arg Asp Glu

                  165                     170                     175

Val Ala Asp Val Gln Pro Asp Glu Phe Asp Asn Phe Asp Gly Ser Glu

              180                     185                    190

Val Asp Pro Asp Ile Glu Gly Gln Val Ile Pro Glu Val Leu Glu Asp

        195                     200                     205

Asp Gly Val Asp Val Glu Asn Leu Asp Asp Ile Glu Asn Leu

    210                     215                     220

<210>2

<211>160

<212>PRT

<213>米曲霉菌

<400>2

Met Lys Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ala Leu Leu Pro Thr Ala Leu Ala

1                 5                      10                      15

Ile Pro Leu Pro Thr Pro Asn Glu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Glu Ser

              20                      25                      30

Gln Arg Leu Gln Ser Ile Thr Asp Glu Leu Met Phe Gly Leu Glu Leu

         35                      40                      45

Pro Asp Phe Thr Ala Arg Arg Glu Ala Asn Asp Pro Pro Gln Leu Asp

     50                     55                     60

Trp Tyr Ser Asp Gly Cys Thr Arg Ala Pro Ser Asn Pro Leu Gly Phe

65                      70                      75                      80

Pro Phe Gln Arg Ala Cys Glu Arg His Asp Phe Gly Tyr Gln Asn Tyr

                  85                      90                      95

Arg Ile Gln Gly Arg Phe Thr Lys Ala Ala Lys Ala Gln Ile Asp Leu

              100                     105                     110

Arg Phe Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Cys Glu Leu Gly Arg Ala Val

         115                    120                    125

Gly Ile Cys Lys Lys Leu Ala Arg Leu Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly Arg

    130                     135                     140

His Gly Gly Lys Asp Ala Ala Lys Arg Arg Glu Leu Asp Glu Leu Leu

145                   150                     155                     160

<210>3

<211>669

<212>DNA

<213>米曲霉菌

<400>3

atgaagaaca tcttcgttgc cactttgggc ctgttcgccg cagtttcgtc tgccttgccc    60

tacacaaccc ctgtcaatga caatcccatc tctgctttac aagcacgcgc gacaacatgc    120

tcggccaagg ccacggataa cctcatcttc aaggtctcca tgaagacctt ccagaaggcg    180

cgcaaggcca agaacccctc caagtgcaac tggtcatcgg acaactgctc caagtcaccc    240

gataagcccg atggatacaa cttcatcccc agctgccaaa gacacgattt cggctaccgg    300

aacacgaaga agcagaagcg cttcacaaag gccatgaaga agcgcattga cgacaacttc    360

aagaaggatc tctacaagta ctgcagccaa ttctcgggct ggagctcatg gaagggagtg    420

gagtgccgtc gccttgcgga tgtctactat actgctgtcc gccactttgg caagcgtgat    480

gaagcgcttg agtttgaccc tgaggttgag ttcgagaagc gtgatgaggt ggccgatgtc    540

cagcctgacg aatttgataa ctttgacggt tctgaagttg accctgatat cgagggccag    600

gtcattcccg aagttcttga agatgatgga gtggatgtgg agaacctcga cgatattgaa    660

aacctgtag

669

<210>4

<211>593

<212>DNA

<213>米曲霉菌

<400>4

atgaaggcta acagctttct cattgccctc ctcccaaccg ccctagccat ccccctcccc    60

acaccaaatg aaggcgctac aagcctctca gaaagccagc gcctccagtc tatcaccgac    120

gagcttatgt tcggcctcga gctgcccgac ttcacagctc gcagagaggc aaacgaccct    180

cctcagttag actggtactc tgatggctgc acaagggctc cgagtaaccc tctcggattc    240

ccctttcaaa gggcgtgtga acgccatgac ttcggttacc agaactaccg aatacaaggg    300

cgcttcacca aggccgcaaa agcgcagata gatcttagat tcaaagaaga gtatgatttc    360

cctttcgttc cttccttctc ccctggaatc tgcttctgtt gattcttatg gcagttggat    420

attgagagtc tggaggactg acgtttgatt cactgtttag tctttactat caatgtgaat    480

taggacgcgc tgtcggaatt tgcaagaagt tggctcggtt gtactaccgt gcttcggggc    540

ggcatggtgg taaagatgca gcgaagagaa gggagttgga tgaacttctt tag           593

<210>5

<211>1969

<212>DNA

<213>米曲霉菌

<220>

<221>外显子

<222>(1001)..(1666)

<223>

<400>5

tgacctcata tagaagtgac gccgggccaa tgccaaaatt gaagctttta cgaagactaa    60

cctcggattt tttcttggca gagcttgacc tcgtattgcg tcaattgcga caattatcgc    120

tttcctggaa aatatcgcat attgaagaag tggcatgtat tgctgttagt gagtttggat    180

acgtatcaaa atactcctaa taaccagcaa ccaaaagaaa atgtgagcac tggtggaacc    240

gaattgtgtt atggcaggat agaattgaga atgggtttct tcagcggggg atcctccgat    300

gataaccttc tgagagctat ttttagaatc aagggtcttc cagcttgacg atcatcttgg    360

catacacaag cactacagct gcacgacgat ggggctttac gagtcacgaa ggtaacccaa    420

gattcttcac tgagtcttgg catgcgagcc atgctcgtac ctggatccct tttgtctgga    480

atttactatt attggatacg ataatgcctt gatccagggt ccttttagaa ccaataggcc    540

actaaagctt acccgaggcc aatttatcct tcgaagtgaa tatgctcggt gcatttcagg    600

ttctgcagat cctgaagccc tttaccgtat cctgaatggt cttctcttct tctccaataa    660

tacgtcgagg gctttaatta tgttcgtgtt gagaactcgt aaagaaagac aaataggttc    720

ttggcgagag gggatagaat gcatcacgtc cacaatgcgg cacagggaat gtgccagacg    780

atacagcaga atgggggcgg agcgagacgt agtttaccga gtacgaaata gcctcgttca    840

aggagacagt ccatggcaac cataagagtc attcgcgagt ataaagggca ggtcaactcc    900

tgtcatgtag ctctctacag aatcatcaac aatctcctct cgcaagcatc acatctactt    960

cttattgcct attctgtccg agtgctagcc acttatcatc atg aag aac atc ttc     1015

                                            Met Lys Asn Ile Phe

                                            1                 5

gtt gcc act ttg ggc ctg ttc gcc gca gtt tcg tct gcc ttg ccc tac     1063

Val Ala Thr Leu Gly Leu Phe Ala Ala Val Ser Ser Ala Leu Pro Tyr

                  10                      15                      20

aca acc cct gtc aat gac aat ccc atc tct gct tta caa gca cgc gcg     1111

Thr Thr Pro Val Asn Asp Asn Pro Ile Ser Ala Leu Gln Ala Arg Ala

              25                      30                      35

aca aca tgc tcg gcc aag gcc acg gat aac ctc atc ttc aag gtc tcc     1159

Thr Thr Cys Ser Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu Ile Phe Lys Val Ser

         40                      45                      50

atg aag acc ttc cag aag gcg cgc aag gcc aag aac ccc tcc aag tgc     1207

Met Lys Thr Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ala Lys Asn Pro Ser Lys Cys

    55                      60                      65

aac tgg tca tcg gac aac tgc tcc aag tca ccc gat aag ccc gat gga    1255

Asn Trp Ser Ser Asp Asn Cys Ser Lys Ser Pro Asp Lys Pro Asp Gly

70                     75                      80                      85

tac aac ttc atc ccc agc tgc caa aga cac gat ttc ggc tac cgg aac    1303

Tyr Asn Phe Ile Pro Ser Cys Gln Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn

                    90                     95                     100

acg aag aag cag aag cgc ttc aca aag gcc atg aag aag cgc att gac    1351

Thr Lys Lys Gln Lys Arg Phe Thr Lys Ala Met Lys Lys Arg Ile Asp

              105                      110                      115

gac aac ttc aag aag gat ctc tac aag tac tgc agc caa ttc tcg ggc    1399

Asp Asn Phe Lys Lys Asp Leu Tyr Lys Tyr Cys Ser Gln Phe Ser Gly

        120                     125                     130

tgg agc tca tgg aag gga gtg gag tgc cgt cgc ctt gcg gat gtc tac    1447

Trp Ser Ser Trp Lys Gly Val Glu Cys Arg Arg Leu Ala Asp Val Tyr

    135                     140                     145

tat act gct gtc cgc cac ttt ggc aag cgt gat gaa gcg ctt gag ttt    1495

Tyr Thr Ala Val Arg His Phe Gly Lys Arg Asp Glu Ala Leu Glu Phe

150                     155                     160                     165

gac cct gag gtt gag ttc gag aag cgt gat gag gtg gcc gat gtc cag    1543

Asp Pro Glu Val Glu Phe Glu Lys Arg Asp Glu Val Ala Asp Val Gln

                   170                   175                     180

cct gac gaa ttt gat aac ttt gac ggt tct gaa gtt gac cct gat atc    1591

Pro Asp Glu Phe Asp Asn Phe Asp Gly Ser Glu Val Asp Pro Asp Ile

             185                    190                     195

gag ggc cag gtc att ccc gaa gtt ctt gaa gat gat gga gtg gat gtg    1639

Glu Gly Gln Val Ile Pro Glu Val Leu Glu Asp Asp Gly Val Asp Val

         200                     205                     210

gag aac ctc gac gat att gaa aac ctg taggttttcg gcattggctc          1686

Glu Asn Leu Asp Asp Ile Glu Asn Leu

    215                     220

tacactttgc aaatgggtcg tcataatcca ttggaagccg gaggaggagg gaaatcaagg  1746

catcttttgg ttgtcagtaa ctttgagtgc ctagtttgtg aattgttttt tgaggttcta  1806

tttgaattct gcttttgttc aatcttatag cttcctacgt tgttgtcatt taaaaatgga    1866

caggagtatc tgtgagattt ttgacttgaa atcagtagca gtcaaccaat aaaagaatag    1926

caaatgcttc taccaatctt tggatctagt acataagtag aca                      1969

<210>6

<211>1893

<212>DNA

<213>米曲霉菌

<220>

<221>外显子

<222>(1001)..(1350)

<223>

<220>

<221>外显子

<222>(1461)..(1590)

<223>

<400>6

atttatgcgc gatttatatg ctgtatcagg cgcccggatg gctttggcag tagccgacgg    60

cagacgacgg tgaatggaat gcaaggaaga gggggattta gcactcactc ttcacaaagt    120

tcaccacgac gctcaagagc cggcgcaaat gatcgcaggt gcggcttggg atgagcgaat    180

gctgaaacac tcctcagaca cggggtcgaa cgagaggggg gattgaggag atggtatcca    240

ggatggagtg gtggaggaag aagaggtgaa agtcggaagt aatttataaa ggctgcgatt    300

ccgcgcgatt cccattactc cacgccaagc ctagattgcc tctttcggaa tggtctccta    360

tcgacctcta agcaaaaacg gtaagaaatg gcagaatctc tgcctgcccc cgagctgttt    420

ctccggttcc gatctatgtt ctacatctat acatcaagca gacctcacca atatcctcaa    480

agggaagcag tgcctattat gctctattct ctaatgatta tctggcatta gccttgttga    540

ttggaatgct ccgccaatgg accagactaa agagtatgac tcaggctaaa agtcttcgct    600

acaatccaag gcttgctgga atcagtcgcg tttgtggtca agctggtaat ccaatggact    660

ggagcatgta atatttgggt cagcggggtg tgggggatta agcgggctac actagggcat    720

gtcatcactg cgatgcgttg acgtctacgc caggcaagaa agactgagat cattttcaca    780

taggtagcat ctgaccacaa atagaaagag cattaggctc tctctctctc tctctctctc    840

tctctctctc tctctctatg ttccagttcc acaagctctt atcagtatat cgtatacggc    900

tctcatacgt ctatatatca ttcttggggt gctacaagct tctatcttct atttgtgctt    960

gacaagccaa cccccaactc tctataaccc ctataacgca atg aag gct aac agc     1015

                                            Met Lys Ala Asn Ser

                                            1                 5

ttt ctc att gcc ctc ctc cca acc gcc cta gcc atc ccc ctc ccc aca     1063

Phe Leu Ile Ala Leu Leu Pro Thr Ala Leu Ala Ile Pro Leu Pro Thr

                  10                      15                      20

cca aat gaa ggc gct aca agc ctc tca gaa agc cag cgc ctc cag tct     1111

Pro Asn Glu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Glu Ser Gln Arg Leu Gln Ser

             25                      30                      35

atc acc gac gag ctt atg ttc ggc ctc gag ctg ccc gac ttc aca gct     1159

Ile Thr Asp Glu Leu Met Phe Gly Leu Glu Leu Pro Asp Phe Thr Ala

          40                     45                    50

cgc aga gag gca aac gac cct cct cag tta gac tgg tac tct gat ggc     1207

Arg Arg Glu Ala Asn Asp Pro Pro Gln Leu Asp Trp Tyr Ser Asp Gly

    55                      60                     65

tgc aca agg gct ccg agt aac cct ctc gga ttc ccc ttt caa agg gcg     1255

Cys Thr Arg Ala Pro Ser Asn Pro Leu Gly Phe Pro Phe Gln Arg Ala

70                      75                     80                      85

tgt gaa cgc cat gac ttc ggt tac cag aac tac cga ata caa ggg cgc     1303

Cys Glu Arg His Asp Phe Gly Tyr Gln Asn Tyr Arg Ile Gln Gly Arg

                  90                      95                     100

ttc acc aag gcc gca aaa gcg cag ata gat ctt aga ttc aaa gaa ga      1350

Phe Thr Lys Ala Ala Lys Ala Gln Ile Asp Leu Arg Phe Lys Glu Asp

              105                     110                     115

gtatgatttc cctttcgttc cttccttctc ccctggaatc tgcttctgtt gattcttatg   1410

gcagttggat attgagagtc tggaggactg acgtttgatt cactgtttag t ctt tac     1467

                                                         Leu Tyr

tat caa tgt gaa tta gga cgc gct gtc gga att tgc aag aag ttg gct      1515

Tyr Gln Cys Glu Leu Gly Arg Ala Val Gly Ile Cys Lys Lys Leu Ala

120                    125                     130                     135

cgg ttg tac tac cgt gct tcg ggg cgg cat ggt ggt aaa gat gca gcg      1563

Arg Leu Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly Arg His Gly Gly Lys Asp Ala Ala

                   140                     145                     150

aag aga agg gag ttg gat gaa ctt ctt taggtatagg tgcaaaagac            1610

Lys Arg Arg Glu Leu Asp Glu Leu Leu

              155                     160

gcccagtaaa ggggagtcac cacctttgtt aataacatga tacatatatg agaccttgag    1670

tggcaacgga ccacgaagtc tgacctgcat tataagacac aatcttaccc tgaacaacaa    1730

cagatagatt cagagatttt gcataacatg ttgacggatt aaatgtacta ctgtccaggg    1790

ttgtatctat cacaagctag cataaccatc tgaatattgt tgtccagatc acccagatga    1850

ggtacttatt cttccacgta acacttcttg cgtatggatt tca                      1893

<210>7

<211>482

<212>DNA

<213>米曲霉菌

<400>7

atgaaggcta acagctttct cattgccctc ctcccaaccg ccctagccat ccccctcccc    60

acaccaaatg aaggcgctac aagcctctca gaaagccagc gcctccagtc tatcaccgac    120

gagcttatgt tcggcctcga gctgcccgac ttcacagctc gcagagaggc aaacgaccct    180

cctcagttag actggtactc tgatggctgc acaagggctc cgagtaaccc tctcggattc    240

ccctttcaaa gggcgtgtga acgccatgac ttcggttacc agaactaccg aatacaaggg    300

cgcttcacca aggccgcaaa agcgcagata gatcttagat tcaaagaaga ctttactatc    360

aatgtgaatt aggacgcgct gtcggaattt gcaagaagtt ggctcggttg tactaccgtg    420

cttcggggcg gcatggtggt aaagatgcag cgaagagaag ggagttggat gaacttcttt    480

ag

482

<210>8

<211>1782

<212>DNA

<213>米曲霉菌

<400>8

atttatgcgc gatttatatg ctgtatcagg cgcccggatg gctttggcag tagccgacgg    60

cagacgacgg tgaatggaat gcaaggaaga gggggattta gcactcactc ttcacaaagt    120

tcaccacgac gctcaagagc cggcgcaaat gatcgcaggt gcggcttggg atgagcgaat    180

gctgaaacac tcctcagaca cggggtcgaa cgagaggggg gattgaggag atggtatcca    240

ggatggagtg gtggaggaag aagaggtgaa agtcggaagt aatttataaa ggctgcgatt    300

ccgcgcgatt cccattactc cacgccaagc ctagattgcc tctttcggaa tggtctccta    360

tcgacctcta agcaaaaacg gtaagaaatg gcagaatctc tgcctgcccc cgagctgttt    420

ctccggttcc gatctatgtt ctacatctat acatcaagca gacctcacca atatcctcaa    480

agggaagcag tgcctattat gctctattct ctaatgatta tctggcatta gccttgttga    540

ttggaatgct ccgccaatgg accagactaa agagtatgac tcaggctaaa agtcttcgct    600

acaatccaag gcttgctgga atcagtcgcg tttgtggtca agctggtaat ccaatggact    660

ggagcatgta atatttgggt cagcggggtg tgggggatta agcgggctac actagggcat    720

gtcatcactg cgatgcgttg acgtctacgc caggcaagaa agactgagat cattttcaca    780

taggtagcat ctgaccacaa atagaaagag cattaggctc tctctctctc tctctctctc    840

tctctctctc tctctctatg ttccagttcc acaagctctt atcagtatat cgtatacggc    900

tctcatacgt ctatatatca ttcttggggt gctacaagct tctatcttct atttgtgctt    960

gacaagccaa cccccaactc tctataaccc ctataacgca atgaaggcta acagctttct    1020

cattgccctc ctcccaaccg ccctagccat ccccctcccc acaccaaatg aaggcgctac    1080

aagcctctca gaaagccagc gcctccagtc tatcaccgac gagcttatgt tcggcctcga    1140

gctgcccgac ttcacagctc gcagagaggc aaacgaccct cctcagttag actggtactc    1200

tgatggctgc acaagggctc cgagtaaccc tctcggattc ccctttcaaa gggcgtgtga    1260

acgccatgac ttcggttacc agaactaccg aatacaaggg cgcttcacca aggccgcaaa    1320

agcgcagata gatcttagat tcaaagaaga ctttactatc aatgtgaatt aggacgcgct    1380

gtcggaattt gcaagaagtt ggctcggttg tactaccgtg cttcggggcg gcatggtggt    1440

aaagatgcag cgaagagaag ggagttggat gaacttcttt aggtataggt gcaaaagacg    1500

cccagtaaag gggagtcacc acctttgtta ataacatgat acatatatga gaccttgagt    1560

ggcaacggac cacgaagtct gacctgcatt ataagacaca atcttaccct gaacaacaac    1620

agatagattc agagattttg cataacatgt tgacggatta aatgtactac tgtccagggt    1680

tgtatctatc acaagctagc ataaccatct gaatattgtt gtccagatca cccagatgag    1740

gtacttattc ttccacgtaa cacttcttgc gtatggattt ca                       1782

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>9

cacggaattc atgaagaaca tcttcgttgc                                     30

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>10

cagcgaattc ctacaggttt tcaatatcgt                             30

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>11

cacggaattc atgaaggcta acagctttct                             30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

cagcgaattc tcaacagaag cagattccag                             30

Claims (8)

1.磷脂酶A₂，其含有下述(a)或(b)蛋白质：

(a)具有序列号1表示的氨基酸序列的蛋白质；

(b)具有改变了序列号1表示的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列、具有磷脂酶A₂功能的蛋白质。

2.磷脂酶A₂，其含有下述(c)或(d)蛋白质：

(c)具有序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质；

(d)具有改变了序列号2表示的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列、具有磷脂酶A₂功能的蛋白质。

3.下述(A)或(B)DNA：

(A)对权利要求1所述的磷脂酶A₂进行编码的DNA，

(B)在严格条件下与(A)DNA进行杂交，其编码的蛋白质具有磷脂酶A₂功能的DNA。

4.下述(C)或(D)DNA：

(C)对权利要求2所述的磷脂酶A₂进行编码的DNA；

(D)在严格条件下与(C)DNA进行杂交，其编码的蛋白质具有磷脂酶A₂功能的DNA。

5.一种DNA，其含有下述(i)～(vi)中任一项的序列：

(i)序列号3表示的碱基序列；

(ii)序列号4表示的碱基序列；

(iii)序列号5表示的碱基序列；

(iv)序列号6表示的碱基序列；

(v)序列号7表示的碱基序列；

(vi)序列号8表示的碱基序列。

6.一种载体，其携带有权利要求3～5中任一项所述的DNA。

7.一种丝状菌，其从外部导入了权利要求3～5中任一项所述的DNA。

8.磷脂酶A₂的生产方法，其包括下述步骤(1)和步骤(2)：

(1)在能够产生上述DNA编码的蛋白质的条件下，培养权利要求7所述的丝状菌的步骤；

(2)回收产生的蛋白质的步骤。

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