CN117603934A - 一种尿酸酶的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及制备尿酸酶变体及新的尿酸酶的纯化方法。具体地，所述尿酸酶变体相对于野生型尿酸酶，活性和稳定性更高；所述纯化方法相对于传统方法，重新构建纯化步骤，通过硫酸铵分级沉淀、透析、层析、二次透析、超滤浓缩和冻干，带来了更好纯化效果。

Description

一种尿酸酶的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种尿酸酶变体以及一种尿酸酶的纯化方法。
背景技术
尿酸是生物体内嘌咛代谢的终极产物，能被尿酸酶降解为尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。尿酸是难溶性物质，只有少量尿酸随着尿液和粪便被排出体外，大部分尿酸仍储存在人体内，正常人体内尿酸生成和排泄速度基本恒定。随着生活水平的提高，人们的生活方式发生了很大的改变，人体摄入嘌呤的含量不断的增加，导致产生的尿酸含量不断增加。然而人体排泄尿酸的量却无法随之增加，因此大量的尿酸堆积在人体内，导致痛风等疾病的发病率不断增加。尿酸酶可以降解尿酸，能有效降低人体内的尿酸浓度。但是尿酸酶在人体内的半衰期比较短，患者需要长时间、定期注射外源尿酸酶，因此尿酸的需求量不断增大。选择利用微生物发酵生产是获得大量尿酸酶的最佳方法，然而用该方法获得的尿酸酶中存在许多杂质，需要纯化后才可用于疾病的治疗。
目前，现有技术中有多种方式对尿酸酶进行纯化，CN201410015218.4中公开了一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法，其通过先对哺乳动物肝脏仅匀质破碎处理，之后用pH8.2的缓冲液进行洗涤，用pH 10.2的缓冲液溶解洗涤沉淀，得尿酸酶初提液；初提液用硫酸铵分级沉淀，复溶缓冲液溶解，复溶液进行阴离子交换层析(阴离子交换层析纯化介质为偶联二乙基(2-羟丙基)氨基乙基或二乙氨基乙基基团的琼脂糖系列离子交换介质)纯化，得尿酸酶粗纯品溶液；将上述尿酸酶粗纯品溶液进行亲和层析纯化，得尿酸酶纯品溶液。该方法用于哺乳动物尿酸酶纯化，仅进行了硫酸铵分级沉淀和亲和层析，酶活损失较大；亲和层析后未进行处理，需要耗能进行冻干，花费时间长。
也有采用多重纯化方式，例如选用聚乙烯亚胺、硫酸铵盐析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、层析脱盐、冷冻干燥的纯化方法。但纯化过程完全忽视了酶液残留的盐对阴离子交换层析和阳离子交换层析的影响,这会导致纯化过程的效果变差。并且同时进行了阴离子交换层析和阳离子交换层析，对纯化效果的提升不大，但是却增加了尿酸酶的损失量。
目前已有多种人源尿酸酶出现，例如，CN201510555258.2公开了一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白，其通过将人与狒狒嵌合尿酸酶实现对痛风的治疗，但其活性仍有改善空间。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出了一种尿酸酶变体以及新的纯化方法，本发明所公开的尿酸酶变体相对于野生型尿酸酶，酶活更高，且稳定性更好；本发明所公开的尿酸酶纯化方法，能够实现更高效率、更优效果的纯化。
在本发明的一个方面，提供了一种尿酸酶变体，所述变体相对于氨基酸序列为SEQID NO.1的野生型尿酸酶具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或100％同一性的氨基酸序列
在一些具体实施方式中，所述尿酸酶变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型尿酸酶至少具有以下一个或多个位置的突变：L181和/或P182。
在一些实施方式中，所述变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型尿酸酶变体，至少有以下一个或多个位置的突变：L181S和/或P182K。
在本发明的一个方面，提供了一种核苷酸，其编码如前所述的尿酸酶变体。
在一些实施方式中，所述核苷酸密码子优化以在原核生物中表达。
在一些实施方式中，所述核苷酸密码子优化以在大肠杆菌中表达。
在本发明的一个方面，提供了一种载体，所述载体包含前述的核苷酸。
在一些实施方式中，所述核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子、诱导性启动子、泛在性启动子、细胞类型特异性启动子或组织特异性启动子。
在本发明的一个方面，提供了一种细胞，其包含前述的尿酸酶变体、核苷酸或载体。
在一些实施方式中，所述的细胞为原核细胞。
在一些实施方式中，所述的细胞为大肠杆菌。
在本发明的一个方面，提供了一种尿酸酶变体的纯化方法，其步骤如下：
(1)硫酸铵分级沉淀
将经过简单过滤处理后含尿酸酶的发酵液置于冰水中，缓慢加入硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵的浓度达到20％-40％；冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液；然后向上清液中缓慢加入硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵的浓度达到70％-90％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用1-100mM、pH5.0-8.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
(2)透析
将步骤(1)所得的酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1-100mM、pH 5.0-8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(3)DEAE纤维素层析
DEAE纤维素层析柱用1-100mM、pH 5.0-8.0的PBS缓冲液平衡后，将步骤(2)所得的酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 5.0-8.0的1-100mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
(4)第二次透析
将步骤(3)所得的酶液酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1-100mM、pH5.0-8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(5)超滤浓缩
对步骤(4)所得的酶液进行膜过滤；
(6)冻干
将步骤(5)所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
在一些具体实施方式中，所述纯化方法步骤如下：
(1)硫酸铵分级沉淀
将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入16.4g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到30％；冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液；然后向上清液中缓慢加入34.8g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到80％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用20mL 10mM、pH 8.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
(2)透析
将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于10mM、pH 8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(3)DEAE纤维素层析
DEAE纤维素层析柱用10mM、pH 8.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 8.0的10mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
(4)第二次透析
将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于10mM、pH 8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(5)超滤浓缩
对步骤(4)所得的酶液进行膜过滤；
(6)冻干
将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
在一些具体实施方式中，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)硫酸铵分级沉淀
将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入22.6g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到20％。冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液。然后向上清液中缓慢加入25.0g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到70％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用20mL 100mM、pH 7.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
(2)透析
将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于100mM、pH7.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(3)DEAE纤维素层析
DEAE纤维素层析柱用100mM、pH 7.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 7.0的100mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
(4)第二次透析
将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于100mM、pH7.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(5)超滤浓缩
对步骤4所得的酶液进行膜过滤；
(6)冻干
将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
在一些具体实施方式中，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)硫酸铵分级沉淀
将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入10.6g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到20％。冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液；然后向上清液中缓慢加入49.7g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到90％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用20mL 1mM、pH 6.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
(2)透析
将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(3)DEAE纤维素层析
DEAE纤维素层析柱用100mM、pH 7.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 6.0的1mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
(4)第二次透析
将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(5)超滤浓缩
对步骤4所得的酶液进行膜过滤；
(6)冻干
将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
在本发明的一个方面，提供了前述的尿酸酶变体在制备药物中的应用。
在一些具体实施方式中，所述药物用于治疗痛风和/或降低尿酸水平。
在本发明的一个方面，提供了一种非治疗性的降低哺乳动物体液或组织中尿酸水平的方法，包括步骤：给施用对象施用前述的尿酸酶变体；和检测所述施用对象的体液或组织中的尿酸水平。
在一些具体实施方式中，所述哺乳动物包括人。
上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
(1)本发明通过突变发掘出一种尿酸酶变体，相对于野生型的尿酸酶，酶活(效价)更高，稳定性更好。
(2)本发明所采用的纯化方法简单高效，相对于现有技术纯化效果更好，能够高效率的纯化尿酸酶。
(3)本发明所制备的尿酸酶能够起到更好的治疗效果，有潜在的应用前景。
具体实施方式
以下实施例仅用于描述本发明，而非限定本发明。除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:APRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
尿酸酶变体
本发明提供的尿酸酶变体相对于野生型尿酸酶，酶活更高，且稳定性更好。
尿酸酶纯化
本发明所公开的尿酸酶纯化方法，能够实现更高效率、更优效果的纯化。
术语定义
除非另有说明，本发明使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了本发明的目的，定义以下术语，以同本技术领域通常理解的含义保持一致。
在本发明中，冠词"一个/一种(a/an)"和"该/所述(the)"用于指一个/一种或超过一个/一种(即至少一个/一种)所述冠词的语法对象。例如，"要素"意指一个/一种要素或超过一个/一种要素。替代(例如"或")的使用应理解为意指替代方案中任一、两者或其任何组合。
在本发明中，术语"和/或"应理解为意指替代方案中任一或两者。
在本发明中，术语“氨基酸”意指二十种常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
在一些实施方式中，被认为是相互保守性置换的氨基酸的所选组
酸性残基 D和E
碱性残基 K、R和H
亲水性不带电荷的残基 S、T、N和Q
脂肪族不帶电荷的残基 G、A、V、L和I
非极性不带电荷的残基 C、M和P
芳香族残基 F、Y和W
在一些实施方式中，被认为是相互保守性置换的氨基酸的所选组：
组1 A、S和T
组2 D和E
组3 N和Q
组4 R和K
组5 1、L和M
组6 F、Y和W
在某些实施方式中，被认为是相互的保守性置换的氨基酸的其他所选组：
在本发明中，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。它是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，可在其中插入另一个DNA区段以实现所插入区段的复制。通常，当与适当的控制元件结合时，载体能够复制。
在某些情况下，载体系统包含单个载体。或者，载体系统包含多个载体。载体可以是病毒载体。载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个自由端、无自由端(例如环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或两者的核酸分子；和本领域已知的其他多核苷酸变体。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术，可以在其中插入其他DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中载体中存在病毒来源的DNA或RNA序列，用于包装成病毒(例如逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)。病毒载体还包括病毒携带的用于转染到宿主细胞中的多核苷酸。
某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在引入宿主细胞中后，将其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本发明中称为“表达载体”。在真核细胞中表达的载体和导致在真核细胞中表达的载体在本文中可称为“真核表达载体”。在重组DNA技术中有用的常见表达载体通常是质粒的形式。重组表达载体可以适合在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体包含一个或多个调控元件，所述调控元件可根据待用于表达的宿主细胞进行选择，所述核酸可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在是指目标核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式(例如，在体外转录/翻译系统中或者当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)连接至调控元件。有利的载体包括慢病毒和腺相关病毒，并且也可选择这些载体的类型以靶向特定类型的细胞。
在本发明中，术语“调控元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如，转录终止信号，例如聚腺苷酸化信号和poly-U序列)。调控元件包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列组成性表达的那些和仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的那些(例如组织特异性调控序列)。组织特异性启动子可引导主要在目标所需组织例如肌肉、神经元、骨骼、皮肤、血液、特定器官(例如肝、胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)中表达。调控元件也可以时间依赖性的方式引导表达，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性的方式引导表达，其也可以是或可以不是组织或细胞类型特异性的。
在本发明中，术语“尿酸”，是含有碳、氮、氧、氢的杂环化合物，其分子式为C5H4N4O3。尿酸在人体内是嘌呤的最终代谢物。
术语“高尿酸血症(Hyperuriceima,HUA)”是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L(7mg/dL)，女性高于360μmol/L(6mg/dL)，即称为高尿酸血症。高尿酸血症是痛风的发病基础，但不足以导致痛风，只有尿酸盐在机体组织中沉积下来造成损害才出现痛风。
术语“无症状高尿酸血症”指患者仅有高尿酸血症而无关节炎、痛风石、尿酸结石等临床症状。
术语“痛风”是一种尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱及(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，属代谢性风湿病范畴。痛风可并发肾脏病变，严重者可出现关节破坏、肾功能损害，常伴发高脂血症、高血压病、糖尿病、动脉硬化及冠心病等。痛风患者经常会在夜晚出现突然性的关节疼痛，关节部位出现严重的疼痛、水肿、红肿和炎症。关节疼痛常发于第一跖骨，也可出现在手部关节、膝盖、肘部等。随后，疼痛感慢慢减轻直至消失，持续几天或几周不等。
术语“尿酸酶”是指可降解尿酸的酶。
术语“动物模型”是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。
实施例
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
下述实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1尿酸酶变体的获得
针对已知的尿酸酶蛋白(CN201510555258.2中的重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白，本实施例中，将其称之为野生型尿酸酶)，通过生物信息学预测可能影响其生物学功能的关键氨基酸位点，并将氨基酸位点进行突变得到了尿酸酶突变体。野生型尿酸酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，通过生物信息学方法对潜在与尿酸酶功能相关的氨基酸位点定点突变。
SEQ ID NO.1：
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMKSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL
SEQ ID NO.2：
ATGGCCCATTATCACAACGACTATAAGAAAAATGATGAAGTGGAGTTTGTGCGCACCGGCTATGGCAAGGACATGGTGAAAGTGCTGCACATTCAGCGCGATGGTAAGTACCACAGCATCAAAGAAGTGGCCACCAGTGTGCAGCTGACCCTGAGCAGCAAAAAGGATTATCTGCACGGCGACAACAGCGATATCATTCCGACCGATACCATTAAAAATACCGTGCATGTTCTGGCCAAATTCAAGGGCATTAAGAGCATCGAGGCCTTTGCCATGAACATCTGCGAACACTTCCTGAGCAGCTTCAACCACGTGATCCGTGCCCAGGTGTATGTGGAGGAAGTGCCGTGGAAACGCTTCGAGAAAAACGGCGTGAAGCATGTTCACGCCTTCATTCACACCCCTACCGGCACCCACTTCTGCGAGGTGGAACAGATGAAAAGCGGCCCGCCGGTTATTCACAGCGGTATCAAAGATTTAAAAGTTCTGAAGACAACCCAGAGCGGCTTTGAAGGCTTCATCAAGGACCAGTTTACCACCCTGCCGGAAGTTAAGGACCGCTGTTTCGCCACCCAGGTTTACTGCAAGTGGCGTTATCACCAGGGTCGCGATGTTGACTTTGAAGCCACCTGGGATACCGTGCGCGACATCGTGCTGAAAAAGTTCGCCGGTCCGTATGACAAGGGTGAGTATAGCCCGAGTGTGCAGAAAACCCTGTACGATATTCAGGTGCTGAGCCTGAGCCGCGTGCCGGAGATTGAAGACATGGAGATCAGCCTGCCGAACATCCATTATTTTAACATCGATATGAGCAAAATGGGCCTGATCAACAAGGAAGAGGTGCTGCTGCCGTTAGATAACCCGTATGGCAAGATCACCGGCACCGTTAAACGCAAACTGAGTAGCCGCCTG
通过PCR方式进行氨基酸定点诱变，具体是通过在野生型尿酸酶核苷酸突变氨基酸密码子位置设置引物，将该密码子变为突变后氨基酸密码子，之后采用Gibsonclone方式将各个PCR片段进行同源重组获得带有突变氨基酸的突变体核苷酸序列，氨基酸具体突变信息如下：
通过上述方式，得到了三个突变体，包括L181S、P182K以及L181S+P182K。
实施例2突变体活性验证
1.野生型尿酸酶及突变体尿酸酶克隆质粒和表达菌的制备
分别化学合成编码L181S突变体(SEQ ID NO.3)、P182K突变体(SEQ ID NO.4)以及L181S+P182K突变体(SEQ ID NO.5)所示的核苷酸序列，将其与线性化pET28a质粒(购自南京诺唯赞)进行连接得到重组质粒，并将该重组质粒转化至大肠杆菌DH5α(购自南京诺唯赞生物)。利用阳性转化子提取pET28a质粒，将pET28a质粒通过热激转化法转化至大肠杆菌BL21，将转化产物转移至LB培养基上，得到转化子大肠杆菌。具体如下：
合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码融合蛋白尿酸酶的基因；使用上游引物和下游引物以合成的基因为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物；将扩增产物与pET28a质粒分别用限制性内切酶NdeⅠ/XhoⅠ(购自NEB公司)酶切，酶切产物胶回收后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α(购自北京擎科生物有限公司)，得到转化产物。
2.将转化产物涂布在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子接种至含有5mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养12h后提取质粒进行酶切验证以及测序后与目的基因比对验证，验证正确即获得重组质粒。取50μL的大肠杆菌BL21感受态，冰浴，加2μL重组质粒，冰浴15min，于42℃热激90s，再冰浴3min，加入600μL的LB，37℃摇床220rpm摇1h。吸取100μL，均匀涂在含有卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱，先正置培养10min，然后将固体平板倒置于37℃培养箱中过夜培养，得到转化子大肠杆菌。转化子大肠杆菌的鉴定：pET28a质粒上的卡那霉素抗性基因作为转化子鉴定标志。
实施例3野生型尿酸酶及突变尿酸酶的表达
1.挑取验证正确的野生型及突变体的转化子单菌落接种至50mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下振荡培养12h，得到培养液；将培养液按照1:50转接于1000mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm的条件下振荡培养4h至OD600＝0.8时，将温度降至16℃，于180rpm继续振荡培养1h，1h后，加入IPTG(终浓度1mM)，于16℃、180rpm的条件下培养12h，获得表达菌。
2.对野生型及突变体尿酸酶粗纯化
挑取验证正确野生型及各个突变体的转化子单菌落接种至50mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下振荡培养12h，得到培养液；将培养液按照1:50转接于1000mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm的条件下振荡培养4h至OD600值为0.8时，将温度降至16℃，于180rpm继续振荡培养1h，1h后，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG(终浓度1mM)，于16℃、180rpm的条件下培养12h，获得表达菌，收集湿菌体后按照1g湿菌体：10mL PBS缓冲液(pH 8.0,50mM)的比例加入PBS缓冲液以悬浮菌体。将菌体悬浮液于4℃低温冰水浴下超声波破碎，超声波破碎条件为：功率250W，3s开，4s关，温度为4℃，有效破碎时间为10min。超声波破碎混合液经15000rpm离心25min后，吸取上清，即获得粗酶液，采用PBS将不同尿酸酶稀释为相同浓度(约为2.5mg/ml)。
3.检测不同尿酸酶治疗效果
选用健康雄性Wistar大鼠(购自集萃药康)35只，10周龄，体重150±10g，随机分为7组，每组5只，空白对照组、模型组、野生型尿酸酶组、L180S组、P182K组、L181S+P182K组、苯溴马隆组。
选用氧嗪酸钾盐作为尿酸酶抑制剂，腹腔注射，抑制肝脏过氧化物酶体中的尿酸酶，升高血尿酸形成高尿酸血症。除了空白对照组，其他组小鼠给予25g/L氧嗪酸钾10ml/kg，1h后灌胃给药，对照组和模型组给予羧甲基纤维素钠乳剂(蒸馏水配制)每次10ml/kg，2次/天；野生型尿酸酶组、L180S组、P182K组、L181S+P182K组分别给予野生型尿酸酶、L180S尿酸酶、P182K尿酸酶、L181S+P182K尿酸酶10mg/kg，2次/天；苯溴马隆组给予苯溴马隆乳悬液5mL/kg，2次/d。灌胃给药后1h大鼠断尾取血，血样置于1.5mL EP管中，37℃温育30min，离心取上清，用生化分析仪采用尿酸酶-EHSPT法测定血尿酸。检测结果如下表所示：
由上表可以看出，由上表可知，通过灌胃野生型尿酸酶、各个突变尿酸酶均能明显起到降低大鼠血尿酸的含量，L180S、P182K、L181S+P182K尿酸酶可以起到很好的降血尿酸作用，尤其是L181S+P182K尿酸酶能起到最好的降低尿酸的作用。
实施例4不同纯化方式技术效果检测
为检测不同纯化方式对尿酸酶的纯化效果，选取实施例2中步骤2得到的L181S+P182K尿酸酶粗酶液作为纯化对象。采用以下纯化方式进行粗酶液纯化：
1.方法一
(1)硫酸铵分级沉淀：将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入16.4g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到30％。冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液。然后向上清液中缓慢加入34.8g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到80％。冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀。再用20mL 10mM、pH 8.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存。
(2)透析：将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于10mM、pH 8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液。
(3)DEAE纤维素层析：DEAE纤维素层析柱用10mM、pH 8.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、pH 8.0的10mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品。
(4)第二次透析：将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于10mM、pH 8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液。
(5)超滤浓缩：对步骤4所得的酶液进行膜过滤。
(6)冻干：将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉2.3g，效价为6351.2U/g。
2.方法二
(1)硫酸铵分级沉淀：将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入22.6g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到20％。冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液。然后向上清液中缓慢加入25.0g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到70％。冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀。再用20mL 100mM、pH 7.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存。
(2)透析：将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于100mM、pH 7.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液。
(3)DEAE纤维素层析：DEAE纤维素层析柱用100mM、pH 7.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 7.0的100mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品。
(4)第二次透析：将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于100mM、pH 7.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液。
(5)超滤浓缩：对步骤4所得的酶液进行膜过滤。
(6)冻干：将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉1.7g，效价为7533.3U/g。
3.方法三
(1)硫酸铵分级沉淀：将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入10.6g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到20％。冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液。然后向上清液中缓慢加入49.7g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到90％。冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀。再用20mL 1mM、pH 6.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存。
(2)透析：将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液。
(3)DEAE纤维素层析：DEAE纤维素层析柱用100mM、pH 7.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 6.0的1mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品。
(4)第二次透析：将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1mM、pH6.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液。
(5)超滤浓缩：对步骤4所得的酶液进行膜过滤。
(6)冻干：将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉2.5g，效价为5217.1U/g。
4.对比一
相对于方法一，去掉硫酸铵分级沉淀步骤(1)，得到尿酸酶酶粉4.4g，效价为3210.8U/g。
5.对比二
相对于方法一，在硫酸铵分级沉淀步骤(1)后、步骤(2)之前，还加入阳离子层析步骤，具体是选用EzFsat Diamond SP Mustang阳离子交换树脂填料，装入层析柱，用平衡液0.02M pH5.5的缓冲液(NaAc-HAc)平衡柱子；将含尿酸酶的样品按2mL/min流速上样，直至过载，上样结束后用平衡液(NaAc-HAc)平衡至电导和紫外吸收值稳定；用含有0.2M NaCl的0.02M pH7.4的PBS洗脱，根据280nm吸收值强弱收集洗脱峰，之后将收集蛋白用于步骤(2)透析，其他步骤与方法一相同，最终得到尿酸酶酶粉2.0g，效价为6030.8U/g。
6.对比三
相对于方法一，将步骤(5)省略，其他步骤相同，冻干时间相对于方法一多花费了6h。
7.对比四
省略方法一的步骤(2)透析步骤，其他步骤相同，最终得到尿酸酶酶粉1.7g，效价为4958.3U/g。
8.对比五
省略方法一的步骤(4)透析步骤，其他步骤相同，最终得到尿酸酶酶粉2.7g，效价为4879.4U/g。
9.相对于方法一，将步骤(3)DEAE纤维素层析省略，其他步骤相同，最终最终得到尿酸酶酶粉3.7g，效价为3774.1U/g。
10.相对于方法一，将步骤(3)DEAE纤维素层析步骤PBS缓冲液替换为pH为9.7的PBS缓冲液，其他步骤相同，最终得到尿酸酶酶粉2.2g，效价为3859.5U/g。
通过上述比较可知，本发明中的纯化方法能够起到较好的技术效果，效价相对于比对方法大幅提高。

Claims (10)

1.一种尿酸酶变体，所述变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型尿酸酶变体，至少有以下一个或多个位置的突变：L181和/或P182。
2.如权利要求1所述的尿酸酶变体，所述变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型尿酸酶变体，至少有以下一个或多个位置的突变：L181S和/或P182K。
3.一种核苷酸，其编码如权利要求1或2所述的尿酸酶变体。
4.一种载体，所述载体包含权利要求3所述的核苷酸。
5.一种细胞，其包含权利要求1-2任一项所述的尿酸酶变体、权利要求3所述的核苷酸或权利要求4所述的载体。
6.一种尿酸酶变体的纯化方法，其步骤如下：
(1)硫酸铵分级沉淀
将经过简单过滤处理后含尿酸酶的发酵液置于冰水中，缓慢加入硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵的浓度达到20％-40％；冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液；然后向上清液中缓慢加入硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵的浓度达到70％-90％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用1-100mM、pH 5.0-8.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
(2)透析
将步骤(1)所得的酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1-100mM、pH 5.0-8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(3)DEAE纤维素层析
DEAE纤维素层析柱用1-100mM、pH 5.0-8.0的PBS缓冲液平衡后，将步骤(2)所得的酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 5.0-8.0的1-100mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
(4)第二次透析
将步骤(3)所得的酶液酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1-100mM、pH 5.0-8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(5)超滤浓缩
对步骤(4)所得的酶液进行膜过滤；
(6)冻干
将步骤(5)所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
7.如权利要求6所述的纯化方法，其步骤如下：
(1)硫酸铵分级沉淀
将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入16.4g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到30％；冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液；然后向上清液中缓慢加入34.8g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到80％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用20mL 10mM、pH 8.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
(2)透析
将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于10mM、pH 8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(3)DEAE纤维素层析
DEAE纤维素层析柱用10mM、pH 8.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 8.0的10mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
(4)第二次透析
将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于10mM、pH 8.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(5)超滤浓缩
对步骤(4)所得的酶液进行膜过滤；
(6)冻干
将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
8.如权利要求6所述的纯化方法，其步骤如下：
(1)硫酸铵分级沉淀
将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入22.6g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到20％。冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液。然后向上清液中缓慢加入25.0g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到70％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用20mL 100mM、pH 7.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
(2)透析
将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于100mM、pH7.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(3)DEAE纤维素层析
DEAE纤维素层析柱用100mM、pH 7.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 7.0的100mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
(4)第二次透析
将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于100mM、pH7.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(5)超滤浓缩
对步骤4所得的酶液进行膜过滤；
(6)冻干
将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
9.如权利要求6所述的纯化方法，其步骤如下：
(1)硫酸铵分级沉淀
将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100mL发酵液置于冰水中，缓慢加入10.6g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到20％。冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液；然后向上清液中缓慢加入49.7g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到90％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用20mL 1mM、pH 6.0的PBS缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
(2)透析
将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(3)DEAE纤维素层析
DEAE纤维素层析柱用100mM、pH 7.0的PBS缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该PBS缓冲液平衡，然后用含0.5M NaCl、PH 6.0的1mM PBS缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
(4)第二次透析
将步骤(3)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1mM、pH 6.0的PBS缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
(5)超滤浓缩
对步骤4所得的酶液进行膜过滤；
(6)冻干
将步骤5所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
10.如权利要求1或2所述的尿酸酶变体在制备药物中的应用。
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