JP2005528881A - Peg−修飾ウリカーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたウリカーゼおよび上昇した循環尿酸レベルを特徴する多数の様々な病気を処置する方法を対象とする。
尿酸は鳥、爬虫類およびヒトを含む霊長類のプリン代謝産物である。尿酸はキサンチンおよびヒポキサンチンの酸化により肝臓で生成される。キサンチンはグアニンヌクレオチドの異化作用における中間体であり、一方ヒポキサンチンはアデニンヌクレオチドの分解中に生成される。ほとんどの動物では、尿酸は酵素である尿酸オキシダーゼによりさらにアラントインに酸化される。アラントインはその失ったピリミジン環により、尿酸より20倍高い水溶性を示す。
Wu et al.,J.Mol.Evol.34:78−84,1992 Wu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:742−6,1994 Kelley,W.N.,and Wortman,R.L.リウマチ学のテキストブック(Textbook of Rheumatology)、第5版、第1313〜1351、1997 Kalemkerian,G.P.,Darwish,B.,and Varterasian,M.L.Am J.Med.103,363−367,1997 Lorigan,P.C.,Woodings,P.L.,Morgensterm,G.R.,and Scarffe,J.H.Ann Oncol.7,631−636,1996 Hande,K.R.,and Garrow,G.C.Am.J.Med.94,133−139,1993 Lauter,CB,Bailey,EJ,Lerner,AM.J Infect.Dis 1976:134,75−79 London,M.,and Hudson,P.B.Science,125,937−938,1957 Oberling,F.and Lang,J.M.Nouvelle Press Med 3,2026,1974 Robert,A.,and Corberand,J.and Regnier,C.Rev.Med.Toulouse 12,1093−1100,1976 Masera,G.et al.,J.Pediatrics 100,152−155,1982 Jankovic,M.,et al.,Am.J.Pediatr.Hematol.Onocol.7,202−204,1985 Masera,G.and Jankovic,M.Ann.Oncol.8,407,1996 Jones,D.P.Mahmoud,H.and Chesney,R.W.Pediatr.Nephrol.9,206−212,1995 Pui,C.−H.,et al.,Leukemia,11,1813−1816,1997 WOLOSHUK et al.Applied Environ.Microbiol.,55,86−90,1989) Park et al.,Anticancer Res.,1:373−6(1981) Chen,R.H.−L.,et al.Biochim,Biophys.Acta 660,293−298,1981 Nishimara,H.,Matsushima,A.and Inada,Y.Enzyme,26,49−53,1981 Savoca,K.V.,Davis,F.F.and Palczuk,N.C.Int.Archs.Allery Appl.Immun.75,58−67,1984 Tsuji,J.−I.,et al.Int.J.Immunopharmac.7,725−730,1985 Davis,S.,Park,Y.K.,Abuchowski,A.and Davis,F.F.Lancet 2,281−283,1981 Chua,C.C.,et al.Ann.Intern.Med.109,114−117,1988
本発明は今日使用されせているウリカーゼ組成物の欠点を克服するウリカーゼの製剤を提供する、上記に確認した必要性に取り組む。
発明の詳細な記述
概説
ウリカーゼは多くの微生物に見いだすことができ、そしてヒトにおける多くの疾患および障害の処置に有用である。しかしウリカーゼは抗原性であり、そして患者の循環系から急速に排除される。これらの問題はウリカーゼをポリエチレングリコール(PEG)で共有的に修飾することにより克服することができる。
定義
本開示を通して、以下の略号を使用することができる:PEG、ポリエチレングリコール;SS、スクシンイミジルスクシネート;SSA、スクシンイミジルスクシンアミド;SPA、スクシンイミジルプロピオネート;そしてNHS、N−ヒドロキシ−スクシンイミド。
ウリカーゼ
本発明では、ウリカーゼ遺伝子は例えば微生物から、または組換え生物工学を介して、あるいはそれらの任意の組み合わせの任意の供給源に由来するか、クローン化するかまたは生産され得る。例えばウリカーゼは限定するわけではないがアスペルギルス フラバス(Aspergillus flavus)、カンジダ ウチリス(Candida utilis)およびアースロバクター プロトホルミエ(Arthrobacter protoformiae)を含む微生物からクローン化することができる。幾つかの態様では、本発明で使用するウリカーゼは添付する配列表に説明するアミノ酸配列を有することができる。
ポリエチレングリコール
分子量および連結基が異なる多くのポリエチレングリコールが入手可能である。これらのPEGはタンパク質の抗原性、免疫原性および循環半減期に変動する効果を有することができる(Zalipsky,S.and Lee,C.ポリエチレングリコールの化学:生物工学的および生物医学的応用(Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications)、第347〜370頁、プレナム出版、ニューヨーク、1992;Monfardini,C.et al.bioconjugate Chem.6,62〜69,1995;Delgado C;Francis GE;Fisher D.PEG−連結タンパク質の用途および特性(The uses and properties of PEG−linked proteins)、Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Sys.,9;249−304,1992)。
ペグ化(Pegylation)
ウリカーゼは、例えばPark et al,Anticancer Res.,1:373−376(1981);およびZaplipsky and Lee,ポリエチレングリコールの化学:生物工学的および生物医学的応用(Polethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications)、J.M.Harris編集、プレナム出版、ニューヨーク、第21章(1992)(これらの開示は全部、引用により本明細書に編入する)に記載するように当該技術分野で既知の方法を使用して、生物学的適合性の連結基を介してPEGに共有的に結合することができる。
ウリカーゼ−PEG
PEGをウリカーゼに結合すると、ウリカーゼの循環半減期が上昇する。
処置法
幾つかの態様では、本発明は連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合したウリカーゼを含んでなる治療に有効な量の化合物を患者に投与することを含んでなる患者の尿酸レベルを減少する方法を提供し、ここでポリエチレングリコールは約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有する。好適な態様ではウリカーゼは約20,000の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
実施例1
ゲノムDNAはC.ウチリス(utilis)(ATCC9950)から単離し、そしてウリカーゼ遺伝子を単離するためにPCRで鋳型として使用した。C.ウチリス(utilis)は30℃x250rpmのインキューベーターシェーカー中で100mL YPD培地で成長させた。翌日、50mLのカルチャーからの細胞は室温で1500xgにて10分間、遠心することによリペレット化した。ペレットを15mlのSCEDバッファィー、pH7.5(1M ソルビトール、10mM クエン酸ナトリウム、pH7.5、10mM EDTA、10mM DTT)に再懸濁した。3mgのLyticase(商標)(シグマ(Sigma)、セントルイス、モンタナ州、カタログ番号L−4025)を細胞に加え、そして細胞を37℃で60分間、インキューベーションした。15mlの1%SDSを加え、ゆるやかに混合し、そして5分間、氷上に静置した。6mlの5M 酢酸カリウム、pH8.9を加え、そしてゆるやかに混合した。この溶液は4℃で10,000xgにて10分間遠心した。上清を清浄な遠心管に移し、2容量のエタノールを加え、そして室温で15分間、インキューベーションした。DNAは4℃で20分間、10,000xgにて遠心することによりペレット化した。ペレットを10mlのTEバッフィー、pH7.4(10mM Tris−HCl、pH7.4、1mM EDTA)に再懸濁した。溶液を等容量のフェノール:クロロホルム(1:1 容量/容量)でゆるやかに抽出し、続いて等容量のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)で抽出した。1/2の容量の7.5M酢酸アンモニウム、pH7.5および2容量のエタノールを加え、そして試験管を−70℃に10分間置いた。DNAは4℃で10,000xgにて10分間遠心してペレット化した。このペレットを風乾し、そして50μgのRNaseAを含有する1mlのTEバッファー、pH7.5に再懸濁した。DNAは室温で1時間インキューベーションし、そして次いで等容量のエタノールで再度、沈殿させた。DNAは4℃で10,000xgにて10分間遠心してペレット化した。このペレットを1mlのTEバッファー、pH7.5に再懸濁した。DNAの濃度は260nmでの光学密度を測定することにより決定した。
フォワードプライマー、URIUforSna:5’−GTGTACGTAATGTCAACAACGCTCTCATCA−3’(配列番号1)
リバースプライマー、URIUrevH:5’−AGAAAGCTTTTACCACTTGGTCTTCTCCTTA−3’(配列番号2)
発現用のpQE70(キアジェン(Qiagen)、バレンシア、カリフォルニア州)にサブクローン化するために、これらのプライマーはSnaBI部位をコード配列の5’末端に、そしてHindIII部位を3’末端に配置した。PCR混合物は1X Ventポリメラーゼバッファー、2.5mM硫酸マグネシウム、0.2mMの各dNTP、30pmolの各プライマー、1.8μgのC.ウチリス(utilis)のゲノムDNAおよび2.5UのVentポリメラーゼ(ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)、ビバリー、マサチューセッツ州)を50μlの最終反応容量に含んだ。PCRは98℃で2分間、次に30サイクルの98℃で30秒、55℃で30秒そして72℃で60秒を行った。1単位のTaqポリメラーゼ(ギブコ(Gibco)、ロックビル、メリーランド州)を加え、そして反応物を72℃で7分間インキューベーションした。20mlのPCRを0.8%アガロースゲルで泳動した。PCR産物はゲルから切り出し、そしてQiagenゲル抽出キットを使用して抽出した。PCR産物をpCR2.1(インビトロゲン(Invitrogen)、カールスバッド、カリフォルニア州)にサブクローン化した。ウリカーゼPCR産物はpCR2.1からSnaBIおよびHindIIIを使用して切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。pQE70はSphIを用いて37℃で1時間消化し、室温で15分間クレノーフラグメントで処理して平滑末端を作成し、そして次いで80℃で15分間インキューベーションしてクレノー酵素を不活性化した。次いで処理したプラスミドは37℃にて1時間、HindIIIで消化し、アガロースゲルで泳動し、そして次いでゲルから精製した。次いでウリカーゼフラグメントを消化したpQE70に連結してpQE−URICを作成した。大腸菌(E.coli)DG101(ATCC47041)をライゲーション反応により形質転換させ、そして形質転換体をアンピシリンの存在下で選択した。形質転換体は細胞を3mLのLB(100mg/mLのアンピシリンを含む)でOD600の値が0.5〜0.6に達するまで成長させることにより、ウリカーゼの生産についてスクリーニングした。イソプロピル−b−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を1mMの最終濃度で加え、そしてカルチャーをさらに2時間インキューベーションした。次いで細胞抽出物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、そしてゲルを34,000Daのタンパク質の存在について調査した。34,000Daのタンパク質を生産することが分かった1つの形質転換体を試験し、そしてウリカーゼ活性を有することが分かった。pQE−URICをこの形質転換体から単離し、そしてテトラサイクリン耐性に関する遺伝子をプラスミドに挿入した。テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子のpQE−URICへの挿入には、pBR322をEcoRIおよびAvaIで消化し、そして次にクレノーポリメラーゼおよびdNTPで処理して消化したDNAフラグメントに平滑末端を作成した。pQE−URICをXbaIで消化し、そしてクレノーポリメラーゼおよびdNTPで処理した。テトラサイクリン耐性遺伝子を含むpBR322から〜1400bpフラグメントをゲル精製し、そしてpQE−URICに連結してpPHX12を作成した。pPHX12中に見いだされたpPHX12(配列番号3)の配列、ウリカーゼコード配列(配列番号4)、およびその翻訳されたアミノ酸配列(配列番号5)およびpPHX12に見いだされたコード配列から推定されるウリカーゼのアミノ酸配列(配列番号6)は、添付する配列表に説明し、これは引用により本明細書に編入する。大腸菌(E.coli)DG101はpPHX12で形質転換させて、ウリカーゼの生産および精製のために使用する大腸菌(E.coli)PHX12株を生成した。
実施例2
ウリカーゼを生産するために、PHX12を20リットルの発酵で成長させた。大腸菌(E.coli)の非−限定培地(non−defined medium)#1はPHX12をBioflo IVベンチトップ発酵槽(ニューバーンスウィック サイエンティフィク(New Brunswick Scientific)、エジソン、ニュージャージー州)で成長させるために使用した。大腸菌(E.coli)の非−限定培地#1の成分は、基本培地、50%グリセロール、100X塩溶液、100X塩化カルシウム溶液、および1000Xビタミン溶液からなる。これらの成分は以下に記載するように調製する。
基礎培地
1リットルの培地あたり
カザミノ酸 30g
硫酸アンモニウム 3g
リン酸2カリウム 2.5g
920mLの水に溶解し、そしてオートクレーブまたは0.22μmのフィルターを通して濾過滅菌する。
濃縮塩溶液(100X)
硼酸 0.57g
硫酸銅(II)5水和物 0.39g
塩化鉄、40mLの水に100g 2.0ml
塩化マンガン4水和物 4.0g
塩化ナトリウム 5.0g
モリブテン酸ナトリウム2水和物 0.5g
硫酸マグネシウム7水和物 25.0g
硫酸 2.87ml
硫酸亜鉛7水和物 1.0g
1リットルのH2Oに溶解し、そしてオートクレーブまたは0.22μmのフィルターを通して濾過滅菌する。
50(容量/容量)%グリセロール
1000mlのグリセロールおよび1000mlのH2Oを混合し、そしてオートクレーブまたは0.22μmのフィルターを通して濾過する。
ビタミン溶液(1000X)
チアミン塩酸塩 0.26g
100mlのH2Oに溶解し、そして0.22μmのフィルターを通して濾過滅菌する。
カルシウム溶液(100X)
塩化カルシウム2水和物 10g
1リットルのH2Oに溶解し、そしてオートクレーブまたは0.22μmのフィルターを通して濾過滅菌する。
60mlのグリセロール溶液
10mlの濃縮塩溶液
10mlのカルシウム溶液
1mlのビタミン溶液
PHX12接種の調製
−70℃に保管した作業用細胞バンクからPHX12の容器を解凍し、そして内容物は12μg/mLのテトラサイクリンを含む500mLのバッフェル付振盪フラスコ中の250mLの大腸菌(E.coli)の非−限定培地#1に無菌的に移した。テトラサイクリン選択は振盪フラスコレべルでのみ維持した。接種したバッフェル付振盪フラスコは環境的(environmental)インキューベーター中で37℃で250rpmにてインキューベーションした。振盪フラスコカルチャーは13〜16時間成長させた後、20リットルの無菌培地を含有するBioFloIV発酵槽に無菌的に移した。
細胞の成長および回収
大腸菌(E.coli)の非−限定基礎培地#1は発酵槽中でPHX12の成長に使用した。大腸菌(E.coli)の非−限定基礎培地は600gのカザミノ酸、60gの硫酸アンモニウムおよび50gのリン酸2カリウムを2リットルのナノピュア(nanopure)水に溶解することにより調製した。発酵槽に18.4リットルの基礎培地を満たし、50mLのAntifoamBを基礎培地に加え、そして次に121℃で30分間、発酵槽の滅菌サイクルを使用して滅菌した。滅菌後、培地を37℃以下に冷却し、そして200mLの100X塩化カルシウム溶液、200mLの100X濃縮塩溶液、20mLの1000Xビタミン溶液および1200mLの50%グリセロール溶液を発酵槽に無菌的に加えた。
実施例3
20リットルの発酵からの細胞ペーストを、0.4リットルの溶解バッファー(20mM リン酸ナトリウム、pH8.5、1mM EDTA)にPolytron(商標)ホモジナイザーを使用して再懸濁して均一な懸濁液を得た。細胞はミクロ流動化装置に>15,000psiで2回通して破壊(lysed)した。破壊した細胞懸濁液を次いで13,000xgで10分間遠心した。硫酸アンモニウムを上清に加えて30%飽和を達成した。懸濁液を室温で10分間撹拌し、そして次に13,000xgで15分間遠心した。硫酸アンモニウムを上清に加えて64%飽和とし、そして溶液を室温で10分間撹拌し、そして次に13,000xgで15分間遠心した。ペレットを0.4リットルのダイアフィルトレーションバッファー(20mM リン酸ナトリウムバッファー、pH8.5)に再懸濁し、そして50,000MWのカットオフ値のフィルターを使用して5容量のダイアフィルトレーションバッファーに対してダイアフィルトレーションを行った。次いでダイアフィルトレーションを行った溶液は、カラムバッファー(20mM リン酸ナトリウムバッファー、pH8.5)で前以て平衡化したPoros HQ50カラムにのせた。カラムはカラムバッファーで洗浄し、そしてフロースルーを回収した。次いでフロースルー物質をカラムバッファーで平衡化したBioRad HAカラムにのせた。HAカラムは10容量のカラムバッファーで洗浄し、そしてウリカーゼが100%カラムバッファーから100%0.5M リン酸ナトリウム、pH8.5の勾配を流すことにより溶出した。溶出したウリカーゼはカラムバッファーで平衡化したPoros HQカラムに再度通した。ウリカーゼを含むフロースルー画分を集め、そして4℃で保存した。
実施例4
ウリカーゼアッセイ
ウリカーゼ活性はシグマ(セントルイス、モンタナ州)からの尿酸診断キットを使用してアッセイした。酵素の比活性は酵素を尿酸とインキューベーションし、そして過酸化水素の生成を監視することにより決定した。過酸化水素の生成は、ペルオキシダーゼの存在下で4−アミノアンチピリンおよび3,5−ジクロロ−2−ヒドロキシベンゼンスルホネートの反応により測定する。520nmの吸収極大を持つキノエイミン(quinoeimine)色素が形成される。生成した色の強度は形成された過酸化水素の量に直接比例する。形成された過酸化水素の量は既知の量の過酸化水素を含む標準との比較により決定する。酵素の比活性=アッセイで生成されたnmolの過酸化水素/分/mgタンパク質。酵素活性はIU/mLで表す。1IUは1nmolの過酸化水素/分を生成する酵素の量と定義する。
SDS−PAGE
ウリカーゼの発現レベルはSDS−PAGEにより決定した。20リットルの発酵カルチャーに由来するサンプル(1ml)はウリカーゼ発現のIPTG誘導前(誘導前サンプル)、そしてIPTGの添加から2時間後(誘導後サンプル)に取った。これらのサンプルはマイクロ遠心(12,000xg、1分間)で素早く遠心し、次いで−70℃に凍結した。凍結した細胞ペレットを1mlの水に再懸濁し、そして15秒間、プローブソニケーターで超音波処理した。生成した超音波処理物を10〜20%SDS−PAGEゲルで還元条件下にて電気泳動した。ゲルはクーマシーブルーを使用して染色した。
実施例5
PEG−5,000を用いたウリカーゼのペグ化
カラムバッファー中の精製したウリカーゼ(20mM リン酸ナトリウムバッファー、pH8.5)は、メトキシ−SS−ポリエチレングリコール MW5,000を用いて、30:1(重量/重量)のPEG対ウリカーゼ比でペグ化した。PEG5000をウリカーゼ溶液に加え、そして室温で1時間撹拌した。結合したウリカーゼ−PEG5000をダイアフィルトレーションにより約1/10容量に濃縮し、そして10容量の配合バッファー(20mM リン酸ナトリウムバッファー、pH6.8、130mM 塩化ナトリウム)に対してダイアフィルトレーションを行った。
PEG−20,000を用いたウリカーゼのペグ化
カラムバッファー中の精製したウリカーゼ(20mM リン酸ナトリウムバッファー、pH8.5)は、メトキシ−SS−ポリエチレングリコール MW20,000を用いて、30:1(重量/重量)のPEG対ウリカーゼ比でペグ化した。PEG20000をウリカーゼ溶液に加え、そして室温で2時間撹拌した。結合したウリカーゼ−PEG20000をダイアフィルトレーションにより約1/10容量に濃縮し、そして10容量の配合バッファー(20mM リン酸ナトリウムバッファー、pH6.8、130mM 塩化ナトリウム)に対してダイアフィルトレーションを行った。
実施例6
SDS−PAGE
ペグ化ウリカーゼの純度およびペグ化の程度は、SDS−PAGEにより調査した。ペグ化反応からのサンプルを還元条件下で10〜20%SDS−PAGEゲルで電気泳動した。ゲルはクーマシーブルーを使用して染色した。
ウリカーゼアッセイ
ペグ化ウリカーゼの酵素活性は実施例4に記載したウリカーゼアッセイを使用して測定した。酵素の比活性=アッセイで生成されたnmolの過酸化水素/分/mgタンパク質。酵素活性はIU/mLで表す。1IUは1nmolの過酸化水素/分を生成する酵素の量と定義する。
PEG数
トリニトロベンゼンスルホン(TNBS)アッセイ(Habeeb,A.F.S.A.Analyt.Biochem.14,328−336(1996))を使用して、各ウリカーゼタンパク質の1級アミンに共有的に結合したポリエチレングリコール分子の平均数を測定した(PEG数)。TNBSは1級アミン基と反応し、そして色の変化を生じる。ペグ化されたタンパク質をペグ化されなかったタンパク質と比較する。
ペグ化された1級アミンの数=1−(ペグ化タンパク質の傾斜/非ペグ化タンパク質の傾斜)xタンパク質中の1級アミン残基の総数
実施例9
PEG結合ウリカーゼの循環半減期は、マウスにおいて同じ製剤よりも5〜10分間長い循環半減期を有する。過去においてこれが意味したことは、ヒトの用量がほとんどの場合、マウスで使用される1/5〜1/10であるということである。したがってPEG−ウリカーゼの循環半減期はマウスよりもヒトでより一層長く循環するはずである。
Claims (47)
- 連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合したウリカーゼを含んでなる化合物であって、ポリエチレングリコールが約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される上記化合物。
- 上記連結基がスクシンイミド基である請求項1に記載の化合物。
- 上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、N−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項2に記載の化合物。
- 上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネートまたはそれらの組み合わせである、請求項3に記載の化合物。
- 上記ウリカーゼがアスペルギルス フラバス(Aspergillus flavus)、カンジダ ウチリス(Candida utilis)、アースロバクター プロトホルミエ(Arthrobacter protoformiae)およびそれらの組み合わせからなる群から選択される微生物に由来する、請求項1に記載の化合物。
- 上記微生物がアスペルギルス フラバス(Aspergillus flavus)である請求項5に記載の化合物。
- 上記微生物がカンジダ ウチリス(Candida utilis)である請求項5に記載の化合物。
- 上記微生物がアースロバクター プロトホルミエ(Arthrobacter protoformiae)である請求項5に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが約20,000の平均分子量を有する請求項1に記載の化合物。
- 上記ウリカーゼが約10〜約25個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- 上記ウリカーゼが約18〜約22個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- 上記ウリカーゼが約20個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys156以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys167以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys12以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys64以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys262以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys117以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys16、Lys28およびLys72以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167およびLys262以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが1以上のリシン残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項1または13ないし20のいずれか1項に記載の化合物。
- ウリカーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの循環半減期を強化する方法であって、ポリエチレングリコールが約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される上記方法。
- ポリエチレングリコールが約20,000の平均分子量を有する請求項22に記載の方法。
- 上記ウリカーゼが約10〜約25個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項22に記載の方法。
- 上記ウリカーゼが約18〜約22個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項22に記載の方法。
- ウリカーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの抗−尿酸活性を強化する方法であって、ポリエチレングリコールが約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される上記方法。
- ポリエチレングリコールが約20,000の平均分子量を有する請求項26に記載の方法。
- 上記ウリカーゼが約10〜約25個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項26に記載の方法。
- 上記ウリカーゼが約18〜約22個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項26に記載の方法。
- 上記ウリカーゼが約20個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項26に記載の方法。
- 治療に有効な量の請求項1に記載の化合物を患者に投与することを含んでなる、該患者の尿酸レべルを下げる方法。
- 上記患者が低尿酸血症を有する請求項31に記載の方法。
- 上記ポリエチレングリコールが約20,000の平均分子量を有する請求項31に記載の方法。
- 上記連結基がスクシンイミド基である、請求項31に記載の方法。
- 上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、N−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項32に記載の方法。
- 治療に有効な量の請求項1に記載の化合物を患者に投与することを含んでなる、該患者の尿酸関連障害を処置する方法。
- 上記ポリエチレングリコールが約20,000の平均分子量を有する請求項36に記載の方法。
- ポリエチレングリコール分子が配列番号6のLys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167およびLys262以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項36に記載の方法。
- ポリエチレングリコールが約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有する、ポリエチレングリコールにカップリングされたウリカーゼを含んでなる化合物。
- ポリエチレングリコールが約20,000の平均分子量を有する請求項39に記載の化合物。
- 上記ウリカーゼが約10〜約25個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項39に記載の化合物。
- 上記ウリカーゼが約18〜約22個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項39に記載の化合物。
- 上記ウリカーゼが約20個のポリエチレングリコール分子にカップリングしている、請求項39に記載の化合物。
- ポリエチレングリコールが配列番号6のLys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167およびLys262以外の残基でウリカーゼにカップリングしている、請求項39に記載の化合物。
- ウリカーゼをポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの抗−尿酸活性を強化する方法であって、ポリエチレングリコールが約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有する上記方法。
- 上記ウリカーゼが約20個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項45に記載の方法。
- ポリエチレングリコールが約20,000の平均分子量を有する請求項45に記載の方法。
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