CN104342413A - 一种生产重组狒狒尿酸氧化酶融合蛋白的技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程酶技术领域，提供一种重组尿酸氧化酶与牛乳铁蛋白肽融合蛋白的技术，含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明所述重组狒狒尿酸氧化酶融合蛋白生产技术可以在大肠杆菌中发酵生产胞内可溶性尿酸氧化酶融合蛋白。制得的融合蛋白可在体外快速催化尿酸转化为尿囊素。本发明所述尿酸氧化酶生产技术，操作简便，产物生物活性良好，易于推广，具有广阔的实验检测和临床应用前景。

Description

一种生产重组狒狒尿酸氧化酶融合蛋白的技术

技术领域

本发明基因工程酶技术领域，具体涉及狒狒尿酸氧化酶基因及牛乳铁蛋白肽基因的克隆表达方法，本发明还涉及该两种蛋白组成的融合蛋白的分离纯化方法。 

背景技术

尿酸氧化酶是生物体内嘌呤代谢途径中的一个酶，以氧作为受体,能够催化尿酸氧化生成尿囊素和过氧化氢(Richette等Lancet2010,318-328)。尿酸氧化酶在生物界广泛存在。从古细菌、细菌、真菌、酵母、放线菌、植物、鱼类、两栖动物和大多数非灵长目哺乳动物及少数灵长目动物体内均能找到尿酸氧化酶。但是在人类和高等灵长目动物，由于尿酸氧化酶基因在进化过程中发生无义突变，致使这些物种，如猿类体内没有尿酸氧化酶存在(Wu等,PNAS1989,9412-9416)。由于缺少尿酸氧化酶，嘌呤代谢产生的尿酸不能被进一步氧化而最终以尿酸的形式通过肾脏排出体外，导致人体内尿酸的浓度明显比其他动物高。高浓度的尿酸存会给人体带来许多严重的疾病，如高尿酸血症，痛风，肿瘤溶解综合症等。 

尿酸氧化酶被发现和应用于医疗始于1974年(Fam等,Current rheumatology reports2005,29-35)。当时使用的是从黄曲霉中提取得到的尿酸氧化酶。之后各种来源的尿酸氧化酶陆续被发现并被用于研究。但是由于纯度不高，难于控制，在使用中产生各种各样的副作用。八十年代，随着基因工程技术的兴起，重组表达尿酸氧化酶逐渐成为获取尿酸氧化酶的主要途径。现今已有多个物种的重组尿酸氧化酶表达成功。Suzuki等(Suzuki等,Plant Physiology1990,384-389)于1990年成功地将大豆尿酸氧化酶基因克隆到大肠杆菌表达。1996年，Candida utilis尿酸氧化酶在大肠杆菌中成功表达(Koyama等,J.Biochem.1996,969-973)。Legoux等(Legoux等,JBC1992,8565-8570)通过将黄曲霉尿酸氧化酶基因克隆到大肠杆菌中,发现尿酸氧化酶在细胞内以可溶性表达形式存在。Ishikawa等(Hongoh等，Insect Biochemistry and Molecular Biology2000,173-182)成功地将Nilaparvata lugens尿酸氧化酶基因克隆在大肠杆菌中表达，但是表达量并未提供。 

重组尿酸氧化酶在临床上的应用则始于1995年，Rozenberg等首次利用重组尿酸氧化酶用于心脏移植病人的痛风石治疗(Rozenberg等,Rev.Rhum.Engl.Ed.,1995,62(5),392-394),证明了重组尿酸氧化酶在医疗上的巨大前景。2001年，由Sanofi-Synthélabo公司研发的重组黄曲霉尿酸氧化酶注射剂在欧洲成功上市，并于2003年获准在美国上市，用于高尿酸血症的预防和治疗（肿瘤化疗高尿酸血症的治疗和预防）。 

乳铁蛋白肽(lactoferrcin,Lfcin)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶水解，从N端释放的一段多肽。分子内富含色氨酸。有关研究发现，Lfcin除了不能结合铁离子外，具备乳铁 蛋白的所有生物学活性，如抗菌、抗病毒、抑制癌细胞生长、消炎及参与免疫反应等。由于Lfcin具有普通抗生素所不具有的一系列优点，包括广谱抗菌能力和不易产生耐药性的特点、能抑制病毒、真菌增殖和抑杀肿瘤细胞、对真核生物细胞几乎没有毒性，再加上Lfcin不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全的产品，显示了Lfcin替代抗生素的巨大潜能。因此，关于Lfcin的结构、功能、作用机制及基因工程已成为近年来研究的热点^[25]。 

不同来源的乳铁蛋白在动物消化道中都能释放出Lfcin。不同种类的Lfcin氨基酸长度有所不同，但其序列具有高度同源性，总体来说均包含17-42这段小肽。 

牛乳铁蛋白肽(bovine lactoferrcin,LfcinB)是牛乳铁蛋白在胃蛋白酶水解作用下释放出的一种含25个氨基酸残基的短肽。其分子结构如图1-5所示。其中LfcinB_20-25是LfcinB的活性中心。由于分子内富含大量的碱性氨基酸，其pI值大于12。在pH7时，其分子净电荷数大于7，因而具有较强的阳离子特征，水溶性好，在水溶液中呈现反平行β-折叠结构。LfcinB分子中的第6位和第8位色氨酸对其杀菌活性至关重要。此外，由于分子中有两个半胱氨酸形成二硫键，LfcinB具有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。 

不同动物的Lfcin，例如在人源、鼠源、牛源和羊源的乳铁蛋白肽中，牛乳铁蛋白肽活性是最高的，这也是人们将研究重点移至LfcinB的原因。 

发明内容

本发明通过重叠延伸法获得了狒狒尿酸氧化酶融合蛋白基因的全序列，并对该融合蛋白在大肠杆菌中进行发酵生产。然后利用金属螯合层析分离纯化目的蛋白。经过质谱鉴定和酶活测定后，结果显示融合蛋白成功表达，获得的重组蛋白一级结构与设计的序列一致。酶活力达到8.10U/mg。融合蛋白产率达到84.66%。显示了本发明所采用的技术具有良好的可行性。 

尿酸是一种弱酸，pKa值为5.75。在生理pH7.4条件下，98%的尿酸以尿酸盐的形式存在^[14]。尿酸盐在血液中的溶解度仅为380μmol/L。当人体内尿酸盐浓度超过此值时，尿酸盐将以晶体的形式析出，并随着血液循环而逐渐沉积在人体的关节处，由此而引发一系列相关的疾病，如高尿酸血症、痛风等。 

痛风是一种古老的疾病。早在公元前2640年就有古埃及文献对于痛风的记载。确切的临床记载则见于公元前400年Hippocratc的医学著作中。其病因便是由于尿酸沉积在关节处形成所谓的痛风石而引发的一种急性关节炎。古代关于痛风患者的记载主要见于帝王显贵，因而痛风又有帝王病之称。同时由于其发病时给病人带来巨大的痛苦又被称为疾病之王。现今，痛风的发病率呈逐年上升的趋势，尤其以西方发达国家严重。据有关组织统计，英国痛风的发病率1970年为0.3%，1990年为1%，到2005年，这一比例上升到了1.4%。美国痛风的发病率更高，1990年这一比例为2.1%，到1999年已上升到4.1%。随着经济快速发 展，人们生活水平和饮食习惯的改变，我国痛风的发病率也呈上升趋势，且发病年龄呈现低龄化。目前我国痛风发病率为0.3%，现有400多万痛风患者，每年有200多万急性发作，近100万人因痛风致残。因此痛风已成为严重影响人们身体健康的疾病之一。 

高尿酸血症是指血液中尿酸含量大于420μmol/L(7.0mg/dL)，高尿酸与糖尿病、高血压、肥胖或高胆固醇血症等几乎所有的成人病都有密切的关系，也可能导致肾障碍、动脉硬化、脑中风、心脏病等严重的疾病，因此是非常重大的代谢异常症状。 

目前控制肿瘤高尿酸血症的办法有饮食控制、碱化酸毒症、血透、别嘌呤醇和尿酸氧化酶利尿等手段。但是别嘌呤醇抑制黄嘌呤氧化酶的活性，阻滞了黄嘌呤和次黄嘌呤转化为尿酸，干扰6-巯基嘌呤的代谢，增加了肾脏排泄尿酸前体（次黄嘌呤和黄嘌呤）的负荷，影响肿瘤的治疗。与次黄嘌呤不同，黄嘌呤在尿中比尿酸难溶。有时别嘌呤醇治疗的病人也可出现黄嘌呤肾病和结石。此外，对于病人体内存留的尿酸的排泄，使用别嘌醇治疗无效。对于急性高尿酸血症病人，别嘌呤醇因为起效时间长而使病人不能及时得到治疗。 

对于痛风的治疗，目前主要使用痛风炎症干扰药物和降尿酸化学药，代表性药物有秋水仙碱、非甾体抗炎药、肾上腺皮质激素、尿酸促排药、抑制尿酸生成药。秋水仙碱具有缓解痛风炎症的特异性，通常是小剂量多次口服用药，但该药有严重的胃肠道反应。其它抗炎药也都起到改善症状的作用，但副作用都很大。丙磺舒、苯磺唑酮、痛风利仙是常用的促尿酸排泄药物，别嘌呤醇抑制尿酸的形成，这些药都需要服用较长时间来维持治疗效果，它们的副作用发生率相同，而以别嘌呤醇最严重，常发生别嘌呤过敏综合症，这些患者死亡率达27.5%。 

鉴于化学药物在治疗尿酸引起的相关疾病中的种种副作用，人们开始寻找更好的替代药物。尿酸氧化酶由于其能快速降解尿酸而受到人们的高度关注。通过补充尿酸氧化酶将体内尿酸降解为尿囊素排出体外而降尿酸已成为治疗高尿酸血症及其相关疾病的又一种策略。 

牛乳铁蛋白肽(LfcinB)作为一种小肽，分子量只有2.86kDa，属于小分子活性物质，因而不用考虑其对人体的免疫原性。其次，LfcinB本身分子结构较为简单，由26个氨基酸组成，分子内只有一个二硫键。最近有研究报道二硫键在抗菌过程中作用不大，被破坏后LfcinB的抗菌活性并不减弱^[46]。因而不用考虑保持其二硫键完整性的问题。此外，LfcinB作为活性分子，具有多方面的优良特性，如分子具有两亲性、能耐受蛋白酶或多肽酶的水解、广谱抗细菌真菌、抑制肿瘤细胞等。 

综合考虑上述，本发明选用了牛乳铁蛋白肽(LfcinB)作为目的蛋白的修饰分子。 

在本发明的具体实施方式中，首先通过密码子优化，设计了融合蛋白基因全序列，然后通过重叠延伸的方法，获得全长基因。其次，利用TA克隆技术筛选阳性克隆。阳性克隆在经过酶切后，与目的载体pET32a(+)连接。构建后的表达载体转化表达宿主菌E.coli  Origami DE3.通过优化诱导条件，目的蛋白获得高效可溶性表达。经过细胞破碎，Ni⁺金属螯合纯化得到纯度达93.5%以上的目的蛋白,产量达到116.6mg/L发酵液。经重组肠激酶切后，经过酶活测定，目的蛋白活力达8.10U/mg，融合蛋白收率达到84.66%。 

附图表说明 

图1狒狒尿酸氧化酶融合蛋白基因的克隆。1-2：目的片段(1016bp);L:DNA ladder 

图2融合蛋白基因设计及表达载体的构建。 

图3融合蛋白诱导表达。M：蛋白质分子量标准1：诱导前的全菌液；2：诱导8小时之后的全菌液； 

图4Ni⁺-NTA His-Bind Resins分离纯化rbUOX-LfcinB。1:洗脱峰；M：蛋白质分子量标准 

图5肽段K.LGAPSITCVR.R质谱图 

表1目的蛋白表达量及收率测定。 

表2目的蛋白酶活测定。 

表3目的蛋白MALDI-TOF-MS/MS测定。 

具体实施方式

实施例1狒狒尿酸氧化酶融合蛋白基因的克隆。 

狒狒主要分布于非洲，个别种类也见于阿拉伯半岛，在我国野外没有分布，仅见于相关动物园里，因此其基因样本较难获得。要获得其尿酸氧化酶基因并进行相应的改造只有通过全基因合成的办法。目前全基因合成主要有两种途径：磷酸化补齐和重叠延伸PCR法(splicing by overlap extension,SOE)。SOE因其操作简便快速而成为现今基因全合成的首选，尤其是对于没有基因样本且序列较长的基因克隆。因此本发明采用SOE的方法来获得rbUOX基因全序列。 

狒狒尿酸氧化酶融合蛋白(rbUOX-LfcinB)基因全长为1016bp。先通过SOE获得rbUOX gene43-603和rbUOX gene625-897两个片段。在此基础上再加上其余序列。最后在基因的两端加上酶切位点Bgl II和EcoR I。 

扩增体系： 

扩增条件： 

SOE扩增得的全长基因经过双酶切后，连接到pPCR2.1克隆载体上筛选阳性克隆，经双酶切和测序验证其序列的准确性。具体实施过程为： 

目的基因通过高保真的pfx酶经SOE成功扩增后，仍然会有一些错配，需要通过TA克隆才能获得与目的基因序列完全一致的扩增产物。本实验采用Invitrogen公司的pCR2.1TA克隆载体系统。具体过程为： 

1、PCR目的片段加A尾。 

反应体系： 

反应条件：72℃，20min。 

2、目的片段与T载体连接。 

反应体系： 

反应条件：16℃，过夜。 

3、连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞。 

(1)取2μL连接产物加入到50μL置于冰上融化的JM109感受态细胞中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min。 

(2)42℃水浴90s，之后立即把反应管置于冰中冷却3min。 

(3)加入450μL平衡至室温的S.O.C培养基，37℃,170rpm水平振荡培养1h。 

(4)取适量菌液(20-200μL)涂布于含X-Gal(80μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养。 

4、阳性克隆筛选。 

(1)挑取白色菌落至5mL LB培养基中(含氨苄青霉素100μg/mL)，170rpm过夜培养。 

(2)提取质粒进行双酶切、测序。 

双酶切体系： 

酶切条件：37℃,1h。 

狒狒尿酸氧化酶融合蛋白基因克隆结果见图1。 

实施例2表达载体的构建。 

表达载体的选择与目的基因的表达策略息息相关。尿酸氧化酶分子中不含二硫键和糖基化位点，因而不用考虑翻译后修饰的问题，这使原核表达系统成为首选。大肠杆菌是一个高效的表达系统，目的蛋白常在细胞内形成没有活性的包涵体。因此为了改善目的蛋白的溶解性，本章选用N端带有高溶解性的硫氧还蛋白(Trx)序列的pET32a(+)作为表达载体，以此来增加目的蛋白的可溶性。在插入位点的选择上，为了使成熟的目的蛋白不带有外源蛋白序列，在表达和分离标签与目的蛋白之间加入肠激酶位点。这样融合表达的蛋白可经肠激酶切得到不含外源序列的成熟蛋白质。 

克隆到pPCR2.1载体上的目的基因及pET32a(+)表达载体须先经过相应的限制性内切酶切之后才能连接。酶切体系如下： 

双酶切体系： 

酶切条件：37℃,1h。 

琼脂糖凝胶电泳回收目的片段： 

1、用干净的刀片将目的片段切下，装于1.5mL离心管中。注意不要将非特异扩增条带和过多的凝胶也切下。称重。 

2、加入Binding Buffer II。加入量为每100mg凝胶片段加300μL(1%胶浓度)或500μL(2%胶浓度)。对于小于500bp的片段，另加100μL异丙醇。 

3、50-60℃水浴10min。期间上下晃动离心管以使凝胶片段充分融化。 

4、用移液器将融化的凝胶溶液加入到2mL EZ-Spin Colum，室温静置2min。 

5、10000g×1min，弃去透过液。 

6、加入500μL Wash Solution，10000g×1min，弃去透过液。 

7、重复步骤6一次。 

8、10000g×30s，以去除残留的乙醇。 

9、将EZ-Spin Colum室温静置15min或置于50℃烘箱中5min。 

10、将EZ-Spin Colum置于干净的新离心管中，准确地往EZ-Spin Colum中心加入适量的Elution Buffer，10000g×1min，透过液置于-20℃保存。 

目的基因与pET32a(+)连接 

(1)连接体系： 

(2)连接条件：16℃,过夜。 

重组DNA转化JM109感受态细胞 

(1)取2μL连接产物加入到50μL置于冰上融化的JM109感受态细胞中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min。 

(2)42℃水浴90s，之后立即把反应管置于冰中冷却3min。 

(3)加入450μL平衡至室温的S.O.C培养基，37℃,170rpm水平振荡培养1h。 

(4)取适量菌液(20-200μL)涂布于含X-Gal(80μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养。 

重组质粒提取 

(1)挑取阳性单菌落至5mL LB培养基中，37℃,170rpm过夜培养。 

(2)取1.5mL过夜培养物至离心管中，12000rpm×1min，弃上清。 

(3)加入200μL Solution I，充分悬浮菌体，室温静置2min。 

(4)加入200μL Solution II，上下颠倒4-6次，室温静置1min。 

(5)加入300μL Solution III，上下颠倒4-6次，室温静置5min。 

(6)12000rpm×10min，小心吸取上清至EZ Spin Colum中，室温静置2min。 

(7)8000rpm×2min，弃去透过液。 

(8)加入500μL Wash Solution，10000rpm×1min。 

(9)重复步骤(8)一次。 

(10)10000rpm×2min以去除残留的乙醇。 

(11)将EZ Spin Colum置室温15min或50℃5min。 

(12)将EZ Spin Colum置于新离心管中，加入适量Elute Solution(30-50μL)，10000rpm×2min，收集透过液，置-20℃备用。 

本施例中rbUOX-LfcinB融合蛋白基因设计及载体构建结果见图2。 

实施例3rbUOX-LfcinB在E.coli Origami(DE3)中的诱导表达。 

针对狒狒尿酸氧化酶基因产物的结构特点，本章选用大肠杆菌表达菌株来表达相应的基因。为使狒狒尿酸氧化酶获得高效、可溶性表达，选用E.coli Origami(DE3)作为表达宿主。具体实施方式为： 

重组质粒转化大肠杆菌Origami(DE3)。 

本部分将pET32a(+)-rbUOX转入Origami(DE3)，其具体过程为： 

(1)取50μL感受态细胞至无菌离心管中，冰浴5-15min使感受态细胞融化。 

(2)向融化的感受态中加入适量目的DNA(0.15-2ng)，用枪头轻轻混匀，冰浴30min。 

(3)将离心管置于精确的42℃水浴中热激90s，然后立即将管转移到冰浴中，使细胞冷却3min。该过程切记不可摇动离心管。 

(4)往转化体系中加入450μL S.O.C培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃,170rpm，复苏45min。 

(5)将离心管内容物混匀，取适量菌液(100-200μL)涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板。将平板置于室温30min直至菌液被吸收。倒置平板， 37℃培养12-16h。 

重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 

(1)挑取单菌落接入25mL LB中(含氨苄青霉素100μg/mL)，37℃，170rpm，培养12-16h。 

(2)取0.5mL菌液接入50mL LB中(含氨苄青霉素100μg/mL)，37℃，170rpm，培养2-3h，至OD₆₀₀=0.8-1.0。 

(3)加入500μL0.1M IPTG，37℃，170rpm，培养2-8h。 

(4)取样，留待SDS-PAGE验证诱导表达情况。 

重组蛋白SDS-PAGE分析 

(1)将样品15μL与15μL2×上样缓冲液混匀，沸水浴5min。 

(2)每孔加样30μL，进行电泳。电泳条件：30mA，4h。 

(3)卸下胶板，用固定液固定30min；考马斯亮蓝R-250染色1h；脱色液脱色至蛋白条带清晰可见。 

狒狒尿酸氧化酶融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达情况见图3. 

实施例4Ni⁺-NTA His-Bind Resins分离纯化rbUOX-LfcinB。 

为使目的蛋白获得高效分离，以减少后续免疫原性检测的非特异性干扰，本研究在制订研究方案时，在目的基因的5’端加上了His-tag和五聚Arg-tag(备用)作为分离标签。因此诱导表达的目的蛋白可以通过亲和层析方便的获得高效分离。此外本实例通过二喹啉甲酸(BCA)法对目的蛋白在细胞内的表达水平以及分离纯化效果进行了定量测定。 

本实例的具体实施过程为： 

重组蛋白的分离纯化 

(1)将Ni⁺-NTA His-Bind Resins凝胶填料装入层析柱中，用5倍柱床体积的1×Ni⁺-NTA Bind Buffer冲洗柱子。 

(2)取适量细胞裂解上清，小心加入到凝胶表面。 

(3)待样品液恰好被凝胶完全吸收时，加入1×Ni⁺-NTA His-Bind buffer冲洗柱子直至洗液的A₂₈₀示数稳定5min以上。 

(4)用1×Ni⁺-NTA Wash Buffer冲洗柱子直至洗液的A₂₈₀示数稳定5min以上。 

(5)用1×Ni⁺-NTA Elute Buffer洗脱吸附上的目的蛋白，收集洗脱峰。 

(6)取峰尖样品进行SDS-PAGE以检测目的蛋白分离效果。BCA法测定目的蛋白的纯化收率 

(1)将溶液A与溶液B以50:1比例混合，制成标准工作液。 

(2)准确称量10mg BSA,溶于5mL0.9%NaCl中。然后用0.9%NaCl分 别稀释成浓度为20、50、100、200、500、1000μg/mL的BSA工作液。 

(3)将BSA工作液、细胞裂解上清液、Ni⁺-NTA洗脱液各100μL用2mL标准工作液稀释20倍。 

(4)37℃孵育30min，冷至室温后测定其OD₅₆₂值。 

目的蛋白酶切 

酶切体系： 

酶切条件：20℃，16h。 

目的蛋白与N端标签的分离 

目的蛋白与其N端相关标签的分子量相差较大，因此重组蛋白经过rEK酶切成熟后，可以利用Sephadex G-50凝胶过滤层析将成熟的目的蛋白与N端标签分离，为后续酶活测定消除干扰。分离过程为： 

(1)灌注Sephadex G-50层析柱。 

(2)用5倍柱床体积的硼酸缓冲液(pH8.4)冲洗柱子。 

(3)用长嘴吸管将酶切后的样品液小心加入到凝胶柱表面。 

(4)用硼酸缓冲液(pH8.4)洗脱目的蛋白，在线检测洗脱组分的OD₂₈₀值，收集第一个洗脱峰。 

目的蛋白酶活测定 

(1)取适量尿酸溶于一定体积的硼酸缓冲液(pH8.4)中，浓度120μmol/mL。 

(2)取3mL尿酸溶液于1cm石英比色皿中，加入一定量尿酸酶溶液，置于25℃水浴中准确反应5min。 

(3)以硼酸缓冲液调零，测定反应混合物的OD₂₉₃吸光值的减少量。 

(4)按如下公式计算待测样品的酶活： 

U/mg=(△A×Vt×n×c)/(12.6×Ve) 

其中，U为待测酶液的活力单位数。1个活力单位(U)的定义为25℃时，1min内催化1μmol尿酸转化成尿囊素所需要的酶量。△A为反应液每分钟的吸光度下降值。Vt为反应液体积。n为酶液的稀释倍数。c为待测酶切的浓度。12.6为尿酸在293nm波长下的微摩尔消光系数。Ve为所加酶液的体积。 

本施例的结果见图4和表1，表2。 

实施例5重组狒狒尿酸氧化酶质谱分析。 

MALDI-TOF-MS/MS是利用离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。通常对于一个样品，如果能检测到四个以上的匹配肽段，且被检分子的得分超过系统给出的置信阈值时，就能确认所检样品为目的蛋白。经分离纯化得到的四个目的蛋白经切胶、脱色、酶解后，用MALDI-TOF-MS/MS对其一级结构进行了分析。结果见图5和表3。 

本施例的结果表明经发酵表达纯化所得的重组蛋白具有与设计的序列相同的一级结构。结合施例3和施例4可以得出本发明制得的重组尿酸氧化酶融合蛋白活性较高。本发明所采用的技术简单易行，适宜于大规模放大生产。 

SEQUENCE LIST 

狒狒尿酸氧化酶融合蛋白氨基酸序列： 

Phe₁₇—Lys--Cys--Arg--Arg₂₁--Trp—Gln--Trp--Arg—Met--Lys--Lys--Leu--Gly--Ala₃₁—MetPro--Ser--Ile--Thr--Cys--Val--Arg--Arg--Ala--Phe--Ala₄₂--Gly--Gly--Gly--Gly--Gly—Glu₁₅--Phe--Val--Arg--Thr--Gly--Tyr₂₁--Gly--Lys—Asp--Met--Val--Lys--Val--Leu--His--Ile₃₁--Gln--Arg--Asp--Gly--Lys--Tyr--His--Ser--Ile--Lys₄₁--Glu—Val--Ala---Thr—Ser—Val—Gln--Leu—Thr--Leu₅₁--Ser--Ser--Lys--Lys--Asp--Tyr--Leu--His--Gly--Asp₆₁--Asn--Ser--Asp--Ile—Ile--Pro--Thr--Asp--Thr--Ile₇₁--Lys--Asn--Thr--Val--His--Val--Leu--Ala--Lys--Phe₈₁----Lys--Gly--Ile--Lys—Ser--Ile--Glu--Ala--Phe--Gly₉₁--Val—Asn--Ile—Cys—Glu—Tyr—Phe-Leu—Ser--Ser₁₀₁--Phe--Asn--His--Val--Ile--Arg--Ala--Gln--Val--Tyr₁₁₁--Val--Glu--Glu--Ile---Pro—Trp--Lys--Arg--Leu--Glu₁₂₁—Lys—Asn--Gly—Val—Lys—His—Val--His--Ala--Phe₁₃₁-Ile—His—Thr--Pro—Thr--Gly--Thr—His—Phe--Cys₁₄₁—Glu--Val--Glu--Gln--Leu--Arg----Ser--Gly—Pro--Pro₁₅₁—Val--Ile--His--Ser--Gly--Ile--Lys—Asp--Leu--Lys₁₆₁—Val—Leu----Lys--Thr--Thr--Gln—Ser--Gly—Phe--Glu₁₇₁--Gly—Phe--Ile—Lys—Asp—Gln—Phe—Thr—Thr--Leu₁₈₁--Pro--Glu--Val—Lys--Asp--Arg—Cys—Phe—Ala--Thr₁₉₁--Gln--Val--Tyr-Cys--Lys--Trp--Arg—Tyr--His--Gln₂₀₁—Cys--Arg--Asp--Val--Asp--Phe--Glu--Ala--Thr--Trp₂₁₁-Gly—Thr--Ile—Arg--Asp--Leu--Val--Leu—Glu--Lys₂₂₁--Phe—Ala--Gly--Pro—Tyr--Asp-Lys-Gly--Glu--Tyr₂₃₁—Ser--Pro--Ser--Val—Gln—Lys—Thr--Leu—Tyr--Asp₂₄₁--Ile--Gln--Val---Leu—Ser--Leu--Ser--Arg—Val--Pro₂₅₁--Glu--Ile--Glu--Asp--Met--Glu--Ile—Ser--Leu--Pro₂₆₁-Asn--Ile—His--Tyr--Phe—Asn--Ile—Asp—Met--Ser₂₇₁--Lys—Met--Gly--Leu--Ile--Asn—Lys—Glu—Glu--Val₂₈₁--Leu--Leu—Pro--Leu--Asp--Asn--Pro—Tyr--Gly--Lys₂₉₁--Ile--Thr— Gly--Thr--Val---Lys---Arg---Lys--Leu--Ser₃₀₁

表1 

表2 

表3 

Claims (10)

1.一种生产尿酸氧化酶融合蛋白的技术，其特征在于，是通过基因克隆表达获得。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，包含狒狒尿酸氧化酶和牛乳铁蛋白肽氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是通过重叠延伸法获得其基因全序列。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是利用pET32a(+)作为表达载体。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是在大肠杆菌Origami(DE3)中表达。

7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是在25℃诱导表达。

8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是通过Ni+金属螯合层析纯化得到。

9.权利要求1至8任一项所述的生产技术在制备狒狒尿酸氧化酶融合蛋白中的应用。

10.权利要求1至8任一项所述的融合蛋白在临床诊断，治疗中的应用。